Mesenchymálne kmeňové bunky

Medzi regionálne kmeňové bunky zaujímajú mesenchymálne kmeňové bunky (MSC) osobitné miesto, ktorého deriváty tvoria stromálnu matricu všetkých orgánov a tkanív ľudského tela. Prioritou výskumu MSC patrí zástupca ruskej biologickej vedy.

V polovici minulého storočia v laboratóriu Friedenstein bol prvýkrát izolovaný homogénny kultúry multipotentních stromálne kmeňové bunky kostnej drene. Mezenchýmových kmeňové bunky prichytené k podkladu po dlhú dobu zachovaná vysokej rýchlosti proliferácie a kultúry pri nízkej hustote očkovacieho po fixácii na podklade vytvorenom z fibroblastových bunkových klonov, ktoré nemajú fagocytárnu aktivitu. MSC proliferácia Zastavenie dokončili ich spontánna diferenciáciu in vitro do kostných buniek, tukových, chrupavky, svalu alebo spojivového tkaniva. Ďalšie štúdie ukázali, osteogénny potenciál podobných fibroblastom stromálnych buniek kostnej drene z rôznych druhov cicavcov, ako aj aktivita tvoriť kolónie. Pri pokusoch in vivo bolo preukázané, že ako hetero- a ortotopické transplantácii fibroblastov kolónie tvoriaca bunky je dokončené tvoria kosť, chrupavku, a vláknité tukového tkaniva. Vzhľadom k tomu, stromálnych kmeňových buniek kostnej drene, vyznačujúci sa vysokou kapacitou pre samoobnovy a diferenciácie kontrapunkte v rámci rovnakej bunkové línie, ktoré sa nazývajú multipotentní mezenchýmových progenitorové bunky.

Treba poznamenať, že za 45 rokov základného výskumu mezenchymálnych kmeňových buniek boli vytvorené reálne podmienky na používanie ich derivátov v klinickej praxi.

Dnes je nepochybné, že všetky tkanivá ľudského tela sú tvorené z kmeňových buniek rôznych bunkových línií ako dôsledok procesov proliferácie, migrácie, diferenciácie a dozrievania. Nedávno sa však predpokladalo, že kmeňové bunky v dospelom tele sú tkanivovo špecifické, to znamená, že sú schopné produkovať špecializované bunkové línie iba tkanív, v ktorých sú umiestnené. Táto konceptuálna situácia bola vyvrátená faktami transformácie hematopoetických kmeňových buniek nielen do bunkových prvkov periférnej krvi, ale aj do oválnych buniek pečene. Okrem toho a nervové kmeňové bunky boli schopné vyvolať neuróny a gliové elementy, rovnako ako skoré oddelené linie hematopoetických progenitorových buniek. Mesenchymálne kmeňové bunky, ktoré zvyčajne produkujú bunkové prvky kostnej hmoty, chrupavky a tukového tkaniva, sú schopné transformovať sa do neurálnych kmeňových buniek. Predpokladá sa, že v procese rastu, fyziologickej a reparačnej regenerácie tkanív sa vytvárajú nezáväzné progenitorové bunky z tkanivovo špecifických zásob stoniek. Napríklad, oprava svalového tkaniva sa môže uskutočniť pomocou mezenchymálnych kmeňových buniek, ktoré migrujú z kostnej drene do kostrových svalov.

Hoci také cross zameniteľnosť kmeňové bunky rozpoznať nie všetkým výskumným pracovníkom možnosť klinického využitia mezenchymálnych kmeňových buniek ako zdroj pre transplantáciu buniek a buniek vektora genetickej informácie nespochybnila ako multipotentní stromálnych kmeňových buniek kostnej drene, ktoré môžu byť pomerne ľahko izolovať a šíri v kultúre in vitro. Zároveň sa v odbornej literatúre stále objavujú správy o potenciáli pluripotentných kmeňových buniek podporné väzivové tkanivá kostnej drene. Ako dôkaz prezentované výskumných protokoloch, ktoré pod vplyvom určitých induktorov transdiferenciace MSC sú prevedené do nervových buniek, kardiomyocytov a hepatocytoch. Avšak niektorí vedci možnosť znovu aktivácie a expresie génu v ranom embryogenézy v vážne pochybnosti. V rovnakej dobe, každý chápe, že ak sa zistí podmienky pre rozšírenie multipotentní mezenchymálnych kmeňových buniek na pluripotence HSR v regeneratívnej medicíne a plastov automaticky vyriešiť veľa problémov etické, morálne, náboženské a právnej povahy. Okrem toho, pretože v tomto prípade je zdroj kmeňových regeneračné schopnosti pacienta sú autológne stromálne bunky sa rieši a problém imunitného odmietnutie transplantácie buniek. Ako skutočné sú tieto vyhliadky, v blízkej budúcnosti sa ukáže.

[1], [2]

Použitie mezenchymálnych kmeňových buniek v medicíne

Použitie klinika derivátov mezenchymálnych kmeňových buniek je spojené predovšetkým so znížením defektov tkaniva spôsobené rozsiahlych a hlbokých tepelných lézií kože. Predklinické experimentálne overenie vhodnosti alogénne fibroblastových podobných mezenchymálnych kmeňových buniek pre liečbu hlbokých popálenín bola vykonaná. Je dokázané, že fibroblasty podobné kostnej drene mezenchymálnych kmeňových buniek tvoria monovrstvy v kultúre, takže je možné ich transplantovať optimalizovať regeneráciu hlbokých popálenín. Autori poznamenávajú, že podobné vlastnosti majú embryonálnych fibroblastov, ale klinická aplikácia to je obmedzené na existujúce etické a právne problémy. Pri potkanoch Wistar sa modelovalo hlboké tepelné popálenie s poškodením všetkých vrstiev kože. Plocha horíka bola 18-20% z celkového povrchu kože. V prvej pokusnej skupiny sa skladal z potkanov s hlbokým tepelného poškodenia a transplantácia alogénnych fibroblastov odvodených od mezenchymálnych kmeňových buniek. Druhá skupina sa skladala zo zvierat s hlbokými popáleninami a trans-plantáží alogénnych embryonálnych fibroblastov. Tretia skupina kontrolných krýs bola opatrená hlbokú tepelným poškodením, ktoré nevykonala bunkovej terapie. Suspenzie fibroblasty odvodený z mezenchymálnych kmeňových buniek a embryonálnych fibroblastoch bola aplikovaná na popáleniny povrchom napipetuje v množstve 2 x 10 ⁴ buniek na 2. Deň po jeho excízii modelovanie vyhorení a nekrotické krusty vytvorené. Po transplantácii, bunky horieť povrch pokrytý gázou namočenou vo fyziologickom roztoku chloridu sodného s gentamycínu. Plotové bunky kostnej drene k získaniu MSCS s následnou indukciou fibroblastov línie mezenchýmových kmeňových buniek produkovaných u dospelých krýs Wistar z stehennej kosti. Embryonálne fibroblasty sa získali z pľúc 14-17 dní starých embryí. Embryonálne fibroblasty a bunky kostnej drene pre získanie pre-MSC boli kultivované v Petriho miskách pri teplote 37 ° C v C02 iikubatore, v atmosfére s 5% CO2 pri 95% vlhkosti. Embryonálne fibroblasty boli kultivované po dobu 4-6 dní, zatiaľ čo v prípade tvorby monovrstvy MSC požadované od 14 do 17 dní. Následne MSC udržuje kryokonzervácii ako východiskový materiál pre fibroblastových odvodeného mezenchýmových kmeňových buniek, ktoré boli pripravené podľa rozmrazení a kultivácie MSC po dobu 4 dní. Počet fibroblastových generované mezenchymálnych kmeňových buniek je viac ako 3 krát počet embryonálnych fibroblastoch vzniknutých počas rovnakého obdobia kultivácie. Pre identifikáciu buniek v transtslantirovannyh popálenín v kroku kultivácie ich genómom označené pomocou vírusového shuttle vektora na báze rekombinantnej adenovírus kódujúci V typ nosiča 1 aS-2 génu beta-galaktozidázy E.coli. Živé bunky v rôznych časoch po transplantácii detekovaná imunohistochemicky na zmrazených rezoch sa pridá substrát X-gal, čím charakteristickú modro-zelenej farby. V dôsledku vizuálnej dynamiky, polohového a histologické hodnotiace stav popálenín, bolo zistené, že dokonca na 3. Deň po transplantácii buniek v oddelených skupinách sa objaví významné rozdiely v priebehu procesu hojenia rán. Obzvlášť odlišný, tento rozdiel sa stal 7. Deň po transplantácii buniek. Zvieratám prvej skupiny, ktoré boli transplantované fibroblastov-ako mezenchýme kmeňové bunky, rana získal rovnomerne ružovej intenzívne farby, granulačné tkanivo vzrástla po celej svojej ploche na úrovni epidermis, a vypáliť plocha je podstatne zmenší. Niekoľko vytvorená tenšie kolagénové fólie na povrchu rany, ale ona pokračovala pokryť celú plochu horieť. Zvieratám druhej skupiny, ktoré boli transplantované embryonálne fibroblasty, granulačné tkanivo sa zdvihne na úroveň epidermis okraje rany, ale len v niektorých miestach, zároveň plazmoreya z rany bola intenzívnejšie ako v skupine 1, a najprv vytvoria kolagénové fólie prakticky zmizol. U zvierat, ktorá nedostala terapie kmeňových buniek, v 7. Deň vypaľovanie rany bol svetle, vykôstkovaných, nekrotické tkanivo, potiahnuté fibrínu. Na povrchu horíka bola zaznamenaná plazmopatia. Histologicky zvieratá 1. A 2. Skupiny bolo preukázané zníženie bunkovej infiltrácie a vývoj cievach, tieto príznaky začínajúcej proces regenerátora boli závažnejšie u potkanov v skupine 1. V kontrolnej skupine vykazovali známky bunkovej infiltrácie operačnej rany, histologické vzor novovytvorených krvných ciev neprítomnej. 15-30 tý deň pozorovania zvieratá 1. Plochy skupina vyhorenia bol výrazne menší ako u potkanov iných skupín a granulačné povrch bol viac rozvinutý. U zvierat z 2. Skupiny vypaľovania povrchu sa tiež znížila v porovnaní s veľkosťou popálenín v kontrolnej skupine krýs, ktorá bola vzhľadom k okrajovej epitelizácie. V kontrolnej skupine povrchovo miesta vypaľovanie zostal svetle granulácie s vzácne, na nich uvedené žilky, ostrovčeky boli fibrinózní doska pokračuje mierny plazmoreya cez horenia povrchu, niečo, čo je ťažké odnímateľný chrastavitosť zostala. Všeobecne platí, že zvieratá zo skupiny 3, tiež znižuje veľkosť rany, ale rana zostal podrytymi okraj.

Takže počas porovnávacia štúdia hojenia rán ceny použitím fibroblastov odvodených od mezenchymálnych kmeňových buniek a fibroblastov plodu, a bez použitia bunkovej terapie označený zrýchlenie hojenia popálenín povrchu v dôsledku transplantácie fibroblastových odvodených od mezenchymálnych kmeňových buniek a embryonálnych fibroblastov. Avšak, v prípade použitia alogénnych mezenchymálnych kmeňových buniek fibroblastov hojenie rýchlosť bola vyššia ako v transplantáciu embryonálnych fibroblastov. To sa prejavuje v zrýchľujúcej sa zmenou regeneračných fáz procesu - na zníženie bunkovej infiltrácie obdobia, zvyšuje mieru proliferácie cievnych sietí, rovnako ako tvorbu granulačného tkaniva.

Výsledky dynamickej planimetrie naznačujú, že miera spontánneho hojenia rany (bez použitia bunkovej terapie) bola najnižšia. V 15. A 30. Dňom po transplantácii alogénnych mezenchymálnych kmeňových buniek fibroblastov hojenie rýchlosť bola vyššia ako pri transplantácii embryonálnych fibroblastov. Histochemické metódy pre detekciu beta-galaktozidázy ukázala, že po transplantácii podobných fibroblastom mezenchýmových kmeňových buniek a embryonálnych fibroblastov po celú dobu pozorovania na povrchu a hlbokých rán regenerujúcich transplantovaných buniek zostávajú životaschopné. Autori predpokladajú, že vyššia rýchlosť horenia regenerácie rán pomocou mezenchymálnych kmeňových buniek fibroblastov podmienečné prepustenie týchto bunkách počas zrenia rostostimuliruyushih bioaktívnych faktorov.

