Imunofenotypizácia hemoblastóz

Významný pokrok v hematologickom výskume v posledných rokoch je spojený s použitím moderných imunologických metód a automatizovaných prostriedkov na analýzu a triedenie buniek periférnej krvi a kostnej drene - prietokových cytometrov. Tradičné morfologické a cytochemické štúdie buniek substrátu ochorenia (krv, červená kostná dreň, lymfatické uzliny, slezina atď.) v mnohých prípadoch, najmä pri lymfoproliferatívnych ochoreniach, neumožňujú identifikovať celú rozmanitosť variantov medzi morfologicky podobnými formami a stanoviť zdroj pôvodu patologického klonu. Tieto problémy možno vyriešiť iba štúdiom imunologických charakteristík buniek. Každé štádium diferenciácie hematopoetických buniek zodpovedá vlastnému súboru antigénov, ktoré sa podľa medzinárodnej klasifikácie nazývajú diferenciačné a delia sa na diferenciačné zhluky, označované CD.

Pri neoplastických zmenách môže dôjsť k blokáde diferenciácie v ktoromkoľvek štádiu normálneho vývoja buniek, čo vedie k vytvoreniu klonu patologických buniek, ktoré určujú substrát ochorenia a majú rovnaké imunologické (alebo fenotypové) vlastnosti. Štúdiami týchto markerov na bunkách je možné určiť, akej forme a variantu ochorenia zodpovedajú, teda na základe imunologického fenotypu buniek vykonať diferenciálnu diagnostiku, ktorá je najťažšia pri lymfoproliferatívnych ochoreniach, pretože hlavnou bunkou patologického substrátu ochorenia sú morfologicky takmer identické bunky.

Fenotypizácia umožňuje použitie monoklonálnych protilátok na typizáciu blastových a zrelých krviniek myelo-, mono- a lymfocytárnej série na základe prítomnosti diferenciačných antigénov (receptorov) v bunkovej stene. Časť „Posúdenie imunitného stavu tela“ čiastočne popisuje charakteristiky a diagnostickú hodnotu štúdie bunkových markerov; nižšie je uvedený stručný opis antigénových markerov buniek vo vzťahu k diagnostike hemoblastóz. Na membránach krviniek a červenej kostnej drene možno detegovať nasledujúce antigény (markery).

