Experimentálna práca na transplantácii alogénnych keratinocytov na umelo vytvorené jazvy bielych potkanov

Túžba využívať bunkový potenciál a potreba hľadať nové efektívne metódy na zlepšenie estetického vzhľadu jaziev viedli k myšlienke snažiť sa študovať možnosť transplantácie keratínocytov na zjazvené povrchy.

Na preukázanie možnosť použitia keratinocytov kultúry zlepšiť vzhľad jaziev experimentálna práca vymáhalo v bielych laboratórnych krysách, ktoré boli vytvorené jazvy povrch. Model brucha krýs bol získaný ako výsledok hojenia umelo spôsobených rán na chrbte, pozdĺž chrbtice. Krysy boli narezané kusy rovnakej kože, veľkosti 2x3 cm. Po 2,5 mesiacov po operácii "simulácia jazvením" Potkan bola vykonaná obrúsenie pokožky na operáciu (odstránenie hornej vrstvy cez ignioperation bachora) a transplantovaných alogénnych keratinocytov, izolovaný z kože mladých potkanov 2-4 dni po narodení.

Izolácia a rast krysích epidermocytov sa uskutočnila v laboratóriu bunkových technológií Ústavu cytológie RAS nasledujúcej technológie.

Koža bola umytá v Hanková roztoku chloridu sodného, obsahujúcim 200 U / ml gentamycínu, nakrájané na malé kúsky, čo je oblasť 0,2-0,5 cm ². Kocky kožných buniek sa inkubovali v 0,5% roztoku disaspázy vo vyváženom roztoku pufrovanom fosfátom vo fyziologickom roztoku pri teplote 37 ° C počas jednej hodiny. Kusy sa potom preniesli do fosfátového pufrovaného fyziologického roztoku Dulbecco a epidermis sa oddelila od dermis. Epidermis bol inkubuje sa s ním v 0,125% roztoku trypsínu po dobu 10-15 minút za stáleho miešania pri rýchlosti 50 ot / min, načo sa enzým zastavená prídavkom 5% fetálneho séra hovädzieho dobytka. Jedna tretina z výslednej bunkovej suspenzie bolo použité v čistej forme pre jednu z možností, ako transplantácii jazvy, druhý tretí pestované na domáce biokompatibilný filmového povlaku "Polipor", tretia - na Petriho miske bez substrátu. Prevádzka dermabrasion získané zjazvenie u krýs s následným prevodom na ne epidermotsitov krysu v éterové anestézii bola vykonaná pomocou kauterizácia.

Prvá skupina potkanov po dermabrasion na leštený, premyje sa roztokom chloridu sodného a sušia sa povrchové sterilné bachora prekrýva kusy trávnika, ktorý bol uložený miešaná alogénne potkania epidermotsitov suspenzie v koncentrácii 1,5 milióna buniek na 1 ml (v závislosti na Ústavu cytológie). Batist kusy naskladané na leštené jazvu, takže bunky vytvorené na povrchu jazvy. Obväz na vrchole niekoľko vrstiev gázy, ktorý je všité do okraja jazvy.

Časť výslednej bunkovej suspenzie bola nanesená do Petriho misiek na sterilné polypore filmy nakrájané v tvare pohárov, druhá časť bola na Petriho miskách bez filmu. Kultivácia sa uskutočnila v médiu FAD pozostávajúcom zo zmesi DMEM a F12 v pomere 3: 1. S prídavkom 10% fetálneho hovädzieho séra, 5 ug / ml inzulínu (Sigma), 0,5 ug / ml hemisukcinátu hydrokortizónu (Sigma). 10 μg / ml epidermálneho rastového faktora EGF (Cytologický ústav RAS, Petrohrad). Druhá a tretia skupina potkanov so 7 jednotlivcami bola prevádzkovaná 6 dní po prvom. V tomto čase sa vytvorili viacvrstvové vrstvy zo suspenzie osetých keratinocytov v Petriho miskách, ktoré boli transplantované potkanom. Druhá skupina bola transplantovaná epidermocytmi na film, tretia skupina - s viacvrstvovou vrstvou bez substrátu. Po siedmich dňoch boli viacvrstvové vrstvy alogických keratinocytov (MPALK), vysiate na Polypore filmoch, transplantované pomocou kultivácie priamo na povrch rany. Hore, film, aby sa zabránilo jeho roztrhnutiu, bol fixovaný viacvrstvovým gázovým obväzom a prišitý na kožu potkanov.