Transplantácia autológne alebo alogénne keratinocyty a alogénne fibroblasty na liečbu popálenín a použité v klinickej praxi. Je potrebné poznamenať, že chirurgická liečba detí s rozsiahlymi hlbokými popáleninami je zložitá úloha vzhľadom k vysokej početnosti traumatologických a chirurgických zákrokov významnú stratu krvi, na základe rôznych reakcií používaných infúzie media. Hlavné problémy pri vykonávaní kože a plastickej chirurgie s rozsiahlymi hlbokými popáleninami, plocha viac ako 40% povrchu tela, vzhľadom na závažnosť svojho stavu a nedostatok zdrojov darcovskej kože. Použitie pletiva štepov s veľkým pomerom perforačné nerieši problém, pretože obraz po epiteliziruyutsya buniek perforácie je veľmi pomalý a často kožné štepy lyžujú alebo suché. Také povlaky popálenín je ksenokozha, mŕtveho štepu, syntetické filmové povlaky nie sú vždy dostatočne účinné, takže vývoj nových metód pre ukončenie horenia povrchových vrstiev kultivovaných keratinocytov a fibroblastov. Najmä spôsob uzatvárania vypaľovania povrchy pomocou kultivovanú allofibroblastov poskytuje počas transplantácie výrazný stimulačný efekt na proliferáciu epidermotsitov konzervované v okraje rany u popálenín, a keratinocytov štepy mesh pásov. V práci L. Budkeviča a spoluautorov (2000) sú prezentované výsledky aplikácie tejto metódy na liečbu popálenín u detí. 31 detí s tepelnou traumou vo veku od 1 do 14 rokov bolo pod dohľadom. Na tri deti celkovej ploche popálenín IIIA-B - IV stupňa bola 40%, 25 - 50 - 70%, a to aj na tri - 71-85% povrchu tela. Skorá chirurgická nekrosektómia bola kombinovaná s transplantáciou kultivovaných allof fibroblastov a autodermoplastiky. V prvom manipulačným stupni bol vykonaný nekrotické tkanivo vyrezanie, druhý - na transplantáciu kultivované allofibroblastov nosného filmu, tretí (48 hodín po transplantácii kultivované allofibroblastov) - odstránenie matrice a kožné klapky sa autodermoplasty pomere perforácia 1: 4. Traja pacienti, ktorí boli prijatí na kliniku s ťažkým popáleninovým ochorením, boli kultivované alopové fibroblasty transplantované do granulačných rán. Transplantácia kultivovaných alo-fibroblastov bola uskutočnená jedenkrát u 18 detí, dvakrát za 11 a trikrát u dvoch pacientov. Plocha povrchu rany pokrytá bunkovou kultúrou bola od 30 do 3500 cm2. Účinnosť kultivovaných allofibroblastov hodnotené celkovým percentom štepu kožných lalokov, doba hojenia popálenín a počtu úmrtí závažné tepelné poranenia. U 86% pacientov bola integrácia transplantátov kompletná. Čiastočná neexistencia kožných chlopní bola zaznamenaná v 14% prípadov. Napriek pokračujúcej liečbe zomrelo šesť (19,3%) detí. Celková plocha postihnutia kože bola v nich od 40 do 70% povrchu tela. Transplantácia kultivovaných allo-fibroblastov nebola spojená so smrteľným výsledkom poranenia horúčky u žiadneho pacienta.

Analyzovanie výsledkov liečby, autori poznamenávajú, že predchádzajúce popáleniny nezlučiteľné so životom, na liečbu hlbokej tepelné poškodenie plochy pokožky 35-40% povrchu tela (pre malé deti - až 3 roky - sú kritické hlboké popáleniny o rozlohe 30%, pre staršie deti vek - viac ako 40% povrchu tela). Keď je chirurgický transplantácia kultivovaných nekrektomie allofibroblastov autodermaplasty a následnú kožné štepy s veľkými popáleninami, perforácia faktor IIIB - IV stupňa zostáva kritická, ale v súčasnej dobe existujú vyhliadky v mnohých prípadoch zachrániť život aj tieto obete. Chirurgická nekrektomie v spojení s transplantáciou kultivovaných allofibroblastov a autodermaplasty u detí s hlbokými popáleninami sa ukázala byť obzvlášť účinná u pacientov s pokročilou léziami kože s deficitom darcovských stránok. Aktívne chirurgické taktikou a presádzanie kultivované allofibroblastov podporujú rýchle stabilizáciu celkového stavu týchto pacientov, zníženie počtu infekčných komplikácií horenia ochorení, vytvára priaznivé podmienky pre uchytiť sa, skrátenie doby potrebnej k obnoveniu stratenej kože a trvanie liečby v nemocnici, zníženie výskytu úmrtia u pacientov s rozsiahlych popálenín. Tak, transplantácia kultivovaných allofibroblastov nasleduje autodermaplasty kožné klapky dosahuje zotavenie u detí s ťažkými popáleninami, ktoré boli predtým považované za stratení.

Všeobecne sa uznáva, že primárnym cieľom liečby ochorenia horieť je maximalizovať úplné a rýchle zotavenie poškodenej kože, aby sa zabránilo výsledným toxickým účinkom, infekčným komplikáciám a dehydratácii tela. Výsledky aplikácie kultivovaných buniek vo veľkej miere závisia od pripravenosti na transplantáciu samotnej rany. V prípade transplantácie kultivovaných keratinocytov na povrchu rany po chirurgickom nekrektomii prizhivlyaetsya v priemere o 55% (podľa plochy) transplantovaných buniek, pričom granulačné rany uchytiť sa rýchlosť je znížená na 15%. Preto úspešná liečba rozsiahlych hlbokých popálenin vyžaduje predovšetkým aktívnu chirurgickú taktiku. Za prítomnosti stupňov IIIB-IV horieť rany sa horiaci povrch ihneď uvoľní z nekrotických tkanív, aby sa znížili účinky intoxikácie a znížil sa počet komplikácií pri popálení. Použitie takejto taktiky je kľúčom k zníženiu času od okamihu spálenia až po uzatvorenie rán a dĺžky pobytu pacientov s rozsiahlymi popáleninami v nemocnici, a tiež významným znížením počtu úmrtí.

Prvé správy o úspešnom používaní kultivovaných keratinocytov na pokrytie horiaceho povrchu sa objavili na začiatku osemdesiatych rokov minulého storočia. Následne sa táto manipulácia uskutočnila pomocou vrstiev kultivovaných keratinocytov, ktoré sa najčastejšie získavajú z buniek, oveľa menej často zo všetkých keratocytov. Avšak technológia autokeratínocytoplastiky neumožňuje vytvorenie bunkovej banky, kým čas potrebný na vytvorenie dostatočného štepu z keratinocytov je veľký a dosahuje 3-4 týždne. V tomto období narastá riziko vzniku infekčných a iných komplikácií pri popálenín, čo výrazne predlžuje celkovú dĺžku pobytu pacientov v nemocnici. Navyše prakticky žiadna autokeratinotsity prizhivlyayutsya transplantácie pre granulačného spálenín a vysoké náklady na špecializovaných rastového média a jeho biologicky aktívne stimulátory rastu keratinocyte významne obmedzuje ich klinické použitie. Ďalšie biotechnologické metódy, ako je kolagenoplastika, transplantácia kryokonzervovaných xenoidov a použitie rôznych biopolymérových povlakov zvyšujú účinnosť liečby rozsiahlych povrchových, ale nie hlbokých popálenín. Spôsob povliekania povrchu rany kultivovanými fibroblastmi je zásadne odlišný v tom, že hlavnou zložkou buniek kultivovaných buniek nie sú keratinocyty, ale fibroblasty.

Predpokladom pre vývoj spôsobu slúži ako dôkaz, že pericyty, ktoré obklopujú malé cievy sú Pro- genitornymi mezenchýme bunky schopné premeniť fibroblasty, ktoré produkujú rad rastových faktorov a poskytujú hojenie rán kvôli silnej stimulačný účinok na proliferáciu a adhéziu keratinocytov. Použitie kultivovaných fibroblastov pre uzatvorenie rany plôch okamžite identifikovať množstvo významných výhod tejto metódy pri využívaní kultivovaných keratinocytov. Najmä príprava fibroblastov v kultúre nevyžaduje použitie špeciálnych kultivačných médiách a rastových stimulátorov, čo znižuje náklady na transplantáciu viac ako 10 krát náklady na získanie keratinocyty. Fibroblasty sú ľahko podrobené pasážovania, pri ktorej sa čiastočne stráca svoje povrchové histokompatibilný antigény, čo umožňuje použiť na výrobu alogénnych transplantátov buniek a vytvárať svoje banky. Skracuje prijímacie transplantácia, vhodné na použitie v klinike, z 3 týždne (keratinocytov) 1-2 dni (pre fibroblasty). Primárne kultúry fibroblastov je možné získať kultiváciou buniek z fragmentov kože odobratých v autodermoplasty a bunková hustota siatie Po obdržaní subkultúr ľudských fibroblastov je len 20 x 10 ³ na 1 cm ².

Pre štúdium účinku fibroblastov a ich regulačných proteínov v proliferáciu a diferenciáciu keratinocytov, porovnávaciu analýzu vlastností a morfológiu proliferáciu keratinocytov na substrátoch kolagénu typu I a III a fibronektín v ko-kultúre s ľudskými fibroblasty. Ľudské keratínocyty boli izolované z fragmentov kože pacientov s popáleninami, ktoré boli odobraté počas operácie autodermoplastiky. Hustota keratinocytov bola 50 x 103 buniek na cm2. Klinická účinnosť transplantácie kultivovaných fibroblastov bola hodnotená u 517 pacientov. Všetci pacienti boli rozdelení do dvoch skupín: 1. - dospelí postihnutí popáleninami IIA, B - IV stupeň; 2. - deti s hlbokými popáleninami stupňa IIIB - IV. Posúdenie dynamiky štruktúrne a funkčné organizáciu jednovrstvové kultúry fibroblastov, pokiaľ ide o úlohu v procese regenerácie glykozaminoglykánov, fibronektín, kolagén, a nechá autori určiť tretí deň ako najvhodnejšie z hľadiska použitia fibroblastových kultúr na výrobu transplantácií. Skúmanie vplyvu na proliferáciu a diferenciáciu keratinocytov fibroblastov ukázali, že za fibroblasty in vitro majú výrazný stimulačný účinok, a to predovšetkým na keratinocytov adhéznych procesoch, zvyšuje počet adherentních buniek a rýchlosť stanovenie viac ako 2 krát. Stimulácia adhéznych procesov je sprevádzaná zvýšením intenzity syntézy DNA a úrovne proliferácie keratinocytov. Ďalej bolo zistené, že prítomnosť fibroblastov a extracelulárnej matrix tvorené nich je predpokladom pre vznik tonofibrillyarnogo zariadenie keratinocytov medzibunkových spojení, a v konečnom dôsledku k diferenciácii keratinocytov a tvorbu bazálnej membrány. Pri liečbe detí s hlbokými popáleninami založená klinickú účinnosť transplantácie allofibroblastov kultúry, a to najmä u pacientov s rozsiahlymi léziami darcovských kože miestach v deficite. Komplexné morfofunktcionalnoe štúdia ukázala, že vrúbľované vyznačujúci fibroblasty aktívny syntéza DNA, rovnako ako kolagén, fibronektín a glykosaminoglykánová, ktoré sú generované v bunkách extracelulárnej matrix. Autori predpokladajú, vysoké percento uchytiť sa transplantovaných fibroblastov (až 96%), čo je výrazné zníženie, pokiaľ ide o ich príprave (v priebehu 2-3 hodín namiesto 24-48 týždňov v prípade keratinocytov), podstatné zrýchlenie epitelizáciu vypaľovanie povrchu, a významné zníženie ceny (v 10 krát) technológie pestovania štepu z fibroblastov v porovnaní s transplantáciou keratinocytov. Použitie transplantácia kultivovaných allofibroblastov umožňuje zachrániť životy detí s kritickými popáleninami - tepelným poškodením viac ako 50% povrchu tela, ktorá sa predtým myslelo nezlučiteľné so životom. Je pozoruhodné, že alogénna transplantácia embryonálnych fibroblastov tiež presvedčivo dokázal nielen rýchlejšiu regeneráciu rán a pacientov rekondičné s rôznym stupňom popálenín a okolie, ale aj podstatné zníženie úmrtnosti.

Autológne fibroblasty sa používajú v takej komplikovanej a plastickej chirurgie, ako poškodenie korekčné náhradný hlasivkách. Zvyčajne sa používa na tento účel bovinného kolagénu, trvanie účinku, ktorá je obmedzená jeho imunogenicity. Ako cudzí proteín, hovädzie kolagén, kolagenáza citlivé na príjemcu a môže vyvolať imunitné reakcie, aby sa znížilo riziko, ktoré technológie kolagénových prípravkov boli vyvinuté, sieťovaný glutaraldehydom. Ich výhodou je väčšia stabilita a nižšie imunogenicita, ktorá našla praktické uplatnenie v odstraňovaní vád a hlasiviek atrofia. Autológne kolagénové injekcie boli prvýkrát použité v roku 1995. Metódy za predpokladu zachovania primárny štruktúry autológnych kolagénových vlákien, vrátane enzymaticky katalyzovaná intramolekulárny zosieťovania. Skutočnosť, že prírodné kolagénové vlákna sú odolnejšie proti degradácii proteázami ako rekonštituovaných kolagénových telopeptídov, kde rez. Integrita telopeptídov dôležité pre kvartérne štruktúru kolagénových vlákien a zosieťovania medzi susediacimi molekulami kolagénu. Na rozdiel od prípravkov bovinného kolagénu, autológna kolagén nespôsobuje imunitné reakcie u príjemcu, ale nie je dostatočne účinný ako výplne činidlo. Trvalé korekcia môže byť dosiahnutá v dôsledku miestnej produkcie autológnej transplantácie kolagénu fibroblasty. Vyšetrovanie však efektivity transplantácie autológnych fibroblastov v klinike odhalilo niektoré ťažkosti. V ranom období po transplantácii fibroblastov klinického účinku bola slabšia v porovnaní so, že po podaní hovädzieho kolagénu. Keď kultivované autológne fibroblasty nemožno vylúčiť možnosť transformácie normálnych fibroblastov v normálnej, tak zvané myofibroblasty, zodpovedné za vývoj fibrózy a jaziev, ako dokladá zníženie kolagénového gélu, vzhľadom na osobitnú interakciu fibroblastov a kolagénových fibríl. Ďalej, po sériovej pasážovania fibroblasty in vitro strácajú svoju schopnosť syntetizovať proteíny extracelulárnej matrix.