• CD2 je monomérny transmembránový glykoproteín. Je prítomný na povrchu všetkých T-lymfocytov cirkulujúcich v krvi a na niektorých NK-lymfocytoch. CD2 sa podieľa na procese alternatívnej aktivácie T-lymfocytov. Detekcia CD2 pomocou monoklonálnych protilátok sa v klinickej praxi používa na fenotypizáciu akútnej T-bunkovej leukémie, lymfómov, chronických zápalových a imunodeficientných stavov.
• CD3 je proteínový komplex asociovaný s antigén-špecifickým T-bunkovým receptorom, je hlavným funkčným markerom T-lymfocytov. Uľahčuje prenos aktivačného signálu z membrány do bunkovej cytoplazmy. Stanovenie CD3 je indikované na diagnostiku akútnej T-bunkovej leukémie, lymfómov (CD3 sa neexprimuje v ne-T-bunkových lymfoidných neoplazmoch) a imunodeficienčných ochorení.
• CD4 je transmembránový glykoproteín exprimovaný subpopuláciou T-pomocných buniek (induktorov), ktoré tvoria 45 % lymfocytov periférnej krvi. V skorých štádiách vývoja lymfocytov v týmuse sú antigény CD4, ako aj CD8, exprimované všetkými kortikálnymi lymfocytmi. Medulárne tymocyty, ktorých fenotyp je podobný zrelým CD4+ T-bunkám periférnej krvi (T-pomocné bunky), už exprimujú buď receptory CD4, alebo CD8. V periférnej krvi až 5 % buniek nesie markery CD4 aj CD8. Menšia expresia CD4 je možná na niektorých bunkách monocytového radu. CD4 je exprimovaný vo väčšine prípadov T-bunkových lymfómov vrátane mycosis fungoides, ako aj pri T-bunkovej leukémii asociovanej s HTLV (HTLV - ľudský T-lymfotropný vírus).
• CD5 je jednoreťazcový glykoproteín prítomný na všetkých zrelých T lymfocytoch a väčšine tymocytov a je slabo exprimovaný B lymfocytmi. CD5 sa deteguje na neoplastických bunkách B-bunkovej chronickej lymfocytovej leukémie a centrocytového lymfómu. Pri iných typoch malígnych lymfoidných ochorení – folikulárnom lymfóme, vlasatobunkovej leukémii, veľkobunkovom lymfóme – sa CD5 neexprimuje.
• CD7 je jednoreťazcový proteín, najskorší marker diferenciácie T-buniek. Pro-T-lymfocyty ho exprimujú ešte pred ich migráciou do týmusu. CD7 sa deteguje na väčšine NK buniek, slabá expresia sa pozoruje na monocytoch. B-lymfocyty a granulocyty tento antigén neobsahujú. Stanovenie CD7 sa používa na diagnostiku lymfómov, detskej T-bunkovej lymfoblastickej leukémie.
• CD8 je proteín pozostávajúci z dvoch polypeptidových reťazcov spojených disulfidovými mostíkmi. Je exprimovaný subpopuláciou cytotoxických a supresorových T lymfocytov, ktoré tvoria 20 – 35 % lymfocytov periférnej krvi. Tento antigén je tiež exprimovaný NK lymfocytmi, kortikálnymi tymocytmi, 30 % dreňových tymocytov a subpopuláciou buniek červenej kostnej drene. CD8 sa skúma na kvantifikáciu obsahu T supresorov (pozri časť „Supresorové T lymfocyty v krvi“ vyššie).