Pred presadení keratinocyty tretiu skupinu krýs, pestované bez substrátu, vytvára oddelenie práškového aktívneho uhlia z dna misky dispáza liečenia Petri, ktorý má schopnosť sa selektívne prerušiť komunikáciu Dermo-epidermálne. Pôsobením viacvrstvového zásobníka dispáza ničí spojenie bazálnej vrstvy buniek na dne Petriho misky a v oveľa menšej miere, má vplyv na medzibunkovú komunikáciu, vďaka ktorému je možné "odstrániť" celú vrstvu. Oddelenie viacvrstvového tvorby buniek dispáza bola vykonaná nasledujúcim spôsobom. Z Petriho misky mieša transportné médium, bunkovej dosky boli trikrát premyté médiom obsahujúcim antibiotiká, najmä - gentamycín (0,2 mg / ml). Viacvrstvové vrstvy sa naleje 0,125% roztoku dispázy ( «Sigma») a umiestni sa do inkubátora, kde boli inkubované pri t = 37 ° C počas 20-30 minút. Vzhľad bielej koruny, odlupovanie po obvode nádrže - ukazovateľ na začiatok procesu oddelením od okrajov a spodnej časti Petriho misky. Niekoľko minút po začiatku separačného procesu, dispáza roztok vyprázdnený 2-3krát epitelové vrstvy boli premyté médiom. Na bol aplikovaný povrch epidermálnej vrstvy, rezané na veľkosť šálky kúsok sterilný obväz "Leith-farby, ktorý sa štiepi oddelí dispázy tvorbu, ďalej delaminácii dne šálky špachtľou. Použitie očné pinzety vrstva spolu s povlakom vložky" Leith farby "(po rusky ) odtrhol od dna Petriho misky a opatrne prenesené na pripravený povrch jazvy. Obrúsky "Lita-color" obsahuje vo svojom zložení a gentamicín eksolin (kolagén extrakt), ktorá, keď je vlhký prostredie zostáva kel v budúcnosti Shem soľný roztok sa zväčšila a stala moderná hojenie povlak, ktorý poskytuje dobrú ochranu pred vonkajším infekciám a rýchlemu hojeniu kvôli počiatočnej vlhkosti štruktúrou.

Vo filme "Polipor" obrúsky "Leith-color" prekrývajú viacvrstvové gázové obväzy, ktoré sú šité na koži krýs na ich silnejšie fixáciu. Každá krysa bola vysadená v samostatnej klietke, aby sa vytvorili optimálne podmienky pre jej udržiavanie a engraftment transplantovaných keratinocytov. Bandáže krysy, že každý deň transplantované odpruženie a viacvrstvovú nádrž epidermotsitov záber dispáza, niekoľkokrát za deň, navlhčia sa sterilným fyziologickým roztokom pre vytvorenie čo najvýhodnejších podmienok bunky pre štepu. Vzhľadom k tomu, že film "Polypor" bol nepriepustný pre vodu, krysy druhej skupiny nezakryli obväzy, čo bola jedna z výhod oproti transplantáciám bez filmov. Po 10 dňoch boli obväzy odstránené. Klinický obraz jaziev po transplantácii buniek sa mal veľmi odlišne od jaziev bez transplantácie, okrem ružovej farby (v dôsledku dermabrázie) a väčšieho odlupovania. Táto skutočnosť naznačuje, že. že hneď po páde krycích vrstiev s IPC nedošlo k zmenám v bachore.

Užívanie materiálu biopsie u potkanov.

Po 1, 2, 5 a 9 mesiacov po transplantácii keratinocytov na potkany allogichnyh pozemné jazvy biele krysy, pričom je vyrobený materiál pre histologické, cytomorphological a elektrónové mikroskopické štúdie. Ako kontrolné vzorky normálnej potkanej pokožky a jazvy sa odobrali bez transplantácie buniek. Anestézia u potkanov sa uskutočnila s éterovou anestézou.

Po anestézii boli z označených oblastí, do ktorých boli transplantované keratinocyty, bioptický piercer s priemerom 2 mm. Zjazvené tkanivo plátky boli odobraté a umiestnené do 2,5% roztoku kyseliny glutarovej aldehydu na prípravu materiálu pre elektrónové mikroskopické vyšetrenie. Kúsky tkaniva odobraté na histologické vyšetrenie sa umiestni do 10% neutrálneho roztoku formalínu a následne prostredníctvom zapojenia alkoholov a plní do parafínu, nasleduje rezanie ultratenkých sekcií a ich prezeranie vo svetle-optického mikroskopu.

Kontrola I. Normálna pleť krysy.

Aby sme videli rozdiel medzi mikroskopickým obrazom normálnej pokožky potkanov a jaziev pozmeňujúcich jazvu v určitých časoch po transplantácii IPC, preukázali sa fotografie a opisy vo všetkých štádiách tejto štúdie.