Avšak, v súčasnej dobe experimentálnej techniku dokonalosti kultivácia ľudských autológnych fibroblastov, ktorý odstraňuje vyššie uvedené nevýhody a vedie k onkogénnu transformácie normálnych fibroblastov. Autológne fibroblasty získané touto metódou sa používajú na vyplnenie defektov mäkkých tkanív tváre. V štúdii H. Kellera a spoluautorov (2000) bolo liečených 20 pacientov vo veku 37 až 61 rokov s vráskami a atrofickými jazvami. Kožné biopsia (4 mm) BTE oblasť sme transportovať do laboratória v sterilných skúmaviek, obsahujúcich 10 ml kultivačného média (Dulbecco antibiotikum mikoseptikom, pyruvát a fetálneho bovinného séra). Materiál bol umiestnený vo vnútri 3-5 kultivačných misiek s priemerom 60 mm a inkubovaných v termostate s atmosférou obsahujúcou 5% C02. Po 1 týždni boli bunky odstránené z misiek trypsinizáciou a umiestnené do 25 cm2 ampuliek. Bunky sú podávané pacientom v množstve 4 x 107. Významnú a dlhotrvajúci klinický účinok bol pozorovaný u pacientov s korekciou nasolabiálních záhyby, a u pacientov s jazvami po 7 a 12 mesiacov po tretej transplantácii autológnych fibroblastov. Podľa prietokovej cytometrie produkovali kultivované fibroblasty veľké množstvo kolagénu typu I. V štúdiách in vitro je znázornená normálna kontraktilita injekčných fibroblastov. Dva mesiace po subkutánnom podaní kultivovaných fibroblastov v dávke 4 x 107 buniek sa nezistili nahé myši. Injekčné fibroblasty nespôsobujú tvorbu jaziev a difúznu fibrózu u pacientov. Podľa autora sú implantované autológne fibroblasty schopné neustále produkovať kolagén, ktorý poskytne kozmetický omladňujúci účinok. V tomto prípade, pretože životnosť diferencovaných buniek je obmedzená, fibroblasty odobraté od mladého pacienta sú účinnejšie ako tie, ktoré sa dosiahli u starších ľudí. V budúcnosti sa predpokladá, že možnosť kryokonzervácie fibroblastovej kultúry od mladého darcu neskôr transplantuje staršiemu pacientovi svoje vlastné mladé bunky. Záverom možno povedať, že nie je úplne správne záver, že autológne fibroblasty, že ich funkčné bezpečnosť sú ideálne pre korekciu tváre defektov mäkkých tkanív. Zároveň autor sám poznamenáva, že v procese výskumu vznikli aj problematické situácie spojené s používaním autológového fibroblastového kolagénového systému. Klinický účinok bol často slabší ako pri použití kolagénu hovädzieho dobytka, čo spôsobilo sklamanie u pacientov.

Vo všeobecnosti údaje z literatúry o vyhliadkach na klinické použitie mezenchymálnych kmeňových buniek vyzerajú celkom optimisticky. Pokúšajú sa použiť autológne multipotentné mezenchýmové progenitorové bunky kostnej drene na liečenie degeneratívnych kĺbových lézií. Uskutočnili sa prvé klinické skúšky kultivovaných mezenchymálnych progenitorových buniek pri liečbe komplexných fraktúr kostí. Autológne a alogénne mezenchýmových bunky strómy kostnej drene kostí použité na generovanie chrupavkového tkaniva pre transplantáciu do opravy defektov kĺbovej chrupavky v dôsledku traumy, alebo autoimunitných lézie. Praktizované metódy klinickej aplikácie multipotentních mezenchýmových progenitorov na odstránenie kostných defektov u detí s ťažkou pokroku osteogenesis spôsobené mutáciami génu kolagénu typu I. Po mieloabelyatsii deti-príjemcov transplantovanej kostnej drene od HLA-kompatibilný zdravého darcu ako nefrakcionovaného kostnej drene môže obsahovať dostatočné množstvo mezenchymálnych kmeňových buniek na doplnenie ťažkú kostného defektu. Po transplantácii alogénnej kostnej drene mali také deti pozitívne histologické zmeny v trabekulárnych kostiach, zvýšenie rýchlosti rastu a zníženie výskytu zlomenín kostí. V niektorých prípadoch sa dosiahne pozitívny klinický výsledok transplantáciou úzko súvisiacej alogénnej kostnej drene a osteoblastov. Pre liečenie vrodené krehkosti kostí v dôsledku nerovnováhy osteoblastov a osteoklastov v kosti, a použité transplantácie MSC. Obnovenie tvorby kostí v tomto prípade je dosiahnuté v dôsledku chimerizácie zásoby stonkových a progenitorových stromálnych buniek v kostnom tkanive pacientov.

Metódy genetickej modifikácie darcovských mezenchymálnych kmeňových buniek sa zlepšujú kvôli náprave genetických defektov stromálnych tkanív. Predpokladá sa, že mezenchýmových progenitorové bunky čoskoro bude použitý v neurológii pre smerová chimerization mozgovými bunkami a vytvoriť fond zdravých buniek, ktoré sú schopné generovať deficitné enzým alebo faktor zodpovedný za klinické prejavy ochorenia. Transplantácia mezenchymálnych kmeňových buniek môže byť použitý na obnovenie stróma kostnej drene u pacientov s nádorovým ochorením po rádioterapii a chemoterapii, a v kombinácii s bunkami kostnej drene - pre obnovu krvotvorby. Vývoj substitučná terapia zamerané na odstránenie vady pohybového systému pomocou MSCS podporovať inžinierstva v biomateriálov prevedení matrike alebo biomimics tvoriacich kostry obývať potomstvo mezenchymálnych kmeňových buniek.

Zdroje mezenchymálnych kmeňových buniek

Hlavným zdrojom mezenchymálnych kmeňových buniek kostnej drene krvotvorných kmeňových buniek, ktoré u cicavcov je neustále diferencovať do krvných buniek a imunitného systému, vzhľadom k tomu, mezenchýmových kmeňové bunky prezentované malé populácie stromálnych buniek podobných fibroblastom kostnej drene a pomáhajú udržiavať nediferencovaného stavu krvotvorných kmeňových buniek. Za určitých podmienok, mezenchýmových kmeňové bunky diferencujú na bunky chrupavky a kosti. Pri nanesené na živnej pôde v nízkej hustote na výsadbu strómy mononukleárnych buniek kostnej drene tvoriť kolónie adherentních buniek, ktoré v skutočnosti sú fibroblastové multipotentní mezenchýmových prekurzorové bunky. Niektorí autori sa domnievajú, že kostná dreň uložené nepridelené mezenchýmových kmeňové bunky, ktoré, vďaka schopnosti samoobnovení a vysoká diferenciácia možné, poskytnúť všetky tkanivá tela predchodcov mezenchýmových stromálnych buniek po celú dobu života organizmu cicavcov.

V kostnej dreni tvoria stromálne bunky sieť, ktorá vyplňuje priestor medzi sinusoidmi a kostným tkanivom. Obsah spiaceho MSC v kostnej dreni dospelého pacienta je porovnateľný s počtom hematopoetických kmeňových buniek a nepresahuje 0,01-0,001%. Mesenchymálne kmeňové bunky izolované z kostnej drene a nepodrobené kultivácii nemajú adhezívne molekuly. Také MSC nevyjadrujú CD34, ICAM, VCAM, kolagén typu I a III, CD44 a CD29. Z tohto dôvodu, v in vitro mezenchýmových kmeňové bunky, ktoré nie sú upevnené na kultivačné nádoby, a pokročilejšie progenitorových odvodené mezenchýmových kmeňové bunky, sú tvorené komponenty cytoskeletu a receptora aparát bunkových adhéznych molekúl. Stromálne bunky s CD34 fenotypom nájdená aj v periférnej krvi, kostnej drene, aj keď sú oveľa menšie, než sú mononukleárny bunky CD34-pozitívne. Bunky CD34 izolované z krvi a prenesené do kultúry sa pripoja k substrátu a vytvárajú kolónie buniek podobných fibroblastom.

Je známe, že v embryonálnom období vzniká stromálna báza všetkých orgánov a tkanív cicavcov a človeka zo spoločného fondu mezenchymálnych kmeňových buniek pred a v štádiu organogenézy. Preto sa predpokladá, že v zrelom tele je väčšina mezenchymálnych kmeňových buniek v spojivových a kostných tkanivách. Bolo zistené, že väčšina bunkových prvkov stromy voľných spojivových a kostných tkanív je reprezentovaná viazanými progenitorovými bunkami, ktoré si však zachovávajú schopnosť proliferovať a tvoriť klony in vitro. Po zavedení takýchto buniek do celkového prietoku krvi sa implantuje viac ako 20% mezenchymálnych progenitorových buniek medzi stromálne prvky hematopoetického tkaniva a parenchymálnych orgánov.

Potenciálny zdroj mezenchymálnych kmeňových buniek je tukové tkanivo, medzi ktorými angažovaných kmeňových buniek nájdených v rôznom stupni adipocyty progenitory. Najmenej zrelé progenitorové prvky tukového tkaniva - strómy-cievne bunky, ktorý je rovnaký ako multipotentní mezenchýmových predkovia kostnej drene môžu diferencovať na adipocyty pôsobením glukokortikoidov, rastového faktora podobného inzulínu a inzulínu. V kultúre stromálnych vaskulárnych buniek diferenciácie na adipocyty a chondrocyty a tukového tkaniva kostné bunky drene odvodené tvoriaci adipocytov a osteoblastov.

Vo svaloch boli tiež nájdené stromálne kmeňové zdroje. V primárnej kultúre buniek izolovaných z ľudských kostrových svalov sa detegujú bunky stelátovej formy a mnohojadrové myotuby. V prítomnosti hviezdicových buniek konského séra proliferovať in vitro bez známok cytodiferenciační a po pridaní dexametazónu do kultivačného média diferenciácie je charakteristický vzhľad bunkových prvkov buniek s fenotypom kostrového a hladkého svalu, kosti, chrupavky, a tukového tkaniva. V dôsledku toho sú v ľudskom svalovom tkanive prítomné aj viazané, ako aj nezáväzné multipotentné mezenchýmové progenitorové bunky. Je ukázané, že populácia kmeňových buniek prítomných v kostrovom svale pochádza z nepridelenej multipotentních kostnej drene mezenchýmových progenitorové bunky, a líši sa od Myogénne satelitných buniek.

V myokardu novorodených potkanov tiež zistilo, adhezívne hviezdicových buniek, vhodných pre diferenciáciu potenciálu multipotentních mezenchýmových progenitorových buniek, ako pod vplyvom dexametazónu rozlišujú na adipocyty, osteoblasty, chondrocyty, bunky hladkého svalstva, myotubulů kostrových svalov a srdcových myocytov. Bolo preukázané, že bunky hladkého svalstva ciev (pericyty) sú odvodené multipotentní nediferencovanej perivaskulárnej mezenchýmových prekurzorové bunky. V kultúre perivaskulárnej mezenchymálnych kmeňových buniek exprimujú a-aktínu hladkého svalstva a krvných doštičiek odvodený rastový faktor receptor a sú schopné odlíšiť aspoň buniek hladkého svalstva.

Zvláštne miesto, pokiaľ ide o kmeňových zásob sa chrupavky, veľmi nízka reparačné potenciál, ktorý sa predpokladá, že je v dôsledku nedostatku multipotentních mezenchýmových progenitorové bunky alebo diferenciáciu a rastových faktorov. Predpokladá sa, že multipotentné mezenchymálne progenitorové bunky predbežne darované chondro- a osteogenéze vstupujú do chrupavkového tkaniva z iných tkanivových zdrojov.

Neexistuje ani tkanivový pôvod ani podmienky pre spáchanie mezenchymálnych progenitorových buniek v šľachách. Ekspermentalnye pozorovania naznačujú, že v raných postnatálnych králik Achillovej šľachy buniek v primárnych kultúrach v prvom prechode a udržať expresiu kolagénu typu I a dekorinu, ale na ďalšiu kultiváciu strácajú tenotsitov diferenciačných markerov.

Je potrebné poznamenať, že odpoveď na otázku, či skutočne lokalizované v rôznych tkanivách multipotentních mezenchýmových progenitorové bunky sú vždy prítomné v ich stromálnych, alebo tkanivá bazén z mezenchymálnych kmeňových buniek je kompenzovaný migráciou stromálne kmeňové bunky kostnej drene, to je ešte čaká.