• CD10 je endopeptidáza asociovaná s bunkovou membránou. CD10 je exprimovaný mladými formami B lymfocytov a subpopuláciou kortikálnych lymfocytov. CD10 je exprimovaný všetkými ALL bunkami.
• CD11c je exprimovaný na bunkovej membráne makrofágmi, monocytmi, granulocytmi, NK bunkami a bunkami vlasatobunkovej leukémie.
• CD13 je glykoproteín exprimovaný bunkami myelomonocytovej línie (progenitorové bunky, neutrofily, bazofily, eozinofily, monocyty a bunky myeloidnej leukémie). Nie je prítomný v T a B lymfocytoch, erytrocytoch a krvných doštičkách.
• CD14 je povrchový membránový glykoproteín. Je exprimovaný prevažne monocytmi a makrofágmi. CD14 je detegovaný na viac ako 95 % monocytov v periférnej krvi a kostnej dreni. Silná expresia CD14 sa pozoruje pri akútnej myeloblastovej leukémii. Tento antigén sa neexprimuje pri akútnej a chronickej lymfoblastickej leukémii.
• CD15 je oligosacharid. Podieľa sa na fagocytóze a chemotaxi. Tento antigén je prítomný na povrchu zrelých granulocytov a Berezovského-Sternbergových buniek. Expresia antigénu CD15 sa deteguje pri Hodgkinovej chorobe. Pri non-Hodgkinových lymfómoch sa CD15 vo väčšine prípadov nezistil.
• CD16 sa exprimuje na povrchu granulocytov, monocytov, makrofágov a NK buniek. Všetky lymfocyty exprimujúce tento antigén majú schopnosť protilátkovo závislej bunkovej cytotoxicity. CD16 sa stanovuje počas typizácie chronických myelocytových leukémií na charakterizáciu NK buniek.
• CD19 je glykoproteín prítomný na všetkých periférnych B lymfocytoch a všetkých prekurzoroch B-buniek. Chýba v plazmatických bunkách. Je najskorším markerom B buniek a hrá dôležitú úlohu v regulácii aktivácie a proliferácie B-buniek. CD19 je exprimovaný na všetkých neoplastických bunkách akútnej leukémie B-bunkového pôvodu a je prítomný aj v niektorých formách akútnej monoblastickej leukémie.
• CD20 je neglykozylovaný proteín. V ontogenéze B-lymfocytov sa antigén CD20 objavuje po CD19 v štádiu pre-B-bunkovej diferenciácie lymfocytov. Chýba v plazmatickej membráne plazmatických buniek. Je exprimovaný pri ALL, chronickej lymfocytovej leukémii B-buniek, vlasatobunkovej leukémii, Burkittovom lymfóme a veľmi zriedkavo pri akútnej monoblastickej leukémii.
• CD21 je glykoproteín prítomný vo významnom množstve na B-lymfocytoch v lymfoidných orgánoch a v malom množstve na B-bunkách v periférnej krvi. CD21 je receptor pre vírus Epstein-Barrovej.
• CD22 je proteín pozostávajúci z dvoch polypeptidových reťazcov. Je exprimovaný na membráne väčšiny B lymfocytov vrátane prekurzorových buniek (prolymfocytov). Antigén nie je exprimovaný na B lymfocytoch (plazmatických bunkách) po ich aktivácii. Najvýraznejšia expresia CD22 je detegovaná na bunkách vlasatobunkovej leukémie, slabá - pri myeloidnej leukémii a non-T-bunkovej ALL.
• CD23 je glykoproteín exprimovaný v oveľa vyššej miere aktivovanými periférnymi krvnými B lymfocytmi. CD23 sprostredkováva IgE-dependentnú cytotoxicitu a fagocytózu makrofágmi a eozinofilmi.
• CD25 je jednoreťazcový glykoproteín identifikovaný ako receptor s nízkou afinitou pre IL-2. Tento receptor je exprimovaný na aktivovaných T lymfocytoch a v menšej hustote na aktivovaných B bunkách. V periférnej krvi zdravých jedincov je antigén prítomný na viac ako 5 % lymfoidných buniek.
• CD29 je fibronektínový receptor. Je široko distribuovaný v tkanivách a exprimujú ho leukocyty. Detekcia CD29 na periférnych krvných bunkách sa používa na typizáciu subpopulácie T buniek s fenotypom CD4+CD29+, ktoré sa nazývajú pomocné bunky typu 2 (Th2). Tieto bunky sa zúčastňujú humorálnej imunitnej odpovede produkciou lymfokínov.
• CD33 je transmembránový glykoproteín. Je prítomný na povrchu buniek myeloidného a monocytového radu. Nachádza sa na povrchu monocytov a v menšej miere granulocytov v periférnej krvi. Približne 30 % buniek červenej kostnej drene exprimuje CD33, vrátane myeloblastov, promyelocytov a myelocytov. Antigén chýba v membránach pluripotentných kmeňových buniek. Stanovenie CD33 sa používa na charakterizáciu buniek pri leukémiách myeloidného pôvodu. Leukemické bunky lymfoidného a erytroidného pôvodu neexprimujú CD33.
• CD34 je fosfoglykoproteín exprimovaný hematopoetickými progenitorovými bunkami vrátane monopotentných kmeňových buniek. Najvýraznejšia expresia Ag sa pozoruje v skorých progenitorových bunkách; s dozrievaním buniek sa expresia markerov znižuje. CD34 sa nachádza aj na endotelových bunkách. Stanovenie CD34 sa používa na charakterizáciu buniek pri akútnych myeloblastových a lymfoblastických leukémiách. Pri chronických lymfocytových leukémiách a lymfómoch sa expresia antigénu CD34 nezistila.