Epidermia normálnej kože pozostáva z 7 až 9 vrstiev buniek. Horná vrstva strednej hrúbky. Na miestach sa skladá z 6-8 vrstiev hornej váhy. Základná vrstva je reprezentovaná bunkami valcového tvaru s veľkým svetlom, pravidelnými jadrami a niekoľkými jadrami. Desmosomálne spojenia medzi bunkami a bazálnou membránou sú jasne vyjadrené. Za dobre definovaných bazálnej membrány, ktorá má jemné výčnelky v subepidermální vrstvy ležiacich rovnobežne sa jemné zväzkov kolagénu a elastínu vlákien, vrátane predĺžených fibroblasty, malých plavidiel. V hlbších vrstvách sú zväzky kolagénových a elastínových vlákien v rôznych smeroch. Medzi nimi existuje veľa nádob s tenkými stenami rovnakého kalibru, bunkových prvkov (fibroblasty, žírne bunky, leukocyty). Vo veľkom počte vlasových folikulov, mazových žliaz.

Kontrola 2. Jazda potkana vo veku 2 mesiacov.

Klinický obraz. Jazve bledo ružové, s peelingom, na miestach zostávajú kosti. Ich plocha je znížená v dôsledku kontrakcie kolagénových vlákien a stáť približne 3,0 - 3,5 cm ^:. Kožné upchávky chýbajú.

Mikroskopický obraz. Epidermis sa skladá z 3-5 vrstiev buniek, plisé, zastúpené zaoblenými bazálnych buniek, jeden riadok subulate, 1-2 riadky keratohyalin granule so zrnami v hornej vrstve, sú časti intracelulárneho edému. Vrstva rohovky sa heterogénne mení z veľmi tenkého na zahustený. Tam je prehnutie brucha v dôsledku (kontrakcie) jazvy tkaniva. Záhyby prenikajú do papilárnej vrstvy a vytvárajú dojem papily. Hranica medzi pokožkou a dermis je priamka. Bazálnu membránu nie je možné sledovať všade. V dolnej časti podepidermálnych a hlbších vrstiev - nádoby s hrubou, uvoľnenou stenou, mnoho opustených so stázou. Okolo ciev - zhluk makrofágov, fibroblastov. Makrofágy obklopujú erytrocyty vychádzajúce z kapilár a fagocytujú ich. V povrchnejších vrstvách - malých kapilárach. Pod pokožkou sú kolagénové vlákna uvoľnené. V hlbšej vrstve brucha - hrubé zväzky kolagénových vlákien, medzi ktorými je mnoho fibroblastov.

Jazda potkana mesiac po transplantácii keratinocytov krýs potkana MPA1.

Klinický obraz. Jazve ružové, ich plocha sa znížila, najmä v priemere a priemer 2,5-3 cm ². Vlasy a mazové žľazy chýba.

Tieto mikroskopické vyšetrenie materiálu získané z potkanov s prenos MPAlK MPAlK na filme a substrátu, bez v podstate identické. Avšak, technicky, práca s MPAlK nepodporovaným oveľa zložitejšie a pracnejšie ako keď rastú MPAlK na podklade, takže ďalšie štúdie emisie na transplantáciu kertainotsitov jazvy sme použili ako základ pre pestovanie ( "substrát") vrstvený trávnika.

Mikroskopický obraz. Nastáva zhrubnutie epidermis na 15-20 vrstiev, takmer do stredu ktorých majú keratinocyty úzky, predĺžený, vertikálny tvar a kompaktné usporiadanie. Bazálne bunky sú usporiadané v nerovnom vedení. Ich jadrá sú ľahké, veľké, okrúhleho tvaru s jedným alebo dvoma nukleóliami, čo poukazuje na ich vysokú syntetickú a proliferačnú aktivitu. Hranica medzi pokožkou a dermis je priamka. Tvrdá vrstva je dobre vyvinutá, pozostáva z 3 až 5 vrstiev buniek okrúhleho tvaru, sú tu 2 nukleové bunky.

Bezprostredne pod bazálnou membránou - husto umiestnené tenké zväzky kolagénových vlákien, paralelne s nimi veľké množstvo prázdnych nádob, hlbšie kolagénové vlákna sú hrubšie, zbierané v hustých zväzkoch. Veľa veľkých fibroblastov, žírnych buniek (2-3 v zornom poli), makrofágov, leukocytov a prázdnych ciev, ktorých steny sú uvoľnené, okolo nich sú voľné kolagénové vlákna. V niektorých plavidlách - stasis, diapedesis jednotných prvkov. Okolo ciev - fibroblasty, jednotlivé lymfocyty. Kožné upchávky chýbajú.

Keď sa suspenzia keratinocytov transplantuje na leštenú jazvu, mikroskopický obraz sa líši od predchádzajúcej. Vo väčšine zvierat - epidermis je tenká, pozostáva z 5-6 vrstiev buniek. Spodná vrstva pozostáva z buniek nepravidelného polygonálneho tvaru so zaoblenými nepravidelnými jadrami. Stav subepidermálnej vrstvy je podobný stavu v skupine zvierat bez transplantácie.

V tomto prípade je možné hovoriť o oneskorení procesov sprevádzajúcich bunkovú transplantáciu, alebo o veľkej strate buniek transplantovaných vo forme suspenzie. Preto sa dospelo k záveru, že korekcia zjazvenia transplantáciou keratinocytov vo forme suspenzie je nevhodná.