Okrem kostnej drene a iných zón mezenchymálneho tkaniva dospelého organizmu môže byť ďalším zdrojom MSC pupočníková krv. Bolo preukázané, že pupočníková žila krv obsahuje bunky, ktoré majú podobné morfologické a antigénne vlastnosti s multipotentních mezenchýmových progenitorové bunky sú schopné adhézie a nie je horší ako multipotentní mezenchýmových progenitorové bunky kostnej drene pôvodu deriváciou potenciál. V kultúrach mezenchymálnych kmeňových buniek z pupočníkovej krvi detekovaných 5-10% nepridelené multipotentních mezenchymálnych kmeňových buniek. Ukázalo sa, že ich počet sa v pupočníkovej krvi je nepriamo úmerná veku plodu, čo je nepriamy dôkaz o migrácii z multipotentních mezenchýmových progenitorov do rôznych tkanív počas vývoja plodu. Tam boli prvé informácie o klinickom použití mezenchymálnych kmeňových buniek izolovaných z pupočníkovej krvi, rovnako ako embryonálne odvodený biologický materiál, ktorý je založený na známom schopnosti plodových kmeňových buniek integrovať a funkcie prizhivlyatsya v orgánoch a tkanivách systémy príjemcov pre dospelých.

Hľadanie nových zdrojov mezenchymálnych kmeňových buniek

Použitie mezenchymálnych kmeňových buniek embryonálneho pôvodu, podobne ako iné fetálne bunky, vytvára rad etických, právnych, právnych a legislatívnych problémov. Z tohto dôvodu pokračuje hľadanie extraembryonálneho bunkového donorového materiálu. Pokus bol neúspešný klinická aplikácia fibroblastov z ľudskej kože, ale bola stanovená nielen vysokú finančné možnosti technológie, ale aj rýchle diferenciáciu fibrocytů do fibroblastov, ktoré majú podstatne nižšiu potenciálne proliferáciu a produkciu obmedzený počet rastových faktorov. Ďalší pokrok v oblasti biológie a MSC sú multipotentní mezenchýmových progenitorové bunky kostnej drene dovolené, aby vypracovala stratégiu pre klinické použitie autológnych mezenchymálnych kmeňových buniek. Technológia ich izolácie, kultivácie, ex vivo reprodukcie a riadenej diferenciácie vyžadovala predovšetkým štúdium molekulárneho markerového spektra MSC. Ich analýza ukázala, že v primárnych kultúrach ľudského kostného tkaniva existuje niekoľko typov multipotentných mezenchymálnych progenitorových buniek. Proosteoblastov fenotyp možné zistiť u buniek exprimujúcich progenitorov markeru STRO-1 strómy, ale nenesú marker osteoblastov - alkalická fosfatáza. Tieto bunky sa vyznačujú nízkou schopnosť tvoriť mineralizovanej kostnej matrix, ako aj nedostatočné expresie osteopontínu a parathormónu. Deriváty STRO-1 pozitívnych buniek, neexprimujúcich alkalickú fosfatázu, priebežnú a plne diferencované osteoblastov. Bolo zistené, že tieto bunkové elementy klonovaných líniou STRO-1 pozitívnych buniek ľudskej trabekulárnej kosti sú schopné diferenciácie do zrelých osteocyty a adipocytov. Smer diferenciácie týchto buniek je závislá na expozíciu polynenasýtených mastných kyselín, prozápalových cytokínov - IL-1b a tumor nekrotizujúceho faktora a (TNF-a), rovnako ako protizápalové a imunosupresívne TGF-B.

Neskôr sa zistilo, že multipotentní mezenchýmových prekurzorové bunky postrádajú špecifické len im vlastné fenotyp, ale vyjadrujú komplexné znaky, charakteristické pre mezenchýmových, endoteliálny, epiteliálnych a svalových buniek v neprítomnosti expresie hematopoetických bunkových immunophenotypic antigény - CD45, CD34 a CD14. Okrem toho, mezenchýmových kmeňové bunky a konštitutívne produkujú induktibilní hematopoetických a ne-hematopoetických rastových faktorov, interleukíny, chemokiny, a, a na multipotentních mezenchýmových prekurzorov buniek exprimované receptory pre niektoré rastové faktory a cytokíny. Medzi bunky strómy základy ľudského tela nájdených dormantnye alebo pokojovej bunky s imunofenotypoch, takmer totožné s antigénne profil surových 5-fluóruracilu multipotentních mezenchýmových progenitorových buniek - tie, a ďalšie bunky exprimujú CD117, označenie "pre dospelých" kmeňové bunky.

Bunkový marker jedinečný pre mezenchymálne kmeňové bunky teda nebol stanovený. Predpokladá sa, že kľudové bunky sú nezáväzné populácie multipotentních mezenchýmových prekurzorov buniek, pretože neexprimujúcich markery bunkovej angažovaných osteoartritíde (SKFČR-1) alebo adipogeneze (PPAR-y-2). Predĺžené vystavenie kľudové pomaly proliferujúce bunky s fetálnym teľacím sérom výsledky v tvorbe terminálne diferencovaných angažovaných prekurzorov, ktoré sa vyznačujú rýchlym rastom. Klonálny rast takýchto mezenchymálnych buniek je podporovaný FGF2. Zdá sa, že genóm strómy odvodené z kmeňových buniek "zatvorené" tesný natoľko bola označená o neprítomnosti spontánnej diferenciácie MSC -. Bez osobitných podmienok pre spáchanie ani nie sú prevedené do buniek mezenchýme série.

Pre štúdium štruktúry populácie odvodenú mezenchymálnych kmeňových buniek sú prehľadávané diferenciácie proteínové markery na bunkové línie stromálnych a primárnych kultúr. V klonální kolónie teste buniek kostnej drene in vitro zistené, že keď je podrobená primárnych kultúrach EGF zvyšuje priemerná veľkosť kolónií a znižuje klonální expresiu alkalickej fosfatázy, zatiaľ čo pridanie hydrokortizónu aktivuje expresiu alkalickej fosfatázy, ktorá je markerom osteogénny diferenciácie orientácie MSC. Monoklonálne protilátky proti Stro-1 bolo možné oddeliť a štúdie populácie STRO-1-pozitívnych adherentních buniek v heterogénnom systéme Dexter kultúr. Spektrum cytokínov regulovať nielen proliferácie a diferenciácie hematopoetických a lymfoidných buniek, ale tiež sa podieľajú na formovaní, formovanie a resorpcia kostrové tkaniva para-, automatického a endokrinných mechanizmov. Receptory sprostredkované uvoľňovanie sekundárnych poslov, ako je cAMP, diacylglyceroly, inositoltrifosfátu a Ca2 + sa tiež používajú pre markerovou analýzu rôznych kategórií stromálny tkaniva buniek exprimujúce relevantné receptory. Použitie monoklonálnych protilátok ako markery môžu nadviazať strómy lymfatických orgánov patrí retikulárne buniek pre T a B-závislých zón.

Po určitú dobu pokračovali vedecké spory v otázke možnosti vzniku MSC z hematopoetických kmeňových buniek. Naozaj, keď explantácii suspenzie buniek kostnej drene v jednovrstvovej kultúre, v ktorej jednotlivé kolónie rast fibroblastov. Avšak, bolo preukázané, že prítomnosť prekurzorov fibroblastov kolónií a rôznych zárodkov diferenciáciu krvotvorného tkaniva ako súčasť kostnej drene nie je dôkazom ich spoločný pôvod krvotvorných buniek. Pomocou diskriminačnej analýzy kmeňových buniek kostnej drene zistené, že mikroprostredie na heterotopné transplantáciu krvotvorných buniek kostnej drene sa prenáša, čo svedčí o existencii, v kostnej dreni nezávislej histogenetického MSC populácií krvotvorných buniek.

Navyše selektívne metóda klonovania odhalený v jednovrstvových kultúrach stromálne bunky kostnej drene o nové kategórie prekurzorov buniek pre stanovenie ich počtu, študovať ich vlastnosti, proliferatívne a diferenciačný potenciál. Bolo zistené, že podobné fibroblastom stromálne bunky in vitro proliferáciu a tvorí diploidný kolónií, ktoré pri reverznej transplantácie do tela zaisťujúce tvorbu nových krvných krvotvorných orgánov. Výsledky štúdií jednotlivých klonov naznačujú, že je tu populácie buniek v ich proliferatívne a diferenciačný potenciál schopných nároku úlohu kmeňových buniek stromálny tkaniva, Gistogeneticheskaja nezávislé na krvotvorných kmeňových buniek v stromálnych progenitorových buniek. Bunky tejto populácie sú charakterizované samonosným rastom a diferencujú sa do progenitorových buniek kostného, chrupavého a retikulárneho tkaniva kostnej drene.

Veľmi zaujímavé je, ak sú výsledky štúdií Chailakhyan R. A kol (1997 - 2001), ktoré boli kultivované kostnej drene strómy odvodené progenitorové bunky králiky, morčatá, myši a z a-MEM kultivačnom médiu doplnenom fetálnym teľacím sérom. Autori uskutočnili explantáciu s počiatočnou hustotou 2 až 4 x 103 buniek kostnej drene na 1 cm2. Ako je použité dávkovači homológnej alebo heterológnej inaktivuje ožiarením buniek kostnej drene v zadržiavacie pôsobenie podávača dávky, ale úplne blokovaná proliferácia. Dvojtýždňové primárne diskrétne kolónie fibroblastov sa trypsinizovali na produkciu monoklonálnych kmeňov. Evidencia klonální pôvod kolónie boli získané za použitia chromozomálne markery vo zmesných kultúrach kostnej drene samcov a samíc morčaťa, časozberné snímanie živých kultúr, ako aj vo zmesných kultúrach kostnej drene syngenních myšou a CBA SVAT6T6. Transplantácia suspenzie čerstvo izolovaných buniek kostnej drene pestovaných in vitro alebo stromálne fibroblasty pod obličkové puzdro bolo vykonané v ivalonovyh poréznej nosnej štruktúry alebo želatína, ako aj inaktivované králičie špongiózne kostnej matrix. Transplantačnej klony do kosti krycej stehna morčaťa vyčistenej od mäkkých tkanív a perioste, znížiť epifýzy a dôkladne pranie ich kostnú dreň. Kosť bola narezaná na fragmenty (3-5 mm), vysušená a ožiarená v dávke 60 Gy. V kostných krytoch boli jednotlivé fibroblastové kolónie umiestnené a implantované intramuskulárne. Pre intraperitoneálnou transplantácii stromálnych fibroblastov, pestovaných in vitro, sme použili typy difúzna komory (V = 0,015 cm 3, h = 0, l mm) a D (V = 0,15 cm 3, h = 2 mm).

Pri štúdiu dynamiku rastu klonov kmeňov Chailakhyan R. Et al (2001) zistili, že jednotlivé bunky tvoriace kolónie fibroblasty, ako aj ich potomkovia majú veľký proliferačnej potenciál. V desiatej pasáži bol počet fibroblastov v niektorých kmeňoch 1,2 až 7,2 x ¹⁰⁹ buniek. V procese ich vývoja dosiahli až 31-34 bunkové duplikácie. Tak heterotopická transplantácia kmeňov drene odvodené z kostnej tvorených strómy prekurzorov niekoľko desiatok klonov viedlo k prevodu mikroprostredie kostnej drene a vzdelávanie v novom transplantáciu zóna hematopoetických orgánov. Autori zvýšil na otázku, či jednotlivé klony môžu tolerovať kostnej drene mikroprostredie, stromálne bunky, alebo to si vyžaduje spoluprácu niekoľkých rôznych klonogenní stromálne progenitorových? A ak budú jednotlivé klony môcť prenášať mikroprostredie, či už je plný všetkých troch zárodočných krvi alebo rôzne klony zabezpečiť tvorbu krvotvorné mikroprostredie pre rôzne choroboplodné zárodky? Na riešenie týchto problémov bola vyvinutá technológia pestovania stromálnych progenitorových buniek do kolagénového gélu, ktorý vám umožní fotografovať z povrchu fibroblastov kultivovaných kolónií s cieľom následného heterotopická transplantáciu. Jednotlivé klony stromálne fibroblasty, bunky kostnej drene vypestované z CBA myšiach a morčatách, rezané spolu s fragmentom gélového povlaku a transplantované heterotopická - pod kapsule obličiek syngenních myšou alebo autológnych brucho svalu morčiat. Pri transplantácii do svalu boli kolónie na géli umiestnené do kostrových obalov.

