Experimentálna práca na transplantácii alogénnych keratinocytov na umelo vytvorené jazvy bielych potkanov

Túžba využiť bunkový potenciál a potreba nájsť nové účinné metódy na zlepšenie estetického vzhľadu jaziev viedla k myšlienke pokúsiť sa študovať možnosť transplantácie keratinocytov na povrch jaziev.

Aby sa preukázala pravdepodobnosť použitia kultúry keratinocytov na zlepšenie vzhľadu jaziev, bola vykonaná experimentálna štúdia na bielych laboratórnych potkanoch, ktorým boli vytvorené jazvové povrchy. Model jazvy potkana bol získaný v dôsledku hojenia umelo spôsobených rán na chrbte, pozdĺž chrbtice. Potkanom boli vyrezané identické kúsky kože s rozmermi 2x3 cm. 2,5 mesiaca po operácii „modelovania jaziev“ boli potkany podrobené dermabrázii (odstránenie horných vrstiev jazvy pomocou termokaustiky) a boli im transplantované alogénne keratinocyty, izolované z kože mláďat potkanov 2-4 dni po narodení.

Izolácia a kultivácia epidermálnych buniek potkanov sa uskutočnila v laboratóriu bunkových technológií Cytologického ústavu Ruskej akadémie vied s použitím nasledujúcej technológie.

Koža bola umytá v Hankovom fyziologickom roztoku s obsahom 200 U/ml gentamicínu a narezaná na malé kúsky s plochou 0,2-0,5 cm2 ^. Kúsky kože boli inkubované v 0,5% roztoku dispázy vo vyváženom fosfátom pufrovanom roztoku pri teplote 37 °C počas 1 hodiny. Kúsky boli potom prenesené do Dulbeccovho fosfátom pufrovaného fyziologického roztoku a epiderma bola oddelená od dermy. Epiderma bola inkubovaná v 0,125% roztoku trypsínu počas 10-15 minút za miešania pri 50 ot./min., po čom bol účinok enzýmu zastavený pridaním 5% fetálneho bovinného séra. Jedna tretina výslednej bunkovej suspenzie bola použitá v čistej forme na jednu z možností transplantácie na jazvy, druhá tretina bola pestovaná na biokompatibilných domácich filmových povlakoch „Polypor“ a tretia - na Petriho miskách bez substrátu. Operácia dermabrázie výsledných jaziev u potkanov s následnou transplantáciou epidermálnych buniek potkanov na ne bola vykonaná v éterovej anestézii pomocou tepelného kauteru.

V prvej skupine potkanov boli po dermabrázii na vyleštený, fyziologickým roztokom umytý a vysušený povrch jazvy umiestnené sterilné kúsky cambricu, na ktoré bola aplikovaná pretrepaná suspenzia alogénnych epidermocytov potkanov v koncentrácii 1,5 milióna buniek na 1 ml (podľa Ústavu cytológie). Kúsky cambricu boli umiestnené na vyleštenú jazvu tak, aby bunky ležali na povrchu jazvy. Navrch bol umiestnený obväz z niekoľkých vrstiev gázy, ktorý bol prišitý k okrajom jazvy.

Časť získanej bunkovej suspenzie bola nasiata do Petriho misiek na sterilné filmy Polypore vyrezané do tvaru misiek, druhá časť - na Petriho misky bez filmu. Kultivácia sa uskutočňovala v médiu FAD, ktoré pozostávalo zo zmesi média DMEM a F12 v pomere 3:1 s prídavkom 10 % fetálneho bovinného séra, 5 μg/ml inzulínu (Sigma), 0,5 μg/ml hydrokortizónhemisukcinátu (Sigma), 10 μg/ml epidermálneho rastového faktora EGF (Cytologický ústav RAS, Petrohrad). Druhá a tretia skupina potkanov, každá po 7 jedincov, boli operované 6 dní po prvej. Do tohto času sa zo suspenzie nasiatych keratinocytov v Petriho miskách vytvorili viacvrstvové vrstvy, ktoré boli transplantované do potkanov. Druhej skupine boli transplantované epidermocyty na filme, tretej - viacvrstvová vrstva bez substrátu. Po 7 dňoch boli získané viacvrstvové vrstvy alogénnych keratinocytov (MPALK) nasiate na filmy „Polypore“ transplantované ako kultúra priamo na povrch rany. Navrch bola fólia, aby sa zabránilo jej odtrhnutiu, fixovaná viacvrstvovým gázovým obväzom a prišitá na kožu potkanov.