Zjazvenie potkanov 2 mesiace po transplantácii keratinocytov krýs potkana MPAI.

Klinický obraz. Jazva je tenká, jemná. Na miestach sa vyskytuje ekdýza, váhy.

Mikroskopické obrázky. Stratum corneum je zhrubnutý, na miestach - hyperkeratóza. Epidermia je zhrubnutá, pozostáva z 12 až 20 riadkov buniek. Hranica medzi pokožkou a dermis je priamka. Jemné kolagénové vlákna pod pokožkou ležia dosť pevne. V hlbších vrstvách bachorov sa zhromažďujú v hrubých veľkých zväzkoch. V subepidermálnej vrstve sa objavuje nová formácia ciev. V dolných vrstvách tkaniva jazvy - veľa prázdnych ciev, ktoré sú umiestnené rovnobežne s povrchom pokožky. Veľké fibroblasty sú rovnomerne rozložené v hrúbke brucha, existujú obrovské, mnohostranné, mnoho makrofágov.

Jesenie potkana 5 mesiacov po transplantácii MP krysích spermiocytov.

Klinický obraz. Jazva vyzerá hladká, hladká, bez odlupovania, existuje jediný vlas ich väčšej hustoty na okraji jazvy, čo svedčí o hrany zarastaniu vlasové folikuly v bachore a nádor vlasových folikulov. Oblasť jaziev sa naďalej znižuje.

Mikroskopický obraz. Epidermia je stále hustá (15-20 vrstiev, niekedy až 30) v horných vrstvách je naplnená zrnami keratogialínu. Základná membrána je jasne viditeľná. Pod jej kolagénovými vláknami je voľná. V dolných vrstvách - kolagén je silnejší a pevnejší. Medzi lúčmi kolagénu je veľa kapilár. V horných vrstvách sa znížil počet prázdnych nádob. Epidermia a derma sú mierne vlnité. Tam sú hlboké epidermálne výrastky v tkanivo jazvy. Medzi kolagénovými vláknami sú viditeľné novo vytvorené nádoby. Zobrazujú sa jednotlivé vlasové folikuly a mazové žľazy.

Dusenie potkanov 9 mesiacov po transplantácii epidermocytov krysích krys IPA.

Klinický obraz. Jazvy sú oveľa menšie v porovnaní s predchádzajúcimi obdobiami a ich plocha o priemere 1,5-2,0 cm ². Jazvy sú nerovnomerne pokryté tenkými vlasmi, najmä okolo obvodu. Malá mierka s malými platňami zostáva zachovaná.

Mikroskopický obraz.

Epidermia sa stala tenšou, reprezentovaná z 6-8 radov buniek, pripomínajúca epidermálnu štruktúru normálnej kože potkanov, len hustota buniek o 1 mm. Vyššie a sú menšie. Základná vrstva pozostáva z malých buniek tvaru guľatého valca. Základná membrána je dobre definovaná, hemidesmosómy sú jasne viditeľné. Prítomnosť epidermálnych výrastkov v subepidermálnej vrstve je zaznamenaná. Papilárna vrstva je vyjadrená pozdĺž celej dĺžky jazvy. Tieto fakty ukazujú, že po tejto dobe sa adhézia transplantovaných keratínocytov stala oveľa odolnejšia so základnými tkanivami brucha. V dôsledku toho môže byť tradičná starostlivosť o jazvy ľudí s transplantáciou MALC 9 mesiacov po transplantácii IPC. Pod pokožkou sú jemnejšie kolagénové vlákna ako v hlbších vrstvách. Tam bolo veľa nádob, najmä povrchne umiestnené. Vo väčších nádobách sú steny zahustené. Vlasové folikuly a mazové žľazy vo veľkom množstve. Mikroskopický vzor pripomína dermálne tkanivo.

Výsledky experimentálnej práce a ich diskusia.

Počas tejto práce na umelých kožných jaziev krýs po operácii dermabrasion, transplantovaných keratinocytov v rôznych formah- na rany povrchov, ako suspenziu vo batist a vrstvené tvorby bez substrátu. Práca bola vykonaná na získanie morfologických údajov o účinku transplantovaných alogénnych keratinocytov na jazvy, ako aj určenie optimálnych variantov transplantácie.

Zistilo sa, že všetky tri metódy presadení reálny, ale bez transplantácii Mpaka podkladu - veľmi prácny postup, počas ktorého môže byť Mpaka zraneného, sa odráža na výsledkoch transplantácie. Navyše tento spôsob transplantácie vylučuje prácu na veľkých plochách.