Zistili sme, že 50-90 dní po transplantácii kostnej drene fibroblastov kolónie v 20% prípadov boli pozorované vo vývoji transplantácie oblasti kostí alebo kostnej a krvotvorné tkaniva. V 5% príjemcov, vytvorené vrecká kosti, ktoré majú dutinu naplnenú kostnej dreni. Vnútri kostných valcov taká ložiská majú zaoblený tvar a kapsulu vyrobenú z kostného tkaniva, s osteocyty a dobre vyvinuté osteoblastov vrstvu. Dutina Kostná dreň obsahuje retikulárne tkanina s myeloidných a erytroidných buniek, proporcie, ktoré sa nelíšia od toho v normálnej kostnej dreni. Štep oblička bola typická medulárnou teleso tvorené natívnom transplantáciou kostnej drene, pričom kosť kapsule sa vzťahuje iba medulárnej dutiny z obličiek kapsule. Krvotvorné tkaniva zahrnuté myeloidnej, megakaryocytov a erytroidné prvky. Strómy útlmu kanála bola dutiny dobre vyvinuté a obsahuje typický systém tukových buniek. Zároveň sa v oblasti transplantácie nejakého kolónií kostí bez známok krvotvorby bolo zistené pod kapsulu obličiek. Štúdium proliferatívnej a diferenciácie účinnosti jednotlivých klonov sa pokračovalo na kmeňoch monoklonálnych králik kostnej drene, bunky sa resuspendujú v kultivačnom médiu a v samostatnom ivalonovoy špongiou s hmotnosťou 1-2 mg zastrčenú do kapsule obličiek darcu králičie kostnej drene. Tieto bunky boli podrobené autotransplantácia 21 monoklonálna napätia. Výsledky boli zohľadnené po 2-3 mesiacoch. Autori zistili, že 14% z transplantovaných kostnej drene monoklonálnou kmeňov tvarové teleso zložené z kostí a kostnej drene dutiny naplnené krvotvorných buniek. V 33% prípadov transplantované kmeňov vytvorená kompaktná kosť s rôznymi dutinami veľkosti ostootsitami zamurované osteoblastov a rozvinutých vrstvou. V niektorých prípadoch, huby transplantované klony vyvinutý retikulum bez kosti alebo krvotvorných buniek. Niekedy sieťkovitý útvar stróma nastal s dobre vybudovanej sieti sínusoíd, ale nie je naplnená krvotvorných buniek. Takto získané výsledky boli podobné výsledkom získaným transplantácií klonov na kolagénového gélu. Avšak, v prípade, že transplantácia klony pestované na substráte viedla k tvorbe tkaniva drene je 5% kosti - 15% a retikulárne tkanina - v 80% prípadov, transplantácia monoklonálna kmeňov tvorbu buniek kostnej drene sa pozorovala u 14% prípadov kosti - v 53% a retikulárnych - v 53% prípadov. Podľa autorov, znamená to, že podmienky pre vykonávanie proliferačnej a diferenciačných potenciálov stromálnych fibroblastov pri transplantácii na porézny lešenie boli optimálnejší než ich transplantáciou kostnej a vzťahuje sa na kolagénu substrát. Nie je vylúčené, že použitie pokročilejších metód pestovania a transplantácii klonov spätnej väzby môže zlepšiť podmienky pre vykonávanie svojich klonov diferenciačných potenciály a zmeniť tieto vzťahy. Tak či onak, ale hlavné hodnota výskumu spočíva v tom, že niektoré z týchto klonov sa bunky strómy, ktoré sú schopné tvoriť kostného tkaniva a zároveň zabezpečiť stromálny krvotvorných mikroprostredie hneď tri klíčky krvi kostnej drene: erytroidné, myeloidná a megakaryocytov, vytvára dostatočne veľké oporné body krvotvorného tkaniva a niektoré kostné hmoty.

Ďalej autori zaoberá otázkou kapacity pre tieto typy bunkovej diferenciácie jednotlivých klonogenních stromálnych progenitorových buniek v uzavretom systéme difúznych komôr. Okrem toho, bolo potrebné zistiť, či jednotlivé klony pluripotentných expozície alebo displejom pre rozlišovanie potenciál vyžaduje kooperatívny interakciu niekoľkých klonov s pevným znamenie cytodiferenciační, odlišný pomer, ktorý určuje prednostné tvorbu kostí, chrupavky alebo retikulárne. Kombináciou dvoch metodologické prístupy - monoklonálnu izoluje stromálnych progenitorových buniek kostnej a transplantácie je do difúznych komôr, Chailakhyan R. Et al (2001), získané výsledky, ktoré nemá prístup pochopenie konštrukčného usporiadania podporné väzivové tkanivá kostnej drene. Transplantačnej monoklonálna kmene stromálnych progenitorových buniek na O článkov typu viedla k tvorbe ako kostného a chrupavkového tkaniva, čo ukazuje na schopnosť potomstva jedného stromálnych buniek tvoriacich kolónie súčasne tvoriace kosť a chrupavku. Predpoklad, že kosť a chrupavkové tkanivo pochádza z bežnej stromálnej progenitorovej bunky, sa opakovane opakovane vyjadrovalo. Táto hypotéza však nemala správne experimentálne potvrdenie. Kosti a chrupavky v difúznych komôr bolo nevyhnutné preukázať existenciu kmeňových buniek zahŕňajú kostnej drene stromálny prekurzorové bunky sú spoločné pre tieto dva typy tkanív.

Potom sa 29 klonální kmene druhý a tretí pasáže, primárne kultúry odvodené z kostnej drene králika boli umiestnené do difúznej komory a intraperitoneálne homológnej zviera. Štúdie ukázali, že 45% monoklonálnych kmeňov kostnej drene má osteogénne účinky. Výnimočne retikulárne tkaniny obsahoval komory 9, ale s kosťou a chrupavkové tkaniva je stále prítomná v komorách 13, čo predstavuje 76% všetkých kmeňov. V komorách typu O, kde bola možná diferenciácia pre kosti i chrupavkové tkanivo, bolo študovaných 16 kmeňov. V štyroch komorách (25%) sa vytvorilo kosti aj chrupavkové tkanivo. Treba ešte raz poznamenať, že štúdia Chailakhyan R. Et al (2001) Jednotlivé progenitorové bunky prešli buniek kmeňa, ktorých súčasťou sú z 31 až 34 zdvojenie, a ich potomstvo je 0.9-2.0 x 10 ⁹ buniek. Počet mitóz, ktorým boli prekurzorové bunky polyklonálnych kmeňov vystavené, je prakticky rovnaký ako počet buniek monoklonálnych kmeňov. Teda miera vývoja polyklonálnych kmeňov, a to najmä v prvej fáze svojho vzniku, do značnej miery závisí od počtu kolónií používaných k iniciácii kmeňov. Diploidný kmene ľudských embryonálnych fibroblastov (WI-38) pre 12-15 reklonirovanii th zdvojnásobenie hladiny tiež vytvorený kolónie s odlišným priemerom, a v ich obsahu buniek. Veľké kolónie obsahujúce viac ako 103 buniek boli iba 5 až 10%. S nárastom počtu divízií sa znížil podiel veľkých kolónií. Mono- a polyklonálne kmene strómy kostnej drene fibroblastové udržal diploidný chromozómov po 20 alebo viac zdvojenie a tendencie vývoja bola porovnateľná s dynamikou diploidných kmeňov embryonálne fibroblasty. Analýza diferenciácie potenciálu špecifických strómy kostnej drene, progenitorov monoklonálnymi kmene transplantácií vykonaných v difúznych komôr, ukázala, že polovica z nich v osteoblasty. Veľké kolónie tvorili 10% ich celkového počtu. V dôsledku toho počet buniek tvoriacich osteogénne kolónie zodpovedal približne 5% ich celkovej populácie. V celkovej hmotnosti osteogénnych progenitorových buniek identifikovaných autormi existovali bunky schopné tvoriť kosti a chrupavkové tkanivo súčasne. Prvýkrát sa zistilo, že pre tieto dva typy tkanív v dospelom organizme je spoločné prekurzorové bunky: 25% testovaných klonov boli vytvorené podobnými bunkami, a ich počet vo všeobecnej populácii progenitorov nebol menší ako 2,5%.

Preto heterotopická transplantácia jednotlivých klonov fibroblastov kostnej drene otvorila nové aspekty štrukturálnej organizácie populácie mezenchymálnych progenitorových buniek. Našiel stromálny progenitorové bunky, ktoré sú schopné prenášať špecifické mikroprostredie okamžite pre všetkých krvotvorným stonky, ktoré číslo zo skúmaných klonov väčšie na rôznych modeloch je od 5 do 15% (0,5-1,5% z celkového počtu progenitorov detekovaná). Spolu s klony, prenášanie kompletné mikroprostredie kostnej drene, existuje progenitorové bunky, deterministické iba tvorby kostného tkaniva, ktorý sa tvorí, keď prevedená do otvoreného systému, kostí, ktorý nepodporuje vývoj krvotvorby. Ich počet z celkového počtu progenitorových buniek je 1,5 - 3%. Niektoré z týchto buniek môžu tvoriť kostné tkanivo s obmedzenou dobou vlastnej udržiavania. V dôsledku toho je populácia stromálnych progenitorových buniek heterogénna vo svojom diferenciačnom potenciáli. Medzi nimi existuje kategórie buniek, tvrdí úlohu stromálnych kmeňových buniek, ktoré sú schopné diferenciácie na všetkých troch dimenziách spojených strómy kostnej drene tkaniva, tvoriace kostí, chrupaviek a retikulárne tkaniva. Tieto údaje nám umožňujú dúfať, že s pomocou rôznych bunkových markerov bude možné určiť príspevok každého typu buniek strómy v mikroprostredie konkrétnej organizácii a podporujú krvotvorbu v Dexter kultúrach.

Vlastnosti mezenchymálnych kmeňových buniek

V posledných rokoch sa zistilo, že v stacionárnych kultúrach kostnej drene mezenchýme multipotentní progenitorové bunky sú málo populácie malých agranulární buniek (RS-1) bunkách, vyznačujúci sa tým, nízku schopnosť kolonizácie a absencia expresie Ki-67 antigénu špecifického pre proliferujúcich buniek. Antigénne parametre dormantnyh RS-1 bunky sa líši od spektra spáchaných antigény rýchlo proliferujúcich stromálnych progenitorové bunky. Bolo zistené, že vysoká miera proliferácie angažovaných progenitorových buniek bola pozorovaná iba v prítomnosti buniek, RS-1. Na druhej strane, RS-1 bunky zvyšuje rýchlosť rastu pod vplyvom faktorov sekretovaných najzrelším odvodených multipotentní mezenchýmových progenitorové bunky. Zdá sa, že bunky, RS-1 sú podmnožinou nesvěřené MSC schopné recyklácie. V odolné proti 5-fluóruracilu stromálny progenitorových buniek kostnej drene, vyznačujúci sa nízkym obsahom RNA a vysokej úrovne expresie génu ornitindekarboxyláza vitro - markeru Neproliferujúce bunky.

Intenzívny chov strómy progenitorové bunky začína po ich uchytenie na podklade. Ak je to vyjadrené markerom profil zle diferencovaných buniek: SH2 (TGF-P receptor (3), SH3 (doména signalizačné proteín), typy kolagénu I a III, fibronektín, adhézny receptor VCAM-1 (CD106) a ICAM (CD54), cadherin-11 , CD44, CD71 (transferinový receptor), CD90, CD120a a CD124, ale bez expresie charakteristických markery krvotvorných kmeňových buniek (CD34, CD14, CD45). Klonální rast umožňuje opakovane pasážovania mezenchymálnych kmeňových buniek pre produkciu kultúry mnohých geneticky homogénne stromálne progenitorových pluripotentných bunky. Cerea 2-3 priechod ich počet dosiahne 50-300 miliónov. V kultúre dostatočnú hustotou po zastavení proliferácie stromálny progenitorových buniek, na rozdiel od nekrózy fibroblasty diferenciáciu na adipocyty, myocytov, buniek chrupavky a kostného tkaniva. Kombinácia regulačných signálov tri diferenciačných zahŕňajúce 1-metyl-izobutilksantin (induktor tvorby intracelulárneho cAMP), dexametazón (inhibítor fosfolipázy a a C) a indometacín (inhibítor cyklooxygenázy, zníženie aktivity tromboxánu a) sa otáča adipocyty a 95% mezenchýmových progenitorové bunky. Tvorba adipocytov z nezrelých stromálnych buniek potvrdila expresia lipoproteínovej lipázy génu, histochemické identifikáciu apolipoproteínu a peroxysomal receptory. Bunky rovnakého klonu ovplyvnenej TGF-B v médiu bez séra vytvára homogénna populáciu chondrocytov. Viacvrstvový bunkové kultúry z chrupavky extracelulárnej matrix, sa vyznačuje tým, vyvinutý pozostávajúce z proteoglykanu a kolagénu typu II. Živné médium s 10% fetálneho séra efekt diferenciácie signálov komplex pozostávajúci z b-glycerofosfát (donátor anorganického fosfátu), kyselina askorbová a dexametazón, v rovnakých kultúra stromálnych progenitorových progenitorových buniek vedie k tvorbe bunkových agregátov. V týchto bunkách, dochádza k postupnému nárastu aktivity hladín alkalickej fosfatázy a osteopontínu ukazuje tvorbu mineralizáciu kostí, ktoré bunky potvrdil postupný nárast intracelulárneho vápnika.