Pred transplantáciou keratinocytov tretej skupine potkanov pestovaných bez substrátu bol PAC oddelený od dna Petriho misky ošetrením dispázou, ktorá má schopnosť selektívne narušiť dermálno-epidermálne väzby. Pri pôsobení na viacvrstvovú vrstvu dispáza narúša spojenie buniek bazálnej vrstvy s dnom Petriho misky a má oveľa menší vplyv na medzibunkové spojenia, čo umožňuje úplne „odstrániť“ vrstvu. Oddelenie viacvrstvovej bunkovej vrstvy dispázou sa uskutočnilo nasledovne. Transportné médium sa z Petriho misiek vypustilo, bunkové vrstvy sa trikrát premyli živným médiom obsahujúcim antibiotiká, najmä gentamicín (0,2 mg/ml). Viacvrstvové vrstvy sa naplnili 0,125 % roztokom dispázy („Sigma“) a umiestnili sa do termostatu, kde sa inkubovali pri teplote t = 37 °C počas 20 – 30 minút. Výskyt bieleho okraja odlupujúceho sa pozdĺž obvodu vrstvy je indikátorom začiatku procesu jej oddeľovania od okrajov a dna Petriho misky. Niekoľko minút po začiatku procesu oddeľovania sa roztok dispázy vypustil, epitelové vrstvy sa 2-3-krát premyli médiom. Na povrch epidermálnej vrstvy sa priložil kúsok sterilného obväzu na rany „Lita-color“ vystrihnutý na veľkosť misky, na ktorý sa prilepila vrstva oddelená dispázou, dodatočne odlúpnutá zo dna misky špachtľou. Pomocou očnej pinzety sa vrstva spolu s povlakom obrúska „Lita-color“ (Rusko) odtrhla zo dna Petriho misky a opatrne sa preniesla na pripravený povrch jazvy. Obrúsky „Lita-color“ obsahujú gentamicín a exolín (kolagénový extrakt), ktoré po navlhčení zvyškami rastového média a následne fyziologickým roztokom napučali a stali sa moderným obväzom na rany, ktorý poskytuje dobrú ochranu pred vonkajšou infekciou a rýchle hojenie vďaka štruktúre absorbujúcej vlhkosť.

Na fólie Polypore a obrúsky Lita-color boli aplikované viacvrstvové gázové obväzy a prišité na kožu potkanov pre silnejšiu fixáciu. Každý potkan bol umiestnený do samostatnej klietky, aby sa vytvorili optimálne podmienky pre jeho udržanie a uchytenie transplantovaných keratinocytov. Obväzy potkanov, ktorým bola transplantovaná suspenzia a viacvrstvová vrstva epidermocytov odstránených dispázou, boli niekoľkokrát denne navlhčené sterilným fyziologickým roztokom, aby sa vytvorili čo najpriaznivejšie podmienky pre uchytenie buniek. Vzhľadom na to, že fólia Polypore bola nepriepustná pre vodu, obväzy potkanov v druhej skupine neboli navlhčené, čo bola jedna z výhod oproti transplantáciám bez fólií. Obväzy boli odstránené po 10 dňoch. Klinický obraz jaziev po transplantácii buniek sa málo líšil od jaziev bez transplantácie, s výnimkou ich ružovšej farby (v dôsledku dermabrázie) a väčšieho olupovania. Táto skutočnosť naznačuje, že bezprostredne po odpadnutí obväzov z rán s MPC nedošlo v jazve k žiadnym zmenám.

Odber bioptického materiálu z potkanov.

Po 1, 2, 5 a 9 mesiacoch po transplantácii alogénnych keratinocytov potkanov na leštené jazvy bielych potkanov bol odobratý materiál na histologické, cytomorfologické a elektrónmikroskopické vyšetrenie. Vzorky normálnej kože potkanov a jazvy bez transplantácie buniek slúžili ako kontrola. Anestézia potkanov sa vykonala éterovou anestéziou.

Po anestézii boli z označených oblastí odobraté kúsky jazvového tkaniva, do ktorých boli pomocou bioptického razidla s priemerom 2 mm transplantované keratinocyty a umiestnené do 2,5 % roztoku glutaraldehydu na prípravu materiálu na elektrónové mikroskopické vyšetrenie. Kúsky tkaniva odobraté na histologické vyšetrenie boli umiestnené do 10 % neutrálneho roztoku formalínu, následne prefiltrované cez alkoholy a zaliate do parafínu, načo boli narezané ultratenké rezy a prezrené vo svetelno-optickom mikroskope.

Kontrola I. Normálna koža potkana.

Aby bolo možné vidieť rozdiel medzi mikroskopickým obrazom normálnej jazvovo zmenenej kože potkana a jazvami v určitých časoch po transplantácii MPC, sú vo všetkých fázach tejto štúdie uvedené ich fotografie a popisy.

Epiderma normálnej kože pozostáva zo 7-9 vrstiev buniek. Stratum corneum má strednú hrúbku. Na niektorých miestach pozostáva zo 6-8 vrstiev rohovitých šupín. Bazálna vrstva je reprezentovaná valcovitými bunkami s veľkými, svetlými, pravidelne tvarovanými jadrami a niekoľkými jadierkami. Desmozomálne spojenia medzi bunkami a s bazálnou membránou sú jasne vyjadrené. Pod dobre definovanou bazálnou membránou, ktorá má malé výrastky v subepidermálnej vrstve, ležia rovnobežne s ňou jemné zväzky kolagénových a elastínových vlákien, medzi ktorými sú predĺžené fibroblasty a malé cievy. V hlbších vrstvách ležia zväzky kolagénových a elastínových vlákien v rôznych smeroch. Medzi nimi je veľa ciev s tenkými stenami rovnakého kalibru, bunkové elementy (fibroblasty, mastocyty, leukocyty). Veľké množstvo vlasových folikulov a mazových žliaz.