Transplantácia suspenzie keratínocytov je oveľa úspornejšia, nevyžaduje dlhú bunkovú kultúru a je jednoduchá v našej navrhovanej verzii s použitím sterilných kalibrových predvalkov, ktorých rozmery zodpovedajú veľkosti jaziev. Lapa terapeutického účinku počas transplantácie bunkovej suspenzie počas približne jedného mesiaca v porovnaní s MIC na povlaku na ranu nie je významným okamihom s trvaním liečby vypočítaným v priebehu mnohých mesiacov. Je známe, že počas transplantácie IPC na popálenie pacientov sa transformácia stavu štruktúry kože uskutočnila postupne a niekoľko rokov. Transplantácia kultúry keratinocytov na krytie rany je najvýhodnejšou a najsľubnejšou metódou, je však oveľa drahšia. Okrem toho, vyžadujúce si dnes hľadanie sofistikovanejších povlakov, ktoré musia byť plastické, hygroskopické, majú bakteriostatické alebo baktericídne vlastnosti a sú biologicky neutrálne pre bunky. Film "Polipor" - medziprodukt verzia domáceho filmu rany pokrytie, aj cez niektoré nedostatky, nám umožnila študovať experimentálne keratinocytov transplantačných potkanov na jazvy a vyvodiť závery o efektivite tohto smeru príťažlivosti jaziev.

Autori, ktorý vykonal transplantáciu na rany IPC zápalné, poznamenať, že v priebehu prvého týždňa po transplantácii viacvrstvového zásobníka keratinocytov na rany dezinfikované, epidermis zhustne a stratifikovaný. Všetky vrstvy epidermis boli dobre definované. Zaujímavé je, že počet bunkových vrstiev v transplantáciách je o 10-30% vyšší ako u buniek s bioptickými vzorkami. Autori poznamenali výskyt granúl keratogialínu 5. Deň po transplantácii MPA, bazálnej membrány a hemidesmosómov - už tretí deň.

J. Rives a kol. (L994), Paramonov BA (1996); NM Kuznetsov et al. (1998) zistili, že počas prvých obdobia po transplantácii pacientom BMD polnosloynymi kožných defektov po popáleninách, komunikácia medzi dermis a epidermis je veľmi slabá a je priamka, papilárna vrstva chýba. Do konca druhého mesiaca začína tvorba plytkých papierov a prikrývok pokožky, spojenie medzi dermis a epidermis sa stáva odolnejšie. Údaje z literatúry hovoria o transplantácii alogénnych keratinocytov na rany spálených pacientov ako o sľubnej metóde. Napriek skutočnosti, že odmietnutie alogénnych keratinocytov dochádza predložené rôznymi autormi v čase od 10 dní do 3 mesiacov, však, oni hrajú úlohu v hojenia rany povrchu, uvoľnenie rastových faktorov a mechanicky uzavretie defektu. Predpokladá sa, že MPALK má zníženú antigénnu aktivitu, pretože počas kultivácie in vitro strácajú Langerhansove bunky, čo im umožňuje v organizme príjemcu existovať dlhý čas. Okrem toho alogénna kultúra získaná z kože mladých zdravých ľudí má neporovnateľne väčší biologický potenciál ako autológna kultúra pacientov po traume.

Hlavným cieľom našej štúdie bolo zistiť, či alogénne keratinocyty prežijú na jazvach a aké budú zmeny v jazvovom tkanive pod vplyvom takéhoto biologicky aktívneho "povlaku na rany". V prípade pozitívneho výsledku vypracujte najúčinnejšiu a najnepracovanejšiu technológiu v tejto oblasti rehabilitačnej medicíny.

Údaje, ktoré sme získali v mnohých ohľadoch, sa ukázali byť podobné údajom z literatúry o morfologických zmenách vyskytujúcich sa v ľudskej epiderme po prenose alogénnych keratinocytov na popáleniny. Existujú však výrazné rozdiely, čo sa týka morfologického substrátu, ktorý je transplantovaný, aj z hľadiska technológie. So. Proces tvorby bazálnej membrány a dermo-epidermálnych pripojení (hemidesmosómy, papily) sa vyskytuje neskôr ako pri transplantácii keratinocytov na povrchy rany bez zmeny jaziev. Zdá sa, že to je spôsobené nedostatočnou výživou tkaniva brucha v porovnaní s dermis alebo svalovou fasciou. Jazva, hlavne stará, je hustá spojivová tkanina s veľmi malým počtom ciev, spodná časť hornej rany je granulačné tkanivo bohaté na krvné cievy. Preto je zrejmé, že podmienky, za ktorých dochádza k transplantácii a vylúčeniu keratinocytov, sú úplne odlišné. Čím viac vaskularizuje oblasť transplantácie buniek, tým ľahšie je spracovávať. Z tohto postulátu vyplýva záver o preferencii práce s mladými jazvami, v ktorých je spojivové tkanivo stále dostatočne voľné a bohaté na krvné cievy.

