Jedna fľaštička, dva ciele: Prenosná diagnostika tuberkulózy založená na CRISPR so 100 % citlivosťou

V časopise Science Advances bol publikovaný článok o prenosnom teste na tuberkulózu, ktorý sa dá vykonať priamo zo spúta bez zložitého vybavenia. Izotermická amplifikácia DNA a CRISPR čítanie sa kombinujú v jednej skúmavke; dve konzervatívne inzercie M. tuberculosis (IS6110 a IS1081) sa testujú naraz a ľudský gén ako interná kontrola vzorky. V malom „slepom“ teste na klinických vzorkách test poskytol 100 % citlivosť (6/6) a 100 % špecificitu (7/7) v porovnaní s kultúrou; detekčný limit je ~69 – 81 CFU/ml v simulovanom spúte. Výsledok je možné vidieť na papierovom testovacom prúžku a činidlá sú lyofilizované (skladovanie bez „chladiaceho reťazca“).

Pozadie

Podľa WHO zomrie v roku 2023 na tuberkulózu približne 1,25 milióna ľudí; tuberkulóza sa opäť stala hlavnou infekčnou príčinou úmrtí s odhadovaným počtom 10,8 milióna prípadov. Vďaka tomu je dostupná a rýchla diagnostika kľúčová, najmä v prostrediach s obmedzenými zdrojmi.

• Súčasné testy sú kompromisom medzi presnosťou, rýchlosťou a cenou. Kultivácia „zlatého štandardu“ je veľmi presná, ale pomalá; mikroskopia je rýchla, ale necitlivá; PCR platformy ako Xpert MTB/RIF Ultra sú výrazne citlivejšie (LOD ≈ 15,6 CFU/ml), ale vyžadujú drahé vybavenie a kazety, čo obmedzuje pokrytie.
• Prečo izotermická metóda a CRISPR. Izotermická RPA amplifikácia funguje pri teplote 37 – 42 °C a nevyžaduje termocyklery – pohodlné „v teréne“. Čítanie CRISPR (Cas12/13) pridáva druhovú špecifickosť a umožňuje vizuálny laterálny tok („pás“) bez zložitej optiky. Celkovo je to cesta k prenosným a lacným PVR testom.
• Prečo dva ciele MBT naraz (IS6110 + IS1081). IS6110 je viackópiový inzert komplexu M. tuberculosis, ale niektoré línie majú málo kópií a testy na samotný IS6110 môžu „chybovať“. Pridanie druhého inzertu IS1081 znižuje riziko falošne negatívnych výsledkov.
• Prečo interná ľudská kontrola. Vzorky dychu môžu obsahovať inhibítory a „zlé“ vzorky. Endogénna ľudská kontrola (napr. RNáza P/genómová DNA) potvrdzuje, že materiál je adekvátny a reakcia nie je potlačená – inak výsledok nemožno považovať za negatívny.
• Formát s jednou nádobou je sám o sebe dôležitý. Znižuje počet krokov, znižuje riziko kontaminácie a uľahčuje prácu mimo laboratória. Takéto prístupy pre TBC už preukázali životaschopnosť; nová práca rozširuje túto myšlienku na formát s dvoma cieľmi s internými kontrolami a navyše demonštruje lyofilizáciu činidiel a čítačku prúžkov.
• Aká je hodnota tohto článku? Autori preukázali detekciu priamo zo spúta po najjednoduchšej príprave vzorky, detekčný limit ~70–80 CFU/ml v simulovanom spúte a 100 % citlivosť/špecificitu na malej zaslepenej sade klinických vzoriek – čo je dobrá „technologická ukážka“ pre ďalšie multicentrické validácie.

Ako to funguje

• Vedci skombinovali RPA (rýchlu izotermickú amplifikáciu genetického materiálu pri 37 °C) s „rezacími“ enzýmami Cas13a/Cas12a. Po výbere vodiacich RNA nakonfigurovali systém tak, aby súčasne zacielil na dva ciele MBT a paralelne s ľudskou DNA (skontrolovali, či je vo vzorke vôbec materiál a či sa reakcia „nezastavila“).
• Všetka chémia sa ukladá do jednej skúmavky; po inkubácii sa výsledok odčíta buď fluorimetrom, alebo na laterálnom prietokovom prúžku – v podstate ako expresný test.
• Spracovanie spúta sa zjednodušilo na zahrievanie a krátku centrifugáciu – bez extraktorov nukleových kyselín. V najobmedzenejších prípadoch autori dokonca diskutujú o manuálnych alternatívach k centrifugácii.

Čo ukázali testy

• Detekčný limit: 69,0 CFU/ml (kmeň H37Rv) a 80,5 CFU/ml (BCG) v „spike“ spúte. Nebola zistená žiadna skrížená reaktivita s inými baktériami/hubami.
• Klinické prostredie (zaslepené vzorky): na 13 vzorkách z reálnej praxe - 100% senzitivita (6/6) a 100% špecificita (7/7) v porovnaní s očkovaním. Pre porovnanie, na rovnakej súprave GeneXpert Ultra vykazoval 100%/86%.
• Technické nuansy: z dvoch možností čítania fungoval Cas13a lepšie (pre formát „one-pot“ je citlivejší ako Cas12a). Navyše, paralelné testovanie dvoch cieľov Mtb znižuje riziko falošných výsledkov.

Prečo je to potrebné?

Dnešné testy sú kompromisom medzi presnosťou, rýchlosťou a dostupnosťou: kultivácia je veľmi presná, ale pomalá; výtery sú rýchle, ale nepresné; PCR systémy ako GeneXpert sú presné a rýchle, ale vyžadujú drahé prístroje a kazety. Nový prístup CRISPR sa zameriava na prekonanie tejto medzery: terénna diagnostika, ktorá funguje pri teplote 37 °C, s odčítaním papierových prúžkov a možnosťou skladovania činidiel bez chladenia.

Obmedzenia a čo bude ďalej

Ide o skorú demonštráciu na malej klinickej sérii – sú potrebné rozsiahle, multicentrické testy (vrátane koinfekcie HIV, u detí, s paucibacilárnymi formami a rôznymi líniami MBT). Autori samostatne poznamenávajú, že v samotnej „terénnej“ verzii bude potrebné stolovú centrifúgu nahradiť plne manuálnym riešením. Samotná architektúra – „dva ciele + interná kontrola“ v jednej skúmavke – však už preukázala svoju funkčnosť a poskytuje jasnú cestu k zdokonaleniu pre masové použitie.

Zdroj: Alexandra G. Bell a kol. Zjednodušený test založený na CRISPR na detekciu tuberkulózy priamo zo spúta, Science Advances, online 6. augusta 2025 (roč. 11, vydanie 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206