Kontrola 2. Jazva po potkanovi, 2 mesiace stará.

Klinický obraz. Jazvy sú bledoružové, olupujú sa, miestami zostávajú kôry. Ich plocha sa v dôsledku kontrakcie kolagénových vlákien zmenšila a dosiahla približne 3,0 – 3,5 cm ^. Kožné výrastky chýbajú.

Mikroskopický obraz. Epiderma sa skladá z 3-5 vrstiev buniek, zložených, reprezentovaných zaoblenými bazálnymi bunkami, jedným radom subulátových, 1-2 radmi granulárnych s keratohyalínovými zrnami v hornej vrstve, sú tam oblasti intracelulárneho edému. Stratum corneum je nerovnomerne zmenené z veľmi tenkého na zhrubnuté. V dôsledku (sťahovania) jazvového tkaniva je pozorované zvlnenie jazvy. Záhyby prenikajú až do papilárnej vrstvy a vytvárajú dojem papíl. Hranica medzi epidermou a dermou je priamka. Bazálna membrána nie je všade vysledovateľná. V spodnej časti subepidermálnej a hlbších vrstvách sú cievy s hrubou, uvoľnenou stenou, mnohé sú opustené, so stázou. Okolo ciev je akumulácia makrofágov, fibroblastov. Makrofágy obklopujú erytrocyty uvoľnené z kapilár a fagocytujú ich. V povrchnejších vrstvách sú malé kapiláry. Pod epidermou sú voľne umiestnené kolagénové vlákna. V hlbšej vrstve jazvy sú hrubé zväzky kolagénových vlákien, medzi ktorými je veľa fibroblastov.

Jazva potkana jeden mesiac po transplantácii keratinocytov potkana.

Klinický obraz. Jazvy sú ružové, ich plocha sa zmenšila, najmä v priemere, a je v priemere 2,5-3 cm ^2. Vlasy a mazové žľazy chýbajú.

Údaje z mikroskopického vyšetrenia materiálu získaného z potkanov s transplantáciou MPaLK na film a MPaLK bez substrátu sú prakticky identické. Čisto technicky je však práca s MPaLK bez substrátu oveľa zložitejšia a pracnejšia ako pri pestovaní MPaLK na substráte, preto sme pri ďalšom štúdiu problematiky transplantácie keratinocytov do jaziev použili ako základ pre pestovanie viacvrstvový cambric („substráty“).

Mikroskopický obraz. Zaznamenáva sa zhrubnutie epidermy na 15-20 vrstiev, pričom takmer do stredu majú keratinocyty úzky, predĺžený, vertikálny tvar a kompaktné usporiadanie. Bazálne bunky sú umiestnené v nerovnom rade. Ich jadrá sú svetlé, veľké, zaoblené s jedným alebo dvoma jadierkami, čo naznačuje ich vysokú syntetickú a proliferačnú aktivitu. Hranica medzi epidermou a dermou je priamka. Tŕňová vrstva je dobre vyvinutá, pozostáva z 3-5 vrstiev zaoblených buniek, nachádzajú sa tu 2-jadierkové bunky.

Bezprostredne pod bazálnou membránou sa nachádzajú husto umiestnené tenké zväzky kolagénových vlákien, paralelne s nimi je veľké množstvo opustených ciev, hlbšie kolagénové vlákna sú hrubšie, zoskupené v hustých zväzkoch. Mnohé veľké fibroblasty, mastocyty (2-3 v zornom poli), makrofágy, leukocyty a opustené cievy, ktorých steny sú uvoľnené, okolo nich sú voľne umiestnené kolagénové vlákna. V niektorých cievach je stáza, diapedéza vytvorených prvkov. Okolo ciev sú fibroblasty, jednotlivé lymfocyty. Kožné výrastky chýbajú.

Pri transplantácii suspenzie keratinocytov na vyleštenú jazvu sa mikroskopický obraz líši od predchádzajúceho. U väčšiny zvierat je epiderma tenká a pozostáva z 5-6 vrstiev buniek. Spodná vrstva pozostáva z buniek nepravidelného, polygonálneho tvaru s jadrami okrúhleho až nepravidelného tvaru. Stav subepidermálnej vrstvy je podobný jej stavu v skupine zvierat bez transplantácie MPALK.

V tomto prípade môžeme hovoriť buď o oneskorení procesov sprevádzajúcich transplantáciu buniek, alebo o veľkej strate buniek transplantovaných vo forme suspenzie. Preto sa dospelo k záveru o nevhodnosti korekcie jaziev transplantáciou keratinocytov vo forme suspenzie.

