Nevírusová génová terapia ponúka nádej na chronickú bolesť chrbta

V nedávnej štúdii publikovanej v časopise Biomaterials výskumníci vyvinuli novú nevírusovú génovú terapiu na liečbu diskogénnej bolesti chrbta (DBP) zavedením transkripčného faktora Forkhead Box F1 (FOXF1) pomocou geneticky modifikovaných extracelulárnych vezikúl (eEV) do degeneratívnych medzistavcových platničiek (IVD) in vivo.

Chronická bolesť dolnej časti chrbta (LBP) je rastúcim globálnym problémom v dôsledku starnúcej populácie a zhoršujúcich sa problémov s opioidmi. Súčasné liečebné postupy zahŕňajú krátkodobú úľavu alebo drahé chirurgické zákroky, čo zdôrazňuje potrebu nenávykových a menej invazívnych terapií.

Súčasné biologické prístupy, vrátane podávania rastových faktorov, bunkovej terapie a génovej terapie vírusmi, môžu znížiť degeneráciu u zvieracích a ľudských modelov. Problémy, ako sú krátkodobé účinky, nízka dlhodobá účinnosť a zbytočná imunogenicita a onkogenita, však môžu brániť priamemu použitiu týchto prístupov.

V tejto štúdii výskumníci zaviedli nevírusovú génovú terapiu pre degeneráciu medzistavcových platničiek (IVD) s použitím FOXF1-eEV.

Výskumníci transfekovali primárne myšie embryonálne fibroblasty (PMEF) plazmidmi obsahujúcimi FOXF1 alebo pCMV6 ako kontrolu a charakterizovali vzorky eEV pomocou testu sledovania nanočastíc (NTA).

Účinnosť zavádzania molekulárneho nákladu do eEV hodnotili pomocou kvantitatívnej reverznej transkripcie-polymerázovej reťazovej reakcie (qRT-PCR) a konvenčnej PCR. Analýza Western blot identifikovala FOXF1 a proteíny špecifické pre EV vo formáciách eEV. Tím použil plazmidy, ktoré zosilňujú horné a dolné oblasti polylinkerov, na určenie prítomnosti plazmidovej DNA FOXF1 v darcovských bunkách a generovali eEV.

Skúmali mRNA v plnej dĺžke produkovanú z plazmidovej DNA v eEV a darcovských bunkách.

Výskumníci vytvorili extracelulárne vezikuly s transkripčnými faktormi na obnovenie funkcie tkaniva a zmenu reakcií na bolesť v zvieracom modeli DBP.

Identifikovali EV pre transport a distribúciu FOXF1 do poškodených medzistavcových platničiek v myšom modeli diskogénnej bolesti chrbta, aby určili inhibíciu degenerácie medzistavcových platničiek pomocou FOXF1 eEV.

Tím kombinoval biomechanické testovanie medzistavcových platničiek myší so zobrazovaním, zmenami extracelulárnej matrice (ECM) a reakciami na bolesť hodnotenými po 12 týždňoch, aby potvrdil zmeny v štruktúre a funkcii, ako aj bolesť vyvolané terapeutickým zásahom.

Predoperačné a pooperačné hodnotenia bolesti zahŕňali mikropočítačovú tomografiu (mikro-CT), magnetickú rezonanciu (MRI), mechanické testovanie, farbenie Alciánovou modrou (AB) a Picrosiriusovou červenou (PSR), test s dimetylmetylénovou modrou a imunohistochemické vyšetrenie (IHC).

Štúdia zahŕňala chirurgickú techniku, pri ktorej výskumníci podávali myšiam subkutánne buprenorfín ER na kontrolu pooperačnej bolesti.

Tím vykonal behaviorálne vyšetrenia pred operáciou a každé dva týždne od štyroch do dvanástich týždňov po operácii s použitím rôznych metód vrátane testu otvoreného poľa, studenej platne, zavesenia na chvost a zavesenia na drôte.

Test otvoreného poľa hodnotil spontánnu aktivitu myší; testy so studenou platňou merali tepelnú hyperalgéziu; testy zavesenia na chvoste merali axiálnu bolesť; a testy zavesenia na drôte merali silu.

Dvanásť týždňov po operácii tím preparoval bedrové chrbtice zvierat pomocou trasovania femorálnych nervov a artérií, aby identifikoval medzistavcové platničky medzi L4 a L5, L5 a L6 a L6 a S1 IVD. Použili IVD L5/L6 na posúdenie histológie a stanovenie obsahu glykozaminoglykánov (GAG).

FOXF1 eEV významne znížili reakcie na bolesť a zároveň obnovili štruktúru a funkciu medzistavcového chvosta (IVD), vrátane zlepšenej výšky disku, hydratácie tkaniva, obsahu proteoglykánov a mechanických vlastností.

Štúdia sa zamerala na uvoľňovanie eEV s obsahom FOXF1 z primárnych fibroblastov transfekovaných transkripčným faktorom FOXF1. Kvantitatívna RT PCR preukázala významný nárast hladín transkriptov mRNA FOXF1 a hladín mRNA FOXF1 v plnej dĺžke transkribovaných buniek v porovnaní s bunkami transfekovanými pCMV6.

Terapia FOXF1 eEV dokáže u myší v modeli punkcie lumbálnej platničky zmierniť bolestivé reakcie až na 12 týždňov. Samice myší vykazovali v skupine liečenej FOXF1 dlhšie záchvaty ako v skupine s poranením, ktoré trvali najmenej 12 týždňov po liečbe.

Terapia FOXF1 eEV zlepšila hydratáciu a výšku tkaniva IVD u poranených a degeneratívnych zvierat in vivo, pričom zachovala hladiny hydratácie a intenzitu T2 váženého obrazu IVD disku.

Tím však pozoroval zníženie výšky disku u poranených zvierat a zvierat liečených pCMV6 eEV. Myši liečené FOXF1 eEV nezaznamenali žiadne zníženie výšky disku 12 týždňov po liečbe. Pohlavie neovplyvnilo funkčné výsledky.

FOXF1 eEV obnovili mechanickú funkciu poškodených a degenerovaných medziobratlových dlah in vivo. Pri axiálnom strese vykazovali IVD ošetrené FOXF1 eEV vyššiu normalizovanú tuhosť NZ v porovnaní s poškodenými IVD.

Za podmienok tečenia vykazovali poškodené IVD zvýšené normalizované posuny pri tečení, čo naznačuje pokles normalizovanej elastickej tuhosti pri tečení.

Výsledky ukazujú, že zníženie obsahu GAG v poškodených medziobratlových dlahách zvyšuje mechanickú flexibilitu, ale terapia eEV zabraňuje strate glykozaminoglykánov a následným zmenám mechanickej funkcie.

FOXF1 eEV indukovali štrukturálne a funkčné zmeny v IVD zvýšením hladín proteoglykánov a GAG.

Výsledky štúdie ukázali, že eEV s vývojovými transkripčnými faktormi dokážu liečiť bolestivé ochorenia kĺbov, ako je DBP, a to dodávaním týchto transkripčných faktorov do degeneratívnych a bolestivých kĺbov pomocou IVD.

Táto stratégia môže pomôcť znížiť štrukturálne a funkčné abnormality spôsobené ochorením a regulovať reakcie na bolesť spôsobom špecifickým pre dané pohlavie.

Výskumníci tiež odporučili použitie vývojových transkripčných faktorov, ako je FOXF1, na prechod degeneratívnych NP buniek do proanabolického stavu in vivo. Na určenie jeho terapeutickej účinnosti sú potrebné ďalšie štúdie.