Podľa niektorých schopnosť mezenchymálnych kmeňových buniek na neurčitú dobu rozdeliť a rozmnožovanie rôznych typov mezenchymálnych línií buniek v kombinácii s vysokým stupňom plasticity. Keď sú podávané do komôr, alebo biela hmota mezenchymálnych kmeňových buniek migrovať do parenchýmu nervového tkaniva a diferencovať do neurónov a gliových odvodené bunkové línie. Okrem toho, že je informácia o MSC transdiferenciace v krvotvorných kmeňových buniek in vitro a in vivo. Viac hĺbková analýza v niektorých štúdiách určených výnimočne vysoká ťažnosť MSC, ktorá sa prejavuje v ich schopnosti diferencovať do astrocyt, oligodendrocyty, neurónov, kardiomyocytov, buniek hladkého svalstva a buniek kostrového svalstva. V rade štúdií transdifferentsirovochnogo potenciál MSC in vitro a in vivo zistené, že multipotentní mezenchýmových prekurzorové bunky pôvodu kostnej drene diferencujú do bunkových línií, ktoré tvoria kosť, chrupavka, svaly, nervy a tukového tkaniva, rovnako ako šliach a podporné väzivové tkanivá, ktorá podporuje krvotvorbu ,

Avšak, v iných štúdiách, žiadne známky obmedzenie pluripotentním genómu mezenchymálnych kmeňových buniek a nemohli byť detekované populácie stromálnych progenitorových buniek, ale pre kontrolu možných pluripotentné bunky strómy bola skúmaná viac ako 200 MSC klony izolované z primárnej kultúry. Drvivá väčšina klonov v in vitro udržal schopnosť diferenciácie do osteogénny, chondrogenní a adipogenní smermi. Pri vylúčení pravdepodobnosť migrácie buniek príjemcu transplantáciou mezenchymálnych kmeňových buniek v rámci kapsule obličiek alebo v difúznych komôr sa zdalo, že stromálne progenitorové bunky in situ udržať heterogénne fenotyp, čo naznačuje, že neexistujú reštrikčného faktorov transplantáciu zóna alebo neprítomnosť samotných pluripotentných MSC. Povolila činnosť vzácneho druhu somatických pluripotentných kmeňových buniek, ktoré sú spoločnými prekurzory kmeňových buniek dospelých jedincov.

Na multi-, ale nie je pravda pluripotentné mezenchýmových kmeňové bunky predstavujú len veľmi malú časť z buniek kostnej drene a sú schopné, za určitých okolností, keď sú kultivované in vitro proliferáciu, bez prišiel do diferenciácie, o čom svedčí ich indukované línie nasadenie buniek v kosti, chrupavky, tukového, svalového tkaniva a v tenotsity a stromálnych prvkov, ktoré podporujú krvotvorbu. Typicky, kontinuálne expozície v živnej pôde s fetálnym teľacím sérom vyvoláva výstupné MSCS vo stromálnych angažovaných progenitorových buniek, potomstvo, ktoré podstúpia spontánne konečnej diferenciácii. In vitro možno dosiahnuť tvorby smerové osteoblastov pridaním do středotlakého klimatizácia dexametazón, beta-glycerofosfát a askorbovej kyseliny, pričom kombinácia diferenciácie signalizuje dexametazón a inzulín vyvoláva tvorbu adipocytov.

Bolo zistené, že pred vstupom do fázy terminálny diferenciácie kostnej drene MSC pre vytváranie určitých podmienok kultivácie najprv diferencovať do podobných fibroblastom mezenchymálnych kmeňových buniek. Deriváty týchto buniek in vivo, sú zapojené do tvorby kostí, chrupaviek, šliach, tukového a svalového tkaniva, rovnako ako nosné stromálne krvotvorby. Mnohí autori chápať pojem "multipotentní mezenchýmových progenitorové bunky", ako je vlastne MSC a angažovaní stromálnych progenitorových buniek a kostnej drene mezenchymálnych tkanív. Klonální analýza mezenchymálnych multipotentních progenitorových buniek z kostnej drene pôvodu ukázalo, že o niečo viac ako tretina z klonov diferencovaných v osteo-, hondro- a adipocytov, zatiaľ čo iné klony buniek majú osteogénny potenciál a forma iba hondro- a osteocyty. Tento klon multipotentních mezenchýmových prekurzorov buniek, ako je IUD-9, za vhodných podmienok mikroprostredie diferencované do buniek s fenotypom a funkčných vlastností nielen osteoblastov, chondrocytov a ADIC potsitov ale stromálne bunky, ktoré podporujú krvotvorbu. Izolované z fetálnych buniek potkania kostnej drene klon RCJ3.1 diferencované mezenchýmových bunky rôznych fenotypov. Kombinovaným pôsobením kyseliny askorbovej, b-glycerofosfát, a dexametazónu z bunkových elementov tohto klonu sa najprv vytvorí multijadrové myocytov a potom postupne, adipocyty, chondrocyty a ostrovčeky mineralizovanej kosti. Populácia granulárnych buniek z perioste z plodov potkanov zodpovedá nepridelené multipotentních mezenchýmových kmeňových buniek, ako je charakterizovaná nízkou rýchlosti proliferácie neexprimujúcich markery diferenciácie, a diferencované kultivačných podmienok pre vytvorenie hondro-, osteo- a adipocytov a buniek hladkého svalstva.

Preto je potrebné si uvedomiť, že otázka plyuri- alebo multipotency genómu mezenchymálnych kmeňových buniek je stále otvorený, čo následne ovplyvňuje súčasne diferenciačního potenciálu stromálnych progenitorových buniek, čo je tiež úplne nainštalovaný.

Experimentálne preukázaný a dôležitou charakteristikou mezenchymálnych kmeňových buniek je ich schopnosť opustiť tkaniva výklenok a cirkulujú v krvnom obehu. Ak chcete aktivovať genetický program diferenciácie, takéto cirkulujúce kmeňové bunky by mali spadať do príslušného mikroprostredia. Je ukázané, že pri podávaní systémovo do krvného riečišťa MSCS príjemcov, nezrelé bunky implantované v rôznych orgánoch a tkanivách, a potom diferencované na krvných buniek, myocytov, adipocytov, chondrocytov, a fibroblasty. V dôsledku toho, v oblastiach miestnej tkaniva dochádza signálu regulačné interakcie potvrdené a nepotvrdené stromálnych progenitorových buniek, ako aj medzi nimi a okolitých zrelých buniek. Predpokladá sa, že diferenciácia indukcia sa vykonáva parakrinný regulačné faktory mesenchymálního pôvodu a nemezenhimalnogo (rastové faktory, eikosanoidy, extracelulárnej matrix molekuly), ktoré poskytujú priestorové a časové vzťahy v mikroprostredie multipotenciální mezenchymálnych kmeňových buniek. Preto je lokálne poškodenie mezenchýme tkaniva by mala viesť k vytvoreniu mikroprostredie zón multipotentní mezenchýmových prekurzorové bunky kvalitatívne sa líši od zložitých regulačných signálov, intaktné tkanivá, v ktorej sa vyskytujú fyziologické procesy miesto reparačné regenerácie. Tento rozdiel je mimoriadne dôležitý z hľadiska špecializácie bunkového fenotypu v normálnom a poškodenom mikroprostredí.

Podľa myšlienok tu stojí mechanizmus základného rozdielu dvoch známych procesov - fyziologickej regenerácie a proliferácie zápalov. Prvý z nich je doplnená redukciou špecializované zloženie tkanivovej a jeho funkcie, pričom výsledok proliferatívneho procesu je tvorba zrelých bunky spojivového tkaniva a strata funkcie poškodené tkanivá oblasti. Na vývoj optimálnych programov na využitie multipotentných mezenchýmových progenitorových buniek v liekoch regeneratívnej plastickej hmoty je potrebná dôkladná štúdia charakteristík vplyvu faktorov mikroprostredia na diferenciáciu MSC.

Závislosť štruktúry oddelenia kmeňových buniek na bunkových para- a autokrinných regulátoroch, ktorých expresia je modulovaná vonkajšími signálmi, nikto nepochybuje. Medzi funkcie regulačných faktorov najdôležitejšie patrí kontrola asymetrického rozdelenia MSC a expresia génov určujúcich štádiá komisionu a počet bunkových delení. Externé signály, na ktorých závisí ďalší vývoj MSC, sú poskytované ich mikroprostredím. V nezrelých MSC proliferovať dostatočne dlhú dobu, pri zachovaní schopnosť diferenciácie na adipocyty línie, myofibroblasty, hematogénne stromálny tkaniva, buniek chrupavky a kosti. Bolo zistené, že obmedzený počet obyvateľov cirkulujúcich SB34-negatívne bunky strómy prvky z krvného obehu sa vracia do kostnej drene väzivových tkanív, je transformovaný do linky, kde CD34-pozitívnych krvotvorných kmeňových buniek. Tieto pozorovania naznačujú, že recirkulácia progenitorové bunky, mezenchýmových v krvnom riečisku tkaniva poskytuje podporu pre rovnováhu stromálnych kmeňových buniek v rôznych orgánoch mobilizáciou spoločný bazén stromálnych buniek kostnej drene nezrelé kosti. Diferenciácia MSC do buniek s viacerými mezenchymálnych fenotypy a ich účasť na opravy alebo regeneráciu kostí, chrupaviek, šliach a tukového tkaniva in vivo preukázané adoptívny modelov prenosu u pokusných zvierat. Podľa iných autorov, vzdialený migrácia MSC riečišťa je v kombinácii s lokálnym posunutie alebo korotkodistantnym multipotentních mezenchýmových prekurzorov buniek v tkanive na opravy chrupavky, regeneráciu svalov a ďalších redukčných reakcií.

Miestne zásoby kmeňových strómy tkaniva nadácie hrajú úlohu zdroj buniek vo fyziologickom regeneráciu tkanív procesov a sú doplňované vzdialených dopravných MSC sú výdavky strómy tkaniva kmeňových zdrojov. Avšak, v prípade potreby núdzového mobilizáciu bunkového reparatívne kapacity, napríklad viac trauma, v opravných procesov regenerácie podieľa MSCS celý vlak, a obvod cez krvné riečište prijateľní mezenchýmových prekurzorové bunky z kostnej drene.

Transplantácia mezenchymálnych kmeňových buniek

Existujú určité paralely medzi procesmi fyziologickej regenerácie tkanív a ich tvorbou počas obdobia vnútromaternicového vývoja. Embryogenézy človeka a cicavcov, vytváranie rôznych typov špecializovaných buniek odvodených od ektoparaziticid, mezo a endodermal zárodočné vrstvy bazéna, ale s povinnou účasťou mesenchyme. Voľná bunková sieť embryonálneho mezenchymálneho tkaniva vykonáva množstvo regulačných, metabolických, skeletálnych a morfogenetických funkcií. Záložka provizórne tela sa vykonáva až po kondenzačný mesenchymu na úkor rastu klonogenní progenitorových buniek, ktoré vytvárajú primárne morfogenetické signály organogenézu. Stromové deriváty embryonálneho mezenchýmu vytvárajú bunkovú štruktúru dočasných orgánov a tvoria základ pre ich budúcu dodávku energie tým, že rastú primárnu krv a lymfatické cievy. Inými slovami, stromálne prvky mikrocirkulačnej jednotky plodových orgánov sa objavia pred vytvorením ich štruktúrne funkčných jednotiek. Okrem toho aktívna migrácia mezenchymálnych buniek počas organogenézy poskytuje priestorovú orientáciu vývojových orgánov v dôsledku označenia ich hraníc objemu obmedzením homeotických nočiek. Na stromálnom lešení je tiež zostava štruktúrnych a funkčných jednotiek parenchymatóznych orgánov, ktoré často obsahujú morfogeneticky a funkčne úplne odlišné bunky. Z toho vyplýva, že pri embryogenéze sú mezenchymálne funkcie primárne a sú realizované generovaním regulačných signálov, ktoré aktivujú regionálnu proliferáciu a diferenciáciu progenitorových epiteliálnych buniek. Bunky embryonálneho mezenchýmu produkujú rastové faktory, ako sú LEG, HGF-b, CSF, pre ktoré parenchymálne progenitorové bunky majú zodpovedajúce receptory. V maturovanom zrelom tkanive dospelého organizmu vytvára sieť stromálnych buniek aj signály na udržanie životaschopnosti a proliferácie progenitorových buniek bez mezenchymálneho pôvodu. Avšak, spektrum stromálny regulačné signály v postnatálnu ontogenézy ďalšej (VVP, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, Flt-3, LIF atď.) A je zameraný na poskytovanie fyziologickej regenerácie alebo opravy poškodených tkanív. Okrem toho sú spektrálne charakteristiky stromálnych regulačných faktorov v každom druhu tkaniva a dokonca v rámci toho istého orgánu odlišné. Najmä, hematopoézy a lymfopoéze na množenie a diferenciáciu hematopoetických a imunokompetentných buniek sa vyskytuje len v určitých orgánoch, v ktorej pôsobia stromálny mikroprostredie zaisťujúce podmienky pre dozrievanie krvotvorných a lymfoidných buniek. Je na regulačných faktorov mikroprostredia závisí od schopnosti krvotvorných a lymfoidných buniek repopulovat telo k proliferácii a zrelé do jeho mikroskopickej výklenky.

Medzi zložky extracelulárnej matrix, ktoré produkujú multipotentních mezenchýmových prekurzorov buniek, je potrebné poznamenať, fibronektín, laminínu, kolagén a proteoglykánmi, rovnako ako CD44 (hyaluronan a osteopontínu receptor) prijímajúci hlavnú úlohu v organizácii medzibunkovej interakcie a tvorbu extracelulárnej matrice v kostnej dreni a kosti , Je dokázané, že mezenchymálnych kostnej drene, multipotentní bunky vytvoriť redshestvenniki stromálny mikroprostredie, poskytujúce induktívne a regulačné signály nielen MSC, ale aj hematopoetických prekurzorov a nemezenhimalnye kmeňové bunky kostnej drene. Je známe, že MSC zapojené do krvotvorby meranej na základe ich schopnosti diferencovať na bunky strómy, ktoré podporujú krvotvorbu, v ktorých je aktívne vedenie MSK signál získané priamo z krvotvorných kmeňových buniek. To je dôvod, prečo kultúra sieťových strómy progenitorov je základom pre kŕmenie všetkých klonov krvotvorných buniek.