Jazva potkana 2 mesiace po transplantácii keratinocytov potkana.

Klinický obraz. Jazva vyzerá tenká a jemná. Miestami sa pozoruje olupovanie a šupinaté škvrny.

Mikroskopický obraz. Stratum corneum je zhrubnuté, miestami hyperkeratóza. Epiderma je zhrubnutá, pozostáva z 12-20 radov buniek. Hranica medzi epidermou a dermou je priamka. Jemné kolagénové vlákna pod epidermou ležia pomerne husto. V hlbších vrstvách jazvy sú zhromaždené vo veľkých hrubých zväzkoch. V subepidermálnej vrstve sa objavujú nové cievne útvary. V spodných vrstvách jazvového tkaniva je veľa opustených ciev umiestnených rovnobežne s povrchom epidermy. Veľké fibroblasty sú rovnomerne rozložené v hrúbke jazvy, sú tam obrovské, viacrozvetvené, veľa makrofágov.

Jazva potkana 5 mesiacov po transplantácii epidermálnych buniek potkana.

Klinický obraz. Jazva vyzerá rovnomerne, hladko, bez olupovania, sú tam jednotlivé chĺpky, ich hustota je väčšia na okraji jaziev, čo naznačuje okrajové vrastanie vlasových folikulov do jazvy a tvorbu nových vlasových folikulov. Plocha jaziev sa naďalej zmenšuje.

Mikroskopický obraz. Epiderma je stále hrubá (15-20 vrstiev, miestami až 30), v horných vrstvách je vyplnená keratohyalínovými zrnami. Bazálna membrána je jasne viditeľná. Pod ňou voľne ležia kolagénové vlákna. V spodných vrstvách je kolagén mohutnejší a hustejšie usporiadaný. Medzi kolagénovými zväzkami je veľa kapilár. V horných vrstvách sa počet opustených ciev znížil. Spojenie epidermy a dermy je mierne zvlnené. Na niektorých miestach sú hlboké epidermálne výrastky v jazvovom tkanive. Medzi kolagénovými vláknami sú viditeľné novovytvorené cievy. Objavujú sa jednotlivé vlasové folikuly a mazové žľazy.

Jazva potkana 9 mesiacov po transplantácii epidermálnych MPA buniek potkana.

Klinický obraz. Jazvy sa v porovnaní s predchádzajúcimi obdobiami výrazne zmenšili, ich plocha je v priemere okolo 1,5-2,0 cm2 ^. Jazvy sú nerovnomerne pokryté jemnými chĺpkami, najmä na okraji. Pretrváva drobné jemné olupovanie.

Mikroskopický obraz.

Epiderma sa stenčila, je reprezentovaná 6-8 radmi buniek, svojou štruktúrou sa podobá epiderme normálnej kože potkana, iba hustota buniek je o 1 mm vyššia a sú menšie. Bazálna vrstva pozostáva z malých okrúhlych valcovitých buniek. Bazálna membrána je dobre vyjadrená, hemidesmozómy sú jasne viditeľné. Je zaznamenaná prítomnosť epidermálnych výrastkov v subepidermálnej vrstve. Papilárna vrstva je vyjadrená pozdĺž celej dĺžky jazvy. Tieto skutočnosti naznačujú, že v tomto čase je adhézia transplantovaných keratinocytov s podkladovým jazvovým tkanivom oveľa silnejšia. Preto môže byť starostlivosť o jazvy u ľudí s transplantáciou MPALK 9 mesiacov po transplantácii MPC tradičná. Pod epidermou sú kolagénové vlákna jemnejšie ako v hlbokých vrstvách. Objavilo sa veľa ciev, najmä povrchových. Steny väčších ciev sú zhrubnuté. Vlasové folikuly a mazové žľazy sú vo veľkom množstve. Mikroskopický obraz pripomína tkanivo podobné derme.

Výsledky experimentálnej práce a ich diskusia.

V priebehu tejto práce boli keratinocyty v rôznych formách transplantované na umelo vytvorené jazvy na koži potkanov po dermabrázii - na krytie rán, ako suspenzia na cambric a ako viacvrstvová vrstva bez substrátu. Práca bola vykonaná s cieľom získať morfologické údaje o vplyve transplantovaných alogénnych keratinocytov na jazvy, ako aj určiť optimálne možnosti transplantácie.

Zistilo sa, že všetky tri metódy transplantácie sú uskutočniteľné, ale transplantácia MPAC bez substrátu je veľmi prácny zákrok, počas ktorého môže dôjsť k poraneniu MPAC, čo ovplyvňuje výsledky transplantácie. Táto metóda transplantácie navyše vylučuje prácu na veľkých povrchoch.