V dôsledku tejto experimentálnej práce sa preukázalo, že:

1. Transplantácia MALK na jazvy je možná. 
2. Optimálnym spôsobom transplantácie je transplantácia keratinocytov na kryciu vrstvu.
3. Povrch jazvy by mal byť mletý pomocou operatívnej dermabrázie pomocou Schumannovho lasera alebo frézy.
4. Pod vplyvom MPALK nastáva rýchla epitelizácia povrchu zeme brucha.
5. Lepšie vaskularizované zjazvené tkanivo, tj mladšia jazva, tým lepšie výsledky transplantácie keratinocytov.
6. Jazva tkaniva pod vplyvom transplantovaných keratinocytov sa postupne transformuje a mení sa na kožné (drobnejšie tkanivo jazvy s prídavkami kože).
7. Postupné uvoľňovanie jazvového tkaniva začína subepidermálnou vrstvou. Zlepšuje jej vaskularizáciu, zväzky kolagénových vlákien v hornej a dolnej časti brucha sa nachádzajú v drobnejšom mieste ako v tkanive jazvy bez transplantácie buniek. Existujú vlasové folikuly a mazové žľazy. Epidermis vo svojej štruktúre, po absolvovaní fázy hypertrofie, sa blíži k epidermis normálnej kože.
8. Pozorované zmeny sa týkajú keratinocytov secernovanej rastové faktory, cytokíny, ktoré zlepšujú trofismus jazvy tkaniva prispievajú k jeho transformáciu z tuhého väzivového tkaniva voľnejšie, čo vedie k zlepšeniu jazvy.

Na základe tejto štúdie možno teda vyvodiť záver, že priaznivý účinok transplantovaných keratinocytov na tkanivo jazvy, ktorý môže mať praktický význam pre rehabilitáciu pacientov s rôznymi typmi jaziev.

Táto práca na potkanoch tiež umožnila formulovať požiadavky. Na kryty rany, na ktorých sa pestujú keratinocyty.

Povlaky na rany by mali byť:

• biokompatibilné s bunkami,
• priedušný,
• majú elastickú podkladovú základňu,
• byť hydrofilné,
• pretože liečivé prísady obsahujú antibakteriálne liečivá a antioxidanty nie sú toxické pre kultivované bunky.

Klinické výsledky biotechnologickej liečby jaziev.

Skôr, N. Carver a kol. (1993) zistili, že okluzívne obväzy sú najlepšie na pripojenie na ranu a prežitie keratinocytov, ale neumožňujú tvorbu stratifikovanej (zrelej) epidermis. Na vytvorenie vrstvenej epidermis je potrebné ovzdušie. Preto po pripojení viacvrstvovej vrstvy bolo po 7 až 10 navrhnuté okluzívne prekrytie rany na odstránenie a vedenie rany pod suchými bandážami alebo vo vode rozpustnými masťami. Môžeme povedať, že kvalita a vlastnosti "substrátu", na ktorom sú bunky pestované, sú veľmi dôležité pre účinnosť transplantácie bunkového materiálu a následne pre výsledky práce lekárov. V súčasnosti však neexistuje žiadna ideálna krycia vrstva, napriek množstvu navrhnutých možností (umelá koža, netkaná textília karboxymetylcelulózy, fibrínové povlaky, polopriepustné polyuretánové filmy). Nemenej dôležitým momentom v tejto veci sú náklady na "substráty" (špeciálne povlaky na rany), pretože ich vysoké náklady zvyšujú celkové náklady na biotechnologické ošetrenie.

Účinnosť bunkových technológií bola doteraz preukázaná, ale tieto technológie sú bohužiaľ veľmi drahé, najmä v krajinách, kde nie je vytvorená priemyselná výroba bunkových kompozícií. Napriek tomu krajiny, ako napríklad Spojené štáty, už dávno vytvorili priemysel na výrobu bunkového materiálu na transplantáciu spáleného. Najmä spoločnosť BioSurface technológie Inc, od roku 1989, zvýšil 37,000 laminovaných vrstiev keratinocytov, ktoré boli použité na liečbu 240 pacientov v 79 krajinách po celom svete (R.Odessey, 1992) s 1 cm ² bunkovej kultúry stojí asi 7-8 $ US.

Technológia liečby rôznych ochorení a kožných problémov má niekoľko rozdielov, avšak v centre každej liečby bunkami je produkcia kvalitného bunkového materiálu a jeho transplantácia.

Tento proces pozostáva z nasledujúcich krokov:

• výber kože od postihnutých (alebo od darcov),
• transport kožných chlopní do biotechnologického centra,
• izolácia buniek bazálnej vrstvy a ich násobenie,
• tvorba viacvrstvových vrstiev keratinocytov (IPC).
• transplantácie bunkových kultúr.