V zrelom intenzity organizmu hemodialýzy a lymfopoéze v stave dynamickej rovnováhy s "výdavkov" zrelých krvných buniek a buniek imunitného systému na periférii. Vzhľadom k tomu, stromálne bunky kostnej drene a lymfatické orgány zriedka aktualizované významné reštrukturalizácie stromálne štruktúry nedochádza v nich. Priniesť systém dynamickej rovnováhy, je možné s pomocou mechanického poškodenia na všetky orgány Hemo alebo lymfopoéze, čo vedie k rovnakému typu sekvenčných zmien, ktoré ovplyvňujú nielen a nie toľko krvotvorných alebo lymfoidných buniek, ako stromálne štruktúry poškodenie orgánu. V procese reparatívne regenerácie primárne vytvorené rámce strómy, ktoré sa potom repopulating krvotvorných alebo bunky imunitného systému. Tento dlho známy fakt robí posttraumatický regenerácie vhodný model pre štúdium stromálny mikroprostredie krvi-tvoriť orgánmi. Najmä pre vyšetrovanie reparatívne regenerácie kostnej drene sa používa mechanické vyprázdňovanie medulárnej dutiny dlhých kostí - kyretáž, ktorý umožňuje rýchlo a účinne, aby krvotvorného tkaniva zo stavu dynamickej rovnováhy. Pri štúdiu proces reparatívne regenerácie hematopoetických a strómy kostnej drene zložiek po mechanickom vyprázdnení dutiny kosti morčaťa tibie zistilo, že medzi indikátory regeneráciu krvotvorných a stromálnych buniek (počet krvotvorných buniek, koncentrácie a množstva stromálnych progenitorových buniek) nie je žiadny priamy vzťah. Okrem toho sa zistilo, že zvýšenie populácie stromálnych progenitorových buniek dochádza k skoršiemu dátumu po kyretáž, a samy o sebe stromálne fibroblasty sú fosfatazopolozhitelnymi, ktorá je charakteristická pre osteogénny tkaniva. Bolo tiež zistené, že kyretáž 3-5 dlhé kosti vedie k rastu populácie buniek v kostnej dreni a neoperovaného kosti aj v slezine, ktorá u morčiat je len lymfopoetický telo.

Morfologické obrázok reparatívne procesy v kostnej dreni kyuretirovannyh tibiálne morčatá všeobecne zodpovedá údajom v literatúre získané pri pokusoch na zvieratách iných druhov, dynamika zmien, ku ktorým došlo po odstránení krvotvorného tkaniva je rovnaký pre všetky druhy a rozdiel sa týka len časové parametre , Morfologicky fáza Postup obnovenia hematopoézy v dreňovej dutine sa vyprázdni v následných procesoch organizovaní tvorby krvnej zrazeniny hrubej vlákniny kosti, jej resorpciu, sínusoíd a retikulárne formácie strómy, ktoré ďalej repopulating hematopoetické prvky. Počet krvotvorných progenitorových buniek v kostnej dreni regenerácie tkanív procesu sa zvyšuje spolu zvýšenie obsahu krvotvorných buniek.

Gerasimov Yu et al (2001), v porovnaní sa zmeny v počte krvotvorných buniek a množstvo stromálnych bunkových prekurzorov v jednotlivých fázach procesu regenerácie. Bolo zistené, že kvantitatívne zmeny v bunkách kostnej drene v kostnej kyuretirovannoy zápasov dynamiky morfologických charakteristík regenerácie. Redukcia počas prvých troch dní obsahu bunky v regenerovať autorov atribút stratu krvotvorných buniek vzhľadom k nepriaznivým účinkom na mikroprostredie, čo vytvára retikulárne tkanivo rastie vo zvyšnej kostnej dreni v epifýzy a v druhom prípade za vzniku ohnísk osteoid a cievne poškodenie s kyretáž. 7-12 tý deň zvyšovania yaderosoderzhaschih bunky sa zhoduje s výskytom jednotlivých ložísk v myeloidných krvotvorných buniek stromálnych proliferácie zón. Na 20. Deň sú významné časti regenerované kostnej drene a dobre vyvinutými dutín, ktorý je sprevádzaný výrazným zvýšením celkového počtu buniek. Avšak počet hematopoetických prvkov v tomto období je 68% kontrolnej hladiny. To je v súlade s predtým publikovanými údajmi, ktoré preukazujú, že počet buniek krvotvorné po kyretáž dosiahne normy iba 35 až 40 dni po operácii.

V skorom posttraumatickom období je hlavným bunkovým zdrojom pre obnovenie hemopoézy bunkové prvky zachované v kyretáži. Neskôr je hlavným zdrojom regenerácie hematopoetického tkaniva kostnej drene kmeňové bunky, ktoré znovu repopulujú voľné stromálne zóny. S ohľadom na určité kategórie stromálnych buniek (endoteliálny, retikulárne a osteogénny), zdroje pre ich vzdelávanie v reštrukturalizácii medulárnej dutiny, zostávajú nejasné. Výsledky Yu.V. Gerasimova et al (2001) ukazujú, že v zostávajúcej kostnej drene po koncentráciu kyretáž buniek pre tvorbu kolónií fibroblastov výrazne vyššia ako v normálnej kostnej dreni. Autori sa domnievajú, že sa kyretáž je intenzívnejší selektívna elúcia krvotvorných buniek v porovnaní s stromálny tvoriacich kolónie buniek, ktoré sa podieľajú na tvorbe väzivového tkaniva a pevne spojené s jeho základné látky než krvotvorných buniek.

Dynamika zmeny v počte buniek tvoriacich kolónie fibroblastov koreluje s intenzitou osteogeneze procesov následnej trabekulárnej kostnej resorpcie a retikulárne formácie strómy, ktoré naplniť hematopoetických buniek. Väčšina stromálnych progenitorových buniek tvorí hrubé vláknité kostné tkanivo a retikulárnu stromu v uvedených časoch regenerácie. Pre zlomenín stehennej kosti v podmienkach predĺženého osteosyntézy v 5. Deň v regeneračnej zóny zvyšuje koncentráciu buniek a počet kolónie tvoriacich fibroblastov a tvorbu kosti v intenzívnej ich počet sa zvyšuje o 6 krát. Je známe, že bunky kostnej drene, ktoré tvoria fibroblastové kolónie, majú osteogénne vlastnosti. Počet stromálnych progenitorových buniek stúpa pred kolonizáciou oblasti kortexovanej kostnej drene hematopoetickými bunkami. To je v dobrej zhode s dôkazom, že stromálne bunky poskytujú tvorbu hematopoetického mikroprostredia. Je zrejmé, že vytvorenie hematopoetického mikroprostredia zodpovedá určitej úrovni regenerácie stromálny tkaniva, a zvyšuje počet hematopoetických buniek po expanzii stromálnych predmostie vhodné pre krvotvorbu.

Z najväčší záujem sú autormi dát, ktorá bezprostredne po kyretáž zvyšuje počet prekurzorov stromálnych buniek v odľahlých častiach kostry. Počnúc šiestej hodiny, a dvadsiate deň vrátane kontralaterálnej tíbie je pozorované vo viac ako dvoch-násobné zvýšenie koncentrácie a počet buniek tvoriacich kolónie fibroblastov. Mechanizmus tohto javu je pravdepodobne spojená s tým, že masívne poškodenie kostnej drene, čo vedie k tvorbe veľkého počtu krvných zrazenín a súčasne ničia významný počet krvných doštičiek a uvoľňovanie do krvných doštičiek odvodený rastový faktor (RBSK), o ktorom je známe, že spôsobujú proliferáciu buniek tvoriacich kolónie fibroblasty nachádzajúce sa v tele mimo proliferatívnej skupiny. Pri pokusoch na králikoch lokálne podanie MSC podporuje obnovu chirurgicky poškodenej chrupavky kolenného kĺbu, ktorá môže byť spojená s tvorbou chondrocytov odvodených od MSC zavedených. Avšak reparatívne regenerácia kostných defektov u laboratórnych potkanov je významne zvýšená pri použití mezenchymálnych kmeňových buniek uzavreté v keramickom ráme. Preto možno predpokladať, že ak nie RBOK, potom akýkoľvek iný faktor, odvodený z poškodených buniek strómy, má vzdialený stimulačný účinok na proliferáciu mezenchymálnych kmeňových buniek v neporušených oblastí kostnej drene a stimuluje ich migráciu do oblasti tkaniva defektu kostnej drene. Na druhej strane, to v rozpore s literárnymi údajmi z minulých rokov, čo naznačuje, že stromálne bunky sú zodpovedné za mikroprostredie, na rozdiel od krvotvorných buniek nie sú schopní preniesť a pochádzajú z miestnych zdrojov.

Avšak výsledky štúdie Gerasimov Yu et al (2001) ukazujú, že aplikácia mechanického traume spôsobuje nielen ostrý reštrukturalizáciu stromálny tkaniva kyuretirovannoy kostí, ale aj významné zmeny vo strómy vzdialených kostí neporušený, to znamená, že je systémová odozva stromálneho tkaniva pre lokálnu traumu. A pri použití polytrauma - viac kyretáž - táto reakcia je zosilnený a pozorovaná nielen v prevádzkovanej kosti a vzdialených častí kostry, ale aj v lymfatických orgánoch, najmä v slezine. Mechanizmus takejto odozvy systému zo stromálny tkaniva kostnej drene a sleziny a miestne poranenia polytrauma zostáva neznámy. Predpokladá sa, že tento proces je spojený s pôsobením humorálnej faktor uvoľnenej mezenchýmových stromálnych medulárnej dutiny kosti drene. Možnosť tvorby stromálne bunky kostnej drene a sleziny organonespetsificheskogo humorálnej faktor zodpovedný za proliferáciu buniek, tvoriacich kolónie fibroblasty ukazujú údaje o ich kolónie stimulujúce činnosť v jednovrstvových kultúrach kostnej drene.

V tejto súvislosti je potrebné poznamenať, že ak sa podáva systémovo multipotentních mezenchýmových prekurzorov buniek repopulating ich deriváty nielen kostnej drene, ale aj iné tkanivá, ktorá sa používa, najmä pre génovú terapiu. Je ukázané, že po intravenóznom podaní veľkých množstiev MSC s genómu divokého typu myší s mutantný kolagén gén Aj darcovských buniek nahradiť až 30% buniek v kostnej a chrupavkové tkaniva príjemcu a transfekciou mezenchýmových buniek kmeňových myšiach vylučujúcich IL-3 človeka, na 9 mesiacov účinne podporovať krvotvorbu v prípade ich súčasnom podaní s ľudskými krvotvorných kmeňových buniek do imunodeficientných myší.

[3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10]

Genetická modifikácia mezenchymálnych kmeňových buniek

Ďalšie experimentálne úspech genetickej modifikácie potrebné poznamenať, MSC transfekcia génu pre faktor IX v ľudských MSC následným prevodom transfektantů buniek imunodeficientných myší, čo vedie k objaveniu krvného Antihemophilic faktora B po dobu 8 týždňov po transplantácii. V tomto experimente bola vykonaná posttranslačná modifikácia faktora IX s y-glutamylkarboxylázou v transfekovaných bunkách. Transdukcia MSC s retrovirusove vektor kódujúci ľudský faktor IX, bol menej úspešný - následné zavedenie týchto buniek s hemofíliou psom v terapeutickej faktora IX, ktorý podporuje normálnu koagulačné intenzita hemostázu, len po dobu 12 dní.

Transplantácia mezenchymálnych kmeňových buniek do mozgového parenchýmu zvierat ukázala, že nedospelé bunky darcu sa transformujú tak v populácii neurónov, ako aj v gliách. Prežívanie neurónové deriváty zdravého darcu mezenchýme tkanivo teoreticky umožňuje korekciu genetických abnormalít metabolizmu mozgu u pacientov s Gaucherovou chorobou a ďalších porúch metabolizmu lipidov, sacharidov alebo Gangliozidy.

Pokračovanie experimentálne podmienky vyhľadávania transdiferenciaci kmeňových buniek v kostnej drene stromálny prekurzorov v nervovej a pečeňového tkaniva. Pozornosť výskumníkov je zameraná na kombinácie induktorov diferenciácie a špeciálnych kondicionačných médií. Najmä pre izoláciu primárnu kultúru s 10% fetálneho teľacieho séra, stromálne bunky kostnej drene umyjú a resuspendujú v DMEM / F12 médiu kultúry (1/1) sa očkujú v hustote 200,000 / cm2. Po 24 hodinách sa neadherující bunky odstránené a pripojené k plastovej fibroblastové bunky sa kultivujú po dobu jedného týždňa. Pre diferenciáciu stromálnych buniek kostnej drene na Neuroblasty používaných kondiciované médium získané kultiváciou trojdňovej kultúry primárnych myších embryonálnych fibroblastov, a to aj medzi DMEM / F12 (1/1) s 2% fetálneho teľacieho séra a doplnenom 20 ng / ml alebo 10-6 M LiF kyselina retinová (neyroinduktory, ktoré sú aplikované do neurálnej diferenciáciu myších embryonálnych kmeňových buniek a človek). Diferenciácia stromálnych buniek kostnej do progenitorových buniek do hepatocytov bola indukovaná klimatizovaného prostredia, vytvorené ako výsledok trojdňovej kultivácii primárne kultúry embryonálnych myších pečeňových buniek v DMEM / F12 (1/1) médiu doplnenom 10% fetálneho teľacieho séra.