Transplantácia suspenzie keratinocytov je oveľa nákladovo efektívnejšia metóda, nevyžaduje dlhodobú kultiváciu buniek a je jednoduchá v nami navrhovanej verzii s použitím sterilných cambricových polotovarov, ktorých veľkosti zodpovedajú veľkosti jaziev. Oneskorenie terapeutického účinku pri transplantácii bunkovej suspenzie približne o mesiac v porovnaní s MPC na povlak na ranu nie je významným bodom pri trvaní liečby mnoho mesiacov. Je známe, že pri transplantácii MPC pacientom s popáleninami dochádza k transformácii štruktúry kože postupne a počas niekoľkých rokov. Transplantácia kultúry keratinocytov na povlaky na rany je najpohodlnejšia a najsľubnejšia metóda, ale aj výrazne drahšia. Okrem toho si v súčasnosti vyžaduje hľadanie pokročilejších možností povlakov, ktoré by mali byť flexibilné, hygroskopické, mať bakteriostatické alebo baktericídne vlastnosti a byť biologicky neutrálne pre bunky. Fólia „Polypor“ – prechodná verzia domáceho filmového povlaku na rany, nám napriek niektorým nedostatkom umožnila experimentálne študovať transplantáciu keratinocytov potkanov na jazvy a vyvodiť závery o účinnosti tohto smeru liečby jaziev.

Autori, ktorí transplantovali MPC na popáleninové rany, zaznamenali, že počas prvého týždňa po transplantácii viacvrstvovej vrstvy keratinocytov na dezinfikované rany sa epiderma zhrubla a stratifikovala. Všetky vrstvy epidermy boli jasne viditeľné. Je zaujímavé, že počet bunkových vrstiev v transplantátoch bol o 10 – 30 % vyšší ako v kožných biopsiách. Autori zaznamenali výskyt keratohyalínových granúl na 5. deň po transplantácii MPC a bazálnej membrány a hemidesmozómov už na 3. deň.

J.Rives a kol. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM a kol. (1998) zistili, že v skorých štádiách po transplantácii MPC pacientom s kožnými defektmi v plnej hrúbke po popáleninách je spojenie medzi dermou a epidermou veľmi slabé a má priamy tvar, papilárna vrstva chýba. Do konca 2. mesiaca sa začínajú tvoriť plytké papily a kožné výrastky, spojenie medzi dermou a epidermou sa stáva silnejším. Údaje z literatúry naznačujú, že transplantácia alogénnych keratinocytov na rany u pacientov s popáleninami je sľubnou metódou. Napriek tomu, že k odmietnutiu alogénnych keratinocytov dochádza podľa rôznych autorov v priebehu 10 dní až 3 mesiacov, stále zohrávajú svoju úlohu pri hojení povrchu rany, vylučovaní rastových faktorov a mechanickom uzatváraní defektu. Predpokladá sa, že MPALC majú zníženú antigénnu aktivitu, pretože počas kultivácie in vitro strácajú Langerhansove bunky, čo im umožňuje dlhodobú existenciu v tele príjemcu. Navyše, alogénna kultúra získaná z kože mladých zdravých ľudí má neporovnateľne väčší biologický potenciál ako autológna kultúra pacientov po úraze.

Hlavným cieľom našej štúdie bolo zistiť, či sa alogénne keratinocyty uchytia na jazvách a aké zmeny nastanú v jazvovom tkanive pod vplyvom takéhoto biologicky aktívneho „povlaku rany“. V prípade pozitívneho výsledku vyvinúť najefektívnejšiu a najmenej prácnu technológiu pre túto oblasť rehabilitačnej medicíny.

Získané údaje sa v mnohých ohľadoch podobali údajom z literatúry o morfologických zmenách, ku ktorým dochádza v ľudskej epiderme po transplantácii alogénnych keratinocytov do popáleninových rán. Existujú však aj významné rozdiely, a to ako z hľadiska morfologického substrátu, na ktorý sa transplantácia uskutočňuje, tak aj z hľadiska technológie. Proces tvorby bazálnej membrány a dermálno-epidermálnych spojení (hemidesmozómy, papily) teda prebieha neskôr v porovnaní s transplantáciou keratinocytov do rán bez jazvových zmien. Zrejme sa to deje v dôsledku horšej výživy jazvového tkaniva v porovnaní s dermou alebo svalovou fasciou. Jazva, najmä stará, je husté spojivové tkanivo s veľmi malým počtom ciev, zatiaľ čo dno popáleninovej rany tvorí granulačné tkanivo bohaté na cievy. Je teda zrejmé, že podmienky, za ktorých dochádza k transplantácii a uchyteniu keratinocytov, sú úplne odlišné. Čím je oblasť transplantácie buniek viac vaskularizovaná, tým ľahší je proces ich uchytenia. Z tohto postulátu vyplýva záver o preferencii práce s mladými jazvami, v ktorých je spojivové tkanivo ešte dosť voľné a bohaté na cievy.