• CD41a je exprimovaný krvnými doštičkami a megakaryocytmi. Monoklonálne protilátky na detekciu CD41a sa používajú na diagnostiku megakaryoblastickej leukémie. Pri Glanzmannovej trombasténii expresia tohto antigénu chýba alebo je výrazne potlačená.
• CD42b je membránový glykoproteín pozostávajúci z dvoch polypeptidových reťazcov. Marker sa deteguje na povrchu krvných doštičiek a megakaryocytov. V klinickej praxi sa detekcia CD42b používa na diagnostiku trombocytopatie - Bernard-Soulierovho syndrómu.
• CD45RA patrí do triedy transmembránových glykoproteínov. Je to bežný leukocytový antigén. Je exprimovaný na bunkovej membráne B lymfocytov, v menšej miere T lymfocytov a na zrelých dreňových tymocytoch. Tento marker nie je exprimovaný granulocytmi.
• CD45RO je nízkomolekulárna izoforma CD45RA, bežného leukocytového antigénu. Je detegovaná na T bunkách (pamäťové T lymfocyty), subpopulácii B lymfocytov, monocytoch a makrofágoch. Monoklonálne protilátky proti CD45RO interagujú s väčšinou tymocytov, subpopuláciou pokojových CD4+ a CD8+ T lymfocytov a zrelými aktivovanými T bunkami. Tento antigén nesú aj bunky myelomonocytového pôvodu, granulocyty a monocyty. Je detegovaná v centroblastických a imunoblastických lymfómoch.
• CD46 je O-glykozylovaný dimér. Je široko distribuovaný v tkanivách a je exprimovaný T a B lymfocytmi, monocytmi, granulocytmi, NK bunkami, krvnými doštičkami, endotelovými bunkami a fibroblastmi, ale chýba na povrchu červených krviniek. CD46 poskytuje ochranu tkaniva pred komplementom.
• CD61 je krvný antigén. Je exprimovaný na krvných doštičkách periférnej krvi a červenej kostnej drene, ako aj na megakaryocytoch a megakaryoblastoch. Jeho stanovenie sa používa ako marker pri akútnej megakaryoblastickej leukémii. Expresia antigénu chýba alebo je potlačená u pacientov s Glanzmannovou trombasténiou.
• CD95, tiež nazývaný Fas alebo APO-1, je transmembránový glykoproteín, člen rodiny receptorov tumor nekrotizujúceho faktora. Je exprimovaný vo významnom množstve na T lymfocytoch (CD4+ a CD8+) v periférnej krvi a v menšej miere na B lymfocytoch a NK bunkách. Tento antigén je tiež exprimovaný na granulocytoch, monocytoch, tkanivových bunkách a neoplastických bunkách. Väzba CD95 na Fas ligand (CD95L) indukuje apoptózu v bunkách.
• CD95L alebo Fas ligand je membránový proteín patriaci do rodiny receptorov faktora nekrózy nádorov. Tento antigén je exprimovaný cytotoxickými T lymfocytmi, NK bunkami a veľmi často aj nádorovými bunkami; je hlavným induktorom apoptózy v bunkách.
• HLA-DR je monomorfný determinant molekúl triedy II ľudského hlavného histokompatibilného komplexu (HLA). Marker je exprimovaný na Langerhansových bunkách, dendritických bunkách lymfoidných orgánov, určitých typoch makrofágov, B lymfocytoch, aktivovaných T bunkách a epitelových bunkách týmusu. Štúdium tohto markeru sa používa na kvantitatívne stanovenie aktivovaných T lymfocytov s fenotypom CD3+ HLA-DR+.

Pomocou rôzneho výberu monoklonálnych protilátok proti markerom je možné vytvoriť fenotypový portrét buniek charakteristických pre danú formu leukémie.

Okrem použitia imunofenotypizačných metód na diagnostiku a diferenciálnu diagnostiku hemoblastóz sa ukázalo ako obzvlášť dôležité ich použitie v liečebnom procese na posúdenie stavu remisie a zvyškovej populácie leukemických buniek. Znalosť fenotypového „portrétu“ blastových buniek počas obdobia diagnózy umožňuje tieto markery detekovať bunky leukemického klonu počas obdobia remisie a zvýšením ich počtu predpovedať rozvoj relapsu dlho pred (1-4 mesiace) objavením sa jeho klinických a morfologických príznakov.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]