Nevírusová génová terapia ponúka nádej na chronickú bolesť dolnej časti chrbta

V nedávnej štúdii publikovanej v žurnálu Biomaterials výskumníci vyvinuli novú nevírusovú génovú terapiu na liečbu diskogénnej bolesti chrbta (DBP) dodaním transkripčného faktora Forkhead Box F1 (FOXF1) s použitím upravených extracelulárnych vezikúl (eEV) na degeneratívne medzistavcové platničky (IVD) in vivo.

Chronická bolesť krížov (LBP) je rastúci globálny problém v dôsledku starnutia populácie a zhoršujúcich sa problémov s opiátmi. Súčasné liečby zahŕňajú krátkodobú úľavu alebo drahé operácie, čo zdôrazňuje potrebu nenávykových a menej invazívnych terapií.

Súčasné biologické terapie, vrátane podávania rastových faktorov, bunkovej terapie a vírusových génových terapií, môžu znížiť degeneráciu na zvieracích a ľudských modeloch. Priamemu použitiu týchto metód však môžu brániť obavy, ako sú krátkodobé účinky, slabá dlhodobá účinnosť a zbytočná imunogenicita a tumorigenicita.

V tejto štúdii výskumníci zaviedli nevírusovú génovú terapiu degenerácie medzistavcových platničiek (IVD) pomocou FOXF1-eEV.

Výskumníci transfekovali primárne myšie embryonálne fibroblasty (PMEF) plazmidom obsahujúcim FOXF1 alebo pCMV6 ako kontrolu a charakterizovali vzorky eEV pomocou testu sledovania nanočastíc (NTA).

Posúdili efektívne nakladanie molekulárneho nákladu do eEV pomocou kvantitatívnej reverznej transkripčnej-polymerázovej reťazovej reakcie (qRT-PCR) a konvenčnej PCR. Analýza Western blot identifikovala FOXF1 a špecifické EV proteíny v eEV formáciách. Tím použil plazmidy, ktoré zosilňujú upstream a downstream polylinkerové oblasti, aby určil prítomnosť FOXF1 plazmidovej DNA v darcovských bunkách a vytvorili eEV.

Skúmali kompletnú mRNA produkovanú z plazmidovej DNA v eEV a darcovských bunkách.

Výskumníci vytvorili extracelulárne vezikuly s transkripčnými faktormi, aby obnovili funkciu tkaniva a upravili reakcie na bolesť na zvieracom modeli DBP.

Identifikovali EV na transport a distribúciu FOXF1 do poškodených medzistavcových platničiek v myšom modeli diskogénnej bolesti chrbta, aby určili FOXF1 eEV inhibíciu degenerácie medzistavcových platničiek.

Tím skombinoval biomechanické testovanie medzistavcových platničiek myší so zobrazovaním, zmenami extracelulárnej matrice (ECM) a reakciami na bolesť hodnotenými po 12 týždňoch, aby sa potvrdili zmeny v štruktúre a funkcii, ako aj bolesť vyvolaná terapeutickou intervenciou.

Hodnotenie bolesti pred operáciou a po liečbe zahŕňalo mikropočítačovú tomografiu (mikro-CT), zobrazovanie magnetickou rezonanciou (MRI), mechanické testy, farbenie alciánovou modrou (AB) a pikrosírovou červenou (PSR), test dimetylmetylénovou modrou a imunohistochémiu (IHC ) ).

Štúdia zahŕňala chirurgickú techniku, pri ktorej vedci subkutánne injekčne podali buprenorfín ER myšiam na kontrolu pooperačnej bolesti.

Tím vykonal hodnotenie správania pred operáciou a každé dva týždne od štyroch do dvanástich týždňov po operácii pomocou rôznych techník, ako je test na otvorenom poli, studená platnička, zavesenie chvosta a zavesenie drôtu.

Test v otvorenom poli hodnotil spontánnu aktivitu myší; testy studenej platničky merali tepelnú hyperalgéziu; Testy zavesenia chvosta merali axiálnu bolesť; a testy zavesenia drôtu merali pevnosť.

Dvanásť týždňov po chirurgickom zákroku tím rozrezal bedrové chrbtice zvierat pomocou sledovania stehenných nervov a tepien na identifikáciu medzistavcových platničiek medzi L4 a L5, L5 a L6 a L6 a S1 IVD. Použili L5/L6 IVD na vyhodnotenie histológie a stanovenie obsahu glykozaminoglykánov (GAG).

FOXF1 eEV výrazne znížili reakcie na bolesť a zároveň obnovili štruktúru a funkciu IVD vrátane zlepšenia výšky disku, hydratácie tkaniva, obsahu proteoglykánov a mechanických vlastností.

Štúdia sa zamerala na uvoľňovanie eEV naplnených FOXF1 z primárnych fibroblastov transfekovaných transkripčným faktorom FOXF1. Kvantitatívna RT PCR ukázala významný nárast hladín transkriptov mRNA FOXF1 a hladín transkribovanej mRNA FOXF1 v plnej dĺžke v porovnaní s bunkami transfekovanými pCMV6.

Terapia FOXF1 eEV môže znížiť reakcie na bolesť v modeli myši s punkciou lumbálneho disku až na 12 týždňov. Samice myší vykazovali dlhšie akvizičné časy v skupine liečenej FOXF1 ako v skupine s léziami, čo trvalo najmenej 12 týždňov po liečbe.

Terapia FOXF1 eEV zlepšila hydratáciu a výšku tkaniva IVD u zranených a degeneratívnych zvierat in vivo pri zachovaní úrovní hydratácie a intenzity obrazu IVD váženého T2.

Tím však pozoroval zníženie výšky disku u zranených zvierat a zvierat liečených pCMV6 eEV. Myši liečené FOXF1 eEV nemali žiadne zníženie výšky disku 12 týždňov po liečbe. Pohlavie neovplyvnilo funkčné výsledky.

FOXF1 eEV obnovili mechanickú funkciu poškodených a degenerovaných IVD in vivo. Pri axiálnom namáhaní IVD ošetrené FOXF1 eEV vykazovali vyššiu normalizovanú tuhosť NZ v porovnaní s poškodenými IVD.

V podmienkach tečenia vykazovali poškodené IVD zvýšené normalizované posuny tečenia, čo naznačuje zníženie normalizovanej elastickej tuhosti tečenia.

Výsledky ukazujú, že zníženie obsahu GAG v poškodených IVD zvyšuje mechanickú flexibilitu, ale terapia eEV zabraňuje strate glykozaminoglykánov a následným zmenám v mechanickej funkcii.

FOXF1 eEV spôsobil štrukturálne a funkčné zmeny v IVD zvýšením hladín proteoglykánov a GAG.

Výsledky štúdie ukázali, že eEV nabité vývojovými transkripčnými faktormi môžu liečiť bolestivé ochorenia kĺbov, ako je DBP, dodávaním týchto transkripčných faktorov do degeneratívnych a bolestivých IVD kĺbov.

Táto stratégia môže pomôcť znížiť štrukturálne a funkčné abnormality spôsobené chorobou, ako aj regulovať rodovo špecifické reakcie na bolesť.

Výskumníci tiež odporučili použiť vývojové transkripčné faktory, ako je FOXF1, na konverziu degeneratívnych NP buniek do proanabolického stavu in vivo. Na určenie jeho terapeutickej účinnosti je potrebný ďalší výskum.