V dôsledku tejto experimentálnej práce sa dokázalo, že:

1. Transplantácia MPALK na jazvy je možná.
2. Optimálnou metódou transplantácie je transplantácia keratinocytov na krytie rany.
3. Povrch jazvy by sa mal vyleštiť chirurgickou laserovou dermabráziou alebo Schumannovou frézou.
4. Pod vplyvom MPALK dochádza k rýchlej epitelizácii lešteného povrchu jazvy.
5. Čím lepšie je jazvové tkanivo vaskularizované, teda čím je jazva mladšia, tým lepšie sú výsledky transplantácie keratinocytov.
6. Pod vplyvom transplantovaných keratinocytov sa jazvové tkanivo postupne transformuje a mení sa na dermálne (voľnejšie jazvové tkanivo s kožnými výbežkami).
7. Postupné uvoľňovanie jazvového tkaniva, počnúc subepidermálnou vrstvou. Zlepšuje sa jeho vaskularizácia, zväzky kolagénových vlákien v hornej a dolnej časti jazvy majú voľnejšie usporiadanie ako v jazvovom tkanive bez transplantácie buniek. Objavujú sa vlasové folikuly a mazové žľazy. Epiderma sa svojou štruktúrou po prekonaní fázy hypertrofie približuje epiderme normálnej kože.
8. Pozorované zmeny sú spojené s rastovými faktormi a cytokínmi vylučovanými keratinocytmi, ktoré zlepšením trofizmu jazvového tkaniva podporujú jeho transformáciu z hrubého vláknitého tkaniva na riedkejšie tkanivo, čo vedie k zlepšeniu vzhľadu jazvy.

Na základe tejto štúdie teda možno konštatovať, že transplantované keratinocyty majú priaznivý vplyv na jazvové tkanivo, čo môže mať praktické dôsledky pre rehabilitáciu pacientov s rôznymi typmi jaziev.

Táto práca na potkanoch nám tiež umožnila formulovať požiadavky na krytie rán, na ktorých sa pestujú keratinocyty.

Obväzy na rany by mali byť:

• biokompatibilný s bunkami,
• priedušný,
• majú elastickú, tvarujúcu základňu,
• byť hydrofilný,
• ako liečivé prísady obsahujú antibakteriálne liečivá a antioxidanty, ktoré nie sú toxické pre kultivované bunky.

Klinické výsledky biotechnologickej liečby jaziev.

Predtým N. Carver a kol. (1993) zistili, že okluzívne obväzy najlepšie podporujú prichytenie k rane a prežitie keratinocytov, ale neumožňujú tvorbu stratifikovanej (zrelej) epidermy. Na tvorbu stratifikovanej epidermy je nevyhnutné vzdušné prostredie. Preto sa po prichytení viacvrstvovej vrstvy navrhlo odstrániť okluzívny obväz na rany po 7-10 dňoch a ošetriť rany suchými obväzmi alebo vo vode rozpustnými masťami. Dá sa povedať, že kvalita a vlastnosti „substrátu“, na ktorom sa bunky pestujú, sú veľmi dôležitým bodom pre účinnosť transplantácie bunkového materiálu, a teda aj pre výsledky práce lekárov. Napriek množstvu navrhovaných možností (umelá koža, netkaná textília vyrobená z karboxymetylcelulózy, fibrínové povlaky, polopriepustné polyuretánové filmy) však dnes neexistuje ideálny obväz na rany. Dôležitým bodom v tejto veci je cena „substrátov“ (špeciálnych krytí rán), pretože ich vysoká cena zvyšuje celkové náklady na biotechnologickú liečbu.

Účinnosť bunkových technológií sa doteraz preukázala, ale bohužiaľ sú tieto technológie veľmi drahé, najmä v krajinách, kde nebola zavedená priemyselná výroba bunkových kompozícií. Krajiny ako Spojené štáty však už dlho vybudovali priemysel na výrobu bunkového materiálu na transplantáciu popálenín. Najmä spoločnosť BioSurface Technology Inc. od roku 1989 vypestovala 37 000 viacvrstvových keratinocytových vrstiev, ktoré boli použité na liečbu 240 pacientov v 79 krajinách sveta (R. Odessey, 1992), pričom 1 cm2 bunkovej kultúry ^stojí približne 7 – 8 amerických dolárov.

Technológia liečby rôznych kožných ochorení a problémov má množstvo rozdielov, ale akákoľvek bunková liečba je založená na získaní kvalitného bunkového materiálu a jeho transplantácii.

Tento proces pozostáva z nasledujúcich krokov:

• odber kože od obetí (alebo od darcov),
• preprava kožných lalokov do biotechnologického centra,
• izolácia buniek bazálnej vrstvy a ich proliferácia,
• rast viacvrstvových keratinocytových vrstiev (MLK).
• transplantácia bunkovej kultúry.