Hlavným problémom pri liečbe transplantáciou viacvrstvových vrstiev keratinocytov je potreba životaschopných buniek vo všetkých štádiách bunkovej transplantácie. Kožné kúsky na izoláciu autológnych alebo alogénnych buniek by mali byť čo najtenšie, pretože v tomto prípade sa ľahšie oddelia pomocou mechanických a enzymatických metód a získajú sa suspenzie živých buniek na rast. Môžu byť získané odrezaním dermatómu alebo použitím kože očných viečok, predkožky, vnútorného povrchu ramena. Vzhľadom na to, že bunky sú citlivé na halogény (chlór, jód), peroxid vodíka, nemôžu byť použité pri ošetrení pokožky v čase prevzatia materiálu.

Kvantitatívny a kvalitatívny výťažok buniek z kožných štepov a účinnosť ich kultivácie tiež závisí od zdravotného stavu a veku darcu. Okrem toho by mali byť vzorky z kožných bioptických vzoriek dodané do laboratória čo najskôr av primeraných podmienkach (prostredie, teplota) doručené do certifikovaného a akreditovaného laboratória.

Eagleho médium alebo médium 199 s pridaním 10% hovädzieho séra, DMEM média doplneného 5% fetálnym hovädzím sérom a antibiotikami sa môže použiť na skladovanie a transport kožných chlopní.

V cytologickej laboratóriu je kožná biopsia najprv mechanicky rozdelená na malé kúsky, potom sa spracovanie fragmentov kože vykonáva pomocou enzýmov: trypsín, kolagenáza, dyspáza atď.

Pod pôsobením enzýmov dochádza k deštrukcii desmosómov a keratinocyty sa uvoľňujú do média ako samostatné bunky alebo agregáty pozostávajúce z rôzneho počtu buniek. Na kultiváciu sa používajú iba bazálne keratinocyty, ktoré sa pestujú na špeciálnych médiách v inkubátore obsahujúcom 5% CO, v Petriho miskách alebo v ampulkách pri t = 37 ° C. V priebehu 48 hodín sa pozoruje tvorba keratinocytových kolónií, ktoré sa postupne konvertujú na monovrstvu. Po získaní dostatočného počtu buniek sa výsledná suspenzia rozloží na kryty na rany pripravené na tento účel a umiestni sa do Petriho misiek. Z suspenzie sa najprv vytvorí monovrstva a potom viacvrstvová vrstva keratinocytov. Schématicky sú štádiá procesu kultivácie keratinocytov znázornené na obr. 12 (33,43,54,65).

Vytvorenie viacvrstvovej tvorby keratinocytov vhodných na transplantáciu zvyčajne trvá 7 až 10 dní. Niekedy je toto obdobie dlhšie, čo závisí od kvality zdrojového materiálu (vek, zdravie darcu, správnosť materiálu, kvalita použitého média atď.). Ak viacvrstvová vrstva prerastie, potom na jej povrchu môžu byť bunky s apoptóznymi javmi nevhodnými na transplantáciu. Petriho misky, ktoré sa v nich pestujú na krycích vrstvách viacvrstvovými vrstvami keratinocytov (IPC), sa dodávajú na kliniku v špeciálnych nádobách pri teplote nie nižšej ako + 15 ° C.

Modifikovaná metóda spoločnosti Green pre pestovanie IPC

V našej práci ako povlak na rany sme použili viacvrstvový cambric, opustili polypórové filmy, s ktorými sme začali pracovať na pokuse s potkanmi. Preto sa viacvrstvové vrstvy keratinocytov pestovali na prefatnom a sterilnom batistu, aj keď to nie je ani optimálne pokrytie rany.

Klinické štúdie boli vykonané na dobrovoľníkoch s dodržaním potrebných etických noriem: podpis zmluvy a informovaný súhlas.

1. Bola aplikovaná kultúra vlastná (autológna) a odobraná z bunkových (alogénnych) keratinocytov.
2. Vlastné keratinocyty boli získané z kúska pokožky, ktorá bola odrezaná z vnútra ramena pacientov.
3. Prevádzka dermabrázie jaziev sa uskutočňovala pomocou termokúpania, rotačných diskov a erbového lasera.
4. Boli použité skupiny pacientov s normotrofickými, hypotrofickými a hypertrofickými jazvami.

Technologický postup pre aplikáciu bunkovej technológie na zlepšenie typu jaziev na koži pozostával z nasledujúcich etáp:

1. Výber pacientov.
2. Vysvetlite podstatu liečby, načasovanie dosiahnutia očakávaných výsledkov, podpísanie zmluvy a informovaný súhlas.
3. Menovanie pacientov počas 2-3 týždňov pred chirurgickým zákrokom selmevit o 1t. 3-krát denne, zinkteral na 1t. 3 krát denne.
4. Odoberanie kúska kože 2,0 cm dlhé a 0,7-1,0 cm širokej od vnútornej plochy ramena, vysoko, takmer na dne axilárnej oblasti, aby sa získali autológne keratínocyty.
5. V prípade, že pacienti odmietajú izolovať svoje vlastné keratinocyty kvôli možnosti získať lineárnu jazvu na vnútornom povrchu ramena, bunkový materiál bol odobratý z bunkovej banky (alogénne keratinocyty).
6. Keratocyty boli izolované a pestované v podmienkach laboratória certifikovaného pre tento typ práce.
7. Po získaní IPC postačujúcej na transplantáciu bol deň chirurgického zákroku podaný na jazvy na klinike, kde bol materiál vložený do špeciálnych nádobiek do Petriho misiek.
8. Prebehla operácia dermabrázie brucha, hemostáza, povrchová vrstva bola premytá sterilným soľným roztokom, vysušená, po čom bol IPC transplantovaný na sterilné batistové "bunky nadol". To znamená, že bunky, ktoré boli vyššie v MIC, boli nižšie, susediace s lešteným povrchom.
9. Na hornú stranu bola umiestnená sterilná fólia, ktorá bola pripevnená na kožu elastickým obväzom alebo elastickým pásikom Omnifix. Namiesto filmu sa môžu tiež použiť indiferentné povlaky na rany obsahujúce silikón, napríklad Mepitel, Mepiform, silikónové gélové platne.

Po 5 až 7 dňoch sa film alebo silikónový povlak odstráni. V tejto dobe sa všetky keratinocyty musia plaziť na leštenú jazvu a pripevniť sa k jej povrchu.

10. Mokré prostredie vytvorené pod fóliou a silikónovým povlakom aktívne prispieva k tomu. Baptista zostávajúci na jazve od tohto bodu môže byť impregnovaný zvedavým alebo chitosanovým génom. V dôsledku toho sa na druhý deň vytvorí hustá kôra, ktorá je pre pohodlie pacienta lepšie pripevniť elastickou, vzdušne priepustnou omietkou, napríklad Omnifix. Priedušná kôra umožňuje novo vytvorenú epidermis rozlíšiť a premeniť ju na zrelú.

V závislosti od typu jazvy a hĺbky brúsenia sa obväz odmietne po 8 až 10 dňoch. Epidermia v tejto dobe má 30-40% viac bunkových vrstiev ako v normálnej kože. Bazálna membrána nie je vytvorená. Keratinocyty zosilnenej epidermy uvoľňujú do biopsie tkaniva množstvo biologicky aktívnych molekúl.

Úspech biotechnologického liečenia jaziev závisí vo veľkej miere od spôsobu, akým sa v pooperačnom období postarajú. Bunkové kultúry sú "nenápadné" krytie rán a v počiatočných obdobiach po transplantácii možno BMD ľahko oddeliť od základných tkanív. Preto sa pacientom odporúča, aby sa po operácii postarali o jazvu. Počas 8 až 9 mesiacov neotrite a ľahko pracujte s studenou vriacou vodou, aby ste sa vyhli ripovaniu z tenkej, novo vytvorenej pokožky, ktorá nemá tesné uchopenie so základnými tkanivami.

Poznámka.

Pred operáciou a pri použití dermabrasion halogenovaných oxidačných činidiel a konzervačných látok (yodopiron, sulyodopiron, iodinol, yodinat, chlórhexidín, peroxid vodíka), je prípustná aj pred transplantáciou kletok- absolútne kontraindikované vzhľadom k ich cytotoxické účinky. Toxické pre bunky sú aj metylénová modrá. Brilantne zelená.

Aby sa zabránilo infekcii, najmä pri práci s hypertrofickými jazvami, je možné ošetriť pracovné pole neomycín-sulfátom, polymyxínom alebo gentamycínom. Nemajú cytotoxický účinok na keratinocyty.

Výsledkom tohto ošetrenia je trojitý účinok.

1. Zosúladenie povrchu bachoru.
2. Vytvorte nad ňou vrstvu novej epidermy s normálnou hrúbkou.
3. Konverzia jazvy tkaniva v dermopodobnuyu pôsobením cytokínov, rastových faktorov a iných biologicky aktívnych molekúl secernovaných transplantovaných buniek a keratinocytov stimulovaných nimi, fibroblasty a makrofágy.

Jazva sa stáva menej nápaditou, pružnejšou, v nej sa objavujú póry, vlasy sa rozplývajú, pigmentácia sa môže obnoviť vďaka prítomnosti melanocytov v MPC.

Avšak všetky tieto pozitívne momenty v cicatrixu neprichádzajú okamžite. V tejto súvislosti je potrebné varovať pacientov. že proces transformácie jazvového tkaniva do dermis je pomalý a optimálny výsledok takejto liečby možno očakávať skôr ako 10-14 mesiacov. Ihneď po odmietnutí obväzu majú leštené povrchy výrazný polychróm, čím je jasnejší proces brúsenia. Najmenej poškodenie kože dochádza pri brúsení normotrofických jaziev pomocou erbového lasera. Farba jaziev a okolitej kože bola obnovená v období od 3 do 8 týždňov. Napriek týmto opatreniam niekedy dochádza k pooperačnej hyperpigmentácii, ktorá môže pokračovať nezávisle niekoľko mesiacov.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]