Hlavným problémom pri vykonávaní liečby transplantáciou viacvrstvových keratinocytových plátov je potreba životaschopných buniek vo všetkých štádiách transplantácie buniek. Kúsky kože na izoláciu autológnych alebo alogénnych buniek by mali byť čo najtenšie, pretože v tomto prípade sa ľahšie oddeľujú mechanickými a enzymatickými metódami a získava sa suspenzia živých buniek na kultiváciu. Môžu sa získať odrezaním dermatómom alebo použitím kože očných viečok, predkožky a vnútorného povrchu ramena. Vzhľadom na to, že bunky sú citlivé na halogény (chlór, jód) a peroxid vodíka, nemožno ich použiť pri spracovaní kože počas odberu materiálu.

Kvantitatívny a kvalitatívny výťažok buniek z kožných štepov a účinnosť ich kultivácie závisia aj od zdravotného stavu a veku darcu. Okrem toho musia byť kožné biopsie doručené čo najrýchlejšie a za vhodných podmienok (prostredie, teplota) do laboratória certifikovaného a akreditovaného na tieto účely.

Na skladovanie a prepravu kožných lalokov sa môže použiť Eagleho médium alebo médium 199 s prídavkom 10 % bovinného séra, médium DMEM s prídavkom 5 % fetálneho bovinného séra a antibiotík.

V cytologickom laboratóriu sa biopsia kože najprv mechanicky rozdelí na malé kúsky, potom sa kúsky kože spracujú pomocou enzýmov: trypsínu, kolagenázy, dispázy atď.

Pôsobením enzýmov sa desmozómy ničia a keratinocyty sa uvoľňujú do média vo forme jednotlivých buniek alebo agregátov pozostávajúcich z rôzneho počtu buniek. Na kultiváciu sa používajú iba bazálne keratinocyty, ktoré sa pestujú na špeciálnych médiách v termostatoch obsahujúcich 5 % CO2, v Petriho miskách alebo v bankách pri teplote t = 37 °C. Už po 48 hodinách sa pozoruje tvorba kolónií keratinocytov, ktoré sa postupne spájajú a menia sa na monovrstvu. Po získaní dostatočného počtu buniek sa výsledná suspenzia nanesie na obväzy rán pripravené na tento účel a umiestni sa do Petriho misiek. Zo suspenzie sa najprv vytvorí monovrstva a potom viacvrstvová vrstva keratinocytov. Fázy procesu kultivácie keratinocytov sú schematicky znázornené na obr. 12 (33,43,54,65).

Tvorba viacvrstvovej vrstvy keratinocytov vhodnej na transplantáciu zvyčajne trvá 7 – 10 dní. Niekedy je táto doba dlhšia, čo závisí od kvality východiskového materiálu (vek, zdravotný stav darcu, správnosť odberu materiálu, kvalita použitého média atď.). Ak viacvrstvová vrstva prerastie, môžu sa na jej povrchu objaviť bunky s javmi apoptózy nevhodné na transplantáciu. Petriho misky s viacvrstvovými vrstvami keratinocytov (MLK) vypestovanými v nich na krytí rán sa dodávajú na kliniku v špeciálnych nádobách pri teplote najmenej +15 °C.

Modifikovaná Greenova metóda pestovania MPC

V našej práci sme ako krytie rán použili viacvrstvový cambric a upustili sme od fólií „Polypor“, s ktorými sme začali pracovať v experimente s potkanmi. Preto sme na vopred odtučnenom a sterilnom cambricu vypestovali viacvrstvové vrstvy keratinocytov, hoci ani to nie je optimálne krytie rán.

Klinické štúdie boli vykonané na dobrovoľníkoch v súlade s potrebnými etickými štandardmi: podpísanie dohody a informovaný súhlas.

1. Použila sa kultúra vlastných (autológnych) a bankových (alogénnych) keratinocytov pacienta.
2. Vlastné keratinocyty pacientov boli získané z kúska kože odrezaného z vnútornej strany ich horných ramien.
3. Operácia dermabrázie jaziev sa vykonala pomocou termokauterizácie, rotačných diskov a erbiového laseru.
4. Boli odobraté skupiny pacientov s normotrofickými, hypotrofickými a hypertrofickými jazvami.

Technologický proces aplikácie bunkovej technológie na zlepšenie vzhľadu kožných jaziev pozostával z nasledujúcich fáz:

1. Výber pacienta.
2. Vysvetlenie podstaty liečby, časového rámca pre dosiahnutie očakávaných výsledkov, podpísanie zmluvy a informovaného súhlasu.
3. Pacientom predpísať 2-3 týždne pred operáciou Selmevit 1 tabletu 3-krát denne, Zinctheral 1 tabletu 3-krát denne.
4. Odobratie kúska kože s dĺžkou 2,0 cm a šírkou 0,7-1,0 cm z vnútorného povrchu ramena, vysoko, takmer v dolnej časti axilárnej oblasti, na získanie autológnych keratinocytov.
5. V prípadoch, keď pacienti odmietli izoláciu vlastných keratinocytov z dôvodu možnosti lineárnej jazvy na vnútornom povrchu ramena, bol bunkový materiál odobratý z bunkovej banky (alogénne keratinocyty).
6. Keratinocyty boli izolované a pestované v laboratóriu certifikovanom pre tento typ práce.
7. Po získaní dostatočného množstva MPC na transplantáciu na jazvy bol stanovený deň operácie na klinike, kam bol materiál privezený v špeciálnych nádobách v Petriho miskách.
8. Bola vykonaná operácia dermabrázie jaziev, hemostáza, leštený povrch bol premytý sterilným fyziologickým roztokom, vysušený a následne boli naň transplantované MPC na sterilnú kambrickú podložku „bunkami nadol“. To znamená, že bunky, ktoré boli v MPC hore, sa ukázali byť nižšie, susediace s lešteným povrchom.
9. Navrch sa aplikovala sterilná fólia, ktorá sa fixovala na kožu elastickým obväzom alebo elastickou náplasťou Omnifix. Namiesto fólie sa môžu použiť indiferentné obväzy na rany s obsahom silikónu, napríklad Mepitel, Mepiform, silikónové gélové fólie.

Po 5-7 dňoch sa film alebo silikónový povlak odstráni. Dovtedy by sa všetky keratinocyty mali vyliezť na vyleštenú jazvu a prichytiť sa k jej povrchu.

10. Vlhké prostredie vytvorené pod filmom a silikónovým povlakom k tomu aktívne prispieva. Zvyšná cambrica na jazve od tohto bodu môže byť nasiaknutá kuriozínom alebo chitosanovým gélom. Výsledkom je, že na druhý deň sa vytvorí hustá kôrka, ktorú je pre pohodlie pacienta najlepšie fixovať elastickou, priedušnou náplasťou, ako je Omnifix. Priedušná kôrka umožňuje vytvorenej epiderme diferencovať sa a premeniť na zrelú.

V závislosti od typu jazvy a hĺbky brúsenia sa obväz po 8-10 dňoch odmietne. V tomto čase má epiderma o 30-40% viac bunkových vrstiev ako v normálnej koži. Bazálna membrána sa netvorí. Keratinocyty zhrubnutej epidermy vylučujú do jazvového tkaniva množstvo biologicky aktívnych molekúl.

Úspech biotechnologickej liečby jaziev do značnej miery závisí od spôsobu starostlivosti v pooperačnom období. Bunkové kultúry sú „šetrným“ typom krytia rán a v počiatočných štádiách po transplantácii sa IPC dajú ľahko odlepiť od podkladových tkanív. Preto sa pacientom odporúča, aby po operácii s jazvou zaobchádzali opatrne. Počas 8-9 mesiacov ju netrieť a jemne ošetrovať studenou prevarenou vodou, aby sa predišlo odtrhnutiu tenkej, novovytvorenej epidermy, ktorá nemá pevnú väzbu s podkladovými tkanivami.

Poznámka.

Pred operáciou a počas dermabrázie je povolené použitie halogénovaných antiseptík a oxidačných činidiel (jódopyrón, suliodopyrón, jodinol, jodinát, chlórhexidín, peroxid vodíka) pred transplantáciou buniek - je prísne kontraindikované kvôli ich cytotoxickému účinku. Metylénová modrá a brilantná zelená sú tiež toxické pre bunky.

Aby sa predišlo infekcii, najmä pri práci s hypertrofickými jazvami, je možné chirurgické pole ošetriť neomycínsulfátom, polymyxínom alebo gentamicínom. Nemajú cytotoxický účinok na keratinocyty.

Výsledkom takejto liečby je trojitý účinok.

1. Vyrovnanie povrchu jazvy.
2. Vytvorenie vrstvy novej epidermy normálnej hrúbky nad ňou.
3. Transformácia jazvového tkaniva na tkanivo podobné derme v dôsledku pôsobenia cytokínov, rastových faktorov a iných biologicky aktívnych molekúl vylučovaných transplantovanými bunkami a stimulovaných keratinocytmi, fibroblastami a makrofágmi.

Jazva sa stáva menej viditeľnou, elastickejšou, objavujú sa v nej póry a jemné ochlpenie a pigmentácia sa môže obnoviť vďaka prítomnosti melanocytov v IPC.

Všetky tieto pozitívne aspekty jazvy sa však neprejavujú okamžite. V tejto súvislosti je potrebné pacientov upozorniť, že proces premeny jazvového tkaniva na dermálne tkanivo prebieha pomaly a optimálny výsledok takejto liečby možno očakávať najskôr o 10 – 14 mesiacov. Bezprostredne po odmietnutí obväzov majú leštené povrchy výraznú polychrómiu, čím jasnejšia je, čím hlbšie bolo leštenie vykonané. Najmenšie poškodenie kože sa pozoruje pri leštení normotrofických jaziev erbiovým laserom. Farba jaziev a okolitej kože sa obnovila v priebehu 3 až 8 týždňov. Napriek týmto opatreniam sa niekedy vyskytuje pooperačná hyperpigmentácia, ktorá môže sama vymiznúť v priebehu niekoľkých mesiacov.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]