Treba poznamenať, že bunky vytvárajúce kolónie stromy kostnej drene sú heteromorfné a môžu byť rozdelené na dva typy. Prvý typ zahŕňa bunky podobné fibroblastom, ktoré tvoria filopodické bunky s veľkými jadrami a jedným alebo dvoma nukleóliami. Druhý typ je reprezentovaný malými bunkami v tvare vretiendu. U oboch typov bunkovej kultúry v kondicionovanie médiu získané na živnej vrstve primárnych myších embryonálnych fibroblastov, a na Z-4-tý deň kultivácia buniek objavia Podobne Neuroblasty. V tomto štádiu majú často vretenovitú formu s jedným alebo dvoma dlhými procesmi, ktoré končia filopodiou. Pyramidálne alebo stelátové bunky s krátkymi dendritmi sú menej časté. Dendrity jeden Neuroblasty majú typické rozšírenia (rast obličiek) a vetvenia v jeho distálnej časti, druhý - s výraznou Rastové vrcholy filopodia, prostredníctvom ktorého dochádza k rastu dendritov. Podobné morfologické vlastnosti (rastové obličiek kužele a filopodia a) vlastné neuroblastóm, diferencujú na neuróny, sú podrobne popísané v publikáciách podľa neurogeneze. Na tomto základe niektorí autori dospeli k záveru, že bunky, ktoré detegujú v kultúre, sú neuroblasty. Najmä Schegelskaya E. Et al (2002), po primárnej kultúry buniek strómy kultivovaných počas dvoch týždňov v vymeniteľné na každom z-a-4.deň kondicionovaného média zistené, že časť proliferujúcich buniek, nediferencovaný zachovanie stavu. Vonkajšie takéto bunky vyzerali ako fibroblasty a boli identifikované v kultúre spolu s diferenciačnými neuroblastmi. Väčšina buniek (približne 80%) bola v rôznych štádiách diferenciácie do buniek nervového tkaniva, najmä do neurónov. Dendritické procesy týchto buniek sa navzájom tesne dotýkajú, takže postupne vytvárajú bunky na substrátových častiach nervovej siete vo forme dlhých mnohobunkových vlákien. Dendritické procesy neuroblastov rástli oveľa dlhšie, niektoré z nich boli 8 až 10-krát vyššie ako dĺžka tela samotného neurónu. Postupne sa zvýšil podiel pyramidálnych a stelátových buniek. Dendrity stelátových buniek rozvetvené. Podľa autorov neskoršia diferenciácia pyramídových a stelátových buniek v porovnaní s tými v tvare vretena zodpovedá postupnosti štádií normálnej neurogenézy u zvierat. Výsledkom je, že autori došli k záveru, že kmeňové bunky strómy kostnej drene sú bunky vystavené indukované neurogeneze v tomto procese in vitro generované Neuroblasty zo všetkých troch hlavných typov neurónov. Prekurzory nervových buniek boli tiež nájdené v kultúre bunkami stromálnych kostnej drene po dobu 3-4 dní v médiu s 2% fetálnym sérom a 20 ng / ml LIF. Ale v tomto prípade boli kmeňové bunky rozdelené veľmi pomaly, diferenciácia neuroblastov sa vyskytla iba v 30% prípadov a netvorili neurónové siete. Použitie ako nervových buniek induktory diferenciácie kyseliny retinovej, autorov získané v kultúre na 25-30% z nervových buniek s prevahou gliových buniek - astrocyt a oligodendrocyty. Neuróny predstavovali iba tretinu všetkých nervových buniek, aj keď boli reprezentované všetkými tromi typmi: fusiformnými, pyramídovými a stelátovými bunkami. Na 6. Deň kultivácie buniek strómy v kyseline retinovej strednej nervové bunky sa stali viac diferencovaný, zatiaľ čo bolo zistené, jednotlivé axóny pyramídových neurónov, ktoré v normálnom neuroontogenesis sa objaví neskôr tvorbu dendritických procesov. Podľa autorov, aj napriek nízkemu výťažok nervových buniek, spôsob vyvolanie kyselinu retinovou má výhody: astrocyt a oligodendrocyty a myelinating ovládať kŕmne funkcie v priebehu rastu axónov a dendritov a sú nevyhnutné pre tvorbu normálny nervového tkaniva. Preto na opravu poškodených miest in vivo je lepšie použiť suspenziu neurónov obohatených gliovými bunkami.

V druhej sérii experimentov sme sa pokúsili indukovať diferenciáciu stromálnych buniek kostnej drene v pečeňových bunkách. Po trojdňovej kultivácii strómy kostnej drene kmeňových buniek v kondicionovanie médiu získané inkubáciou myších zárodočných hepatocyty, bolo zistené, že veľké, guľovité tvaru bunky, často dve jadrové, cytoplazmatickej inklúzie s rôznou veľkosťou. Tieto bunky boli v rôznych štádiách diferenciácie, a líšili vo veľkosti, počtu jadier a cytoplazmatických inklúzií. Vo väčšine z týchto buniek bola detekovaná glykogénu, čím sme identifikovali ich ako hepatocytov prekurzorov buniek. Vzhľadom k tomu, kultúry boli detekované žiadne bunky Podobne Neuroblasty, následne k záveru, že v kondicionovanie médiu získané kultiváciou embryonálnych hepatocyty, neexistujú žiadne faktory diferenciácie nervových buniek, a naopak, existujú faktory, ktoré indukujú diferenciáciu stromálnych buniek kostnej drene do progenitorov hepatocytov , Autori predpokladajú prítomnosť pluripotentných buniek z strómy kostnej drene, ako sa diferencujú in vitro na bunkách pečene alebo nervového tkaniva v závislosti na špecifických kondiciovaného média, a induktormi.

V niektorých dielach je skutočne správne zobrazená diferenciácia stromálnych buniek kostnej drene do kardiomyocytov, buniek chrupky, kostí a nervových tkanív. Existuje informácia, že medzi bunkami kostnej drene sú populácie kmeňových buniek, ktoré sa môžu diferencovať na hepatocyty. Vo svetle týchto výsledkov vyššie uvedených pokusov na myšiach možno stále považovať za ďalšie potvrdenie prítomnosti v kostnej dreni pluripotentné mezenchymálnych kmeňových buniek, ktoré majú schopnosť diferenciácie do buniek rôznych tkanív dospelého organizmu.

Transplantácia mezenchymálnych kmeňových buniek

V klinickej transplantácie ľudských mezenchymálnych kmeňových buniek môžu byť použité pre expanziu hematopoetických kmeňových buniek a ich ranej potomkovia prekommitirovannyh. Najmä zavedenie autológnych krvotvorných kmeňových buniek u pacientov s rakovinou a MSC po chemoterapii u vysoko urýchľuje obnovu neutrofilov a krvných doštičiek v periférnej krvi. Autológna a alogénna transplantácia mezenchymálnych kmeňových buniek používaných na liečbu mnohopočetného myelómu, aplastickej anémie, spontánna trombocytopénia - ochorení spojených s primárnou defekt hematopoetických stromálne tkaniva. Účinnosť bunkovej terapie v hematologických patologických stavov v mnohých prípadoch vyššia, zatiaľ čo zavedenie stromálnych a krvotvorných kmeňových buniek, čo sa prejavuje zníženie pooperačnom období rekonvalescencie, krvi, zníženie počtu úmrtí v dôsledku ne-selektívnu deštrukciu regionálnych a cirkulujúcich nádorových buniek, v ktorých matrice a jej vlastné progenitorové bunky hematopoetické pacienta. MSC sľubná aplikácií a ďalších multipotentní mezenchýmových prekurzorové bunky v klinickej praxi v dôsledku svojej relatívnej jednoduchosť získania vdychovanie kostnej drene, expanzie v kultúre a transfekciu terapeutického génu. Tak pre kompenzáciu vady miestnej tkaniva možno použiť miestne implantácii multipotentních mezenchýmových prekurzorov buniek a v systémovej dysfunkcie tkanív mesenchymálního pôvodu nie je vylúčené ich zavedenia do obehu.

Opatrnejší v ich tvrdenia autorov, v ktorej perspektívy MSC pre lokálne, systémové transplantáciu a génovej terapie sa analyzujú z hľadiska biológie buniek strómy. Postnatálnu kostná dreň je tradične považovaný za teleso sa skladá z dvoch hlavných systémov rôznych bunkových línií - vlastne krvotvorného tkaniva a jeho pridružené podporné väzivové tkanivá. Z tohto dôvodu, kostnej drene mezenchýme kmeňové bunky pôvodne len ako zdroj stromálneho základ pre výrobu regulačných faktorov hematopoetické mikroprostredie. Potom pozornosť výskumníkov prešla k štúdiu úlohy MSC ako kmeňového zdroja kostrových tkanív. Najnovšie údaje naznačujú neočakávaný potenciál diferenciácie stromálnych buniek kostnej drene s tvorbou nervového alebo svalového tkaniva. Inými slovami, mezenchýmových kmeňové bunky vykazujú transgermalnuyu plasticitu - schopnosť diferenciácie do bunkovej typy, ktoré fenotypovo ako pôvodný tkaniva buniek. Avšak, niektoré aspekty biológie stromálne bunky kostnej drene, zostávajú nejasné a nevyriešené všeobecne biologického plánu, a do určitej miery, vrátane identifikácie, pôvod a vývoj a funkciu v stromálnych buniek kostnej drene in vivo kostnú, ako aj prípustného potenciálny diferenciáciu ex vivo a možnosti terapeutické použitie in vivo. Údaje o potenciálnej príležitosti MSC, ako aj výsledky štúdií druhej regeneračné potenciálu kmeňových buniek, v ostrom kontraste so zavedenou dogma v biológii.

Ak sa kultivujú v podmienkach s nízkou hustotou, stromálne bunky kostnej drene tvoria odlišné kolónie, z ktorých každý je derivátom jedinej prekurzorovej bunky. Percento stromálnych bunkových prekurzorov v bunkách kostnej drene nukleace je definované v ich schopnosti tvoriť kolónie veľmi závisí od podmienok kultivácie a druhy z MSC, ktoré patria. Napríklad u hlodavcov pre získanie maximálneho množstva stromálnych progenitorových buniek, je nevyhnutné, v prítomnosti ožiarených podávača kultúry buniek kostnej drene a séra, zatiaľ čo kolónie tvoriace účinnosti ľudských mezenchýmových kmeňových buniek, je nezávislý na podávača, alebo z kultivačného média. Počet známych mitogénnych faktorov stimulujúcich proliferáciu stromálnych progenitorových buniek je obmedzený. Tieto zahŕňajú PDGF, EGF, FGF, TGF-b a tiež IGF1. Za optimálnych podmienok kultivácie MSCS polyklonálne línie boli kultivované in vitro po dobu viac ako 50 bunkových delení, takže je možné získať miliardy stromálnych buniek kostnej drene od 1 ml aspirátu to.

Avšak, populácia stromálnych buniek kostnej drene je heterogénna, ktorá sa prejavuje ako variabilita vo veľkosti kolónií, iné rýchlosti ich vzniku a rôzne bunkové morfológie, ktorý zahŕňa rad fibroblastového ako vretená pre veľké ploché bunky. Pri vývoji takýchto plodín po 20 dňoch sa pozoruje aj fenotypová heterogénnosť. Niektoré kolónie sú vysoko exprimované alkalickou fosfatázou, iné nie sú vôbec exprimované a tretím typom kolónií je fosfatáza pozitívna v centrálnej oblasti a na periférii negatívna fosfatáza. Samostatné kolónie tvoria uzliny kostného tkaniva (začiatok mineralizácie matrice je označený, keď je zafarbený červenou alizarínovou alebo vápnikom Van-Kossom). V iných kolóniách dochádza k akumulácii tuku, identifikovanej G-farbením s olejovou červenou. Menej často kolónie mezenchymálnych kmeňových buniek tvoria chrupky, ktoré sú sfarbené alkánovou modrou).

Po ektopickej transplantácii u pokusných zvierat polyklonálne MGK vytvorí línie ektopickej kosti stróma s setchatoobraznoy spojené s myelopoiesis a adipocytov, a tiež, ale len zriedka, s chrupavkového tkaniva. V monoklonálna línií transplantáciu stromálne bunky kostnej drene v niektorých prípadoch chimérizmus, vyznačujúci sa tým, de novo tvorený kostného tkaniva zložené z kostných buniek, adipocyty obsahuje stróma a darcu pôvodu, zatiaľ čo bunkové línie hematopoetických a cievneho systému sú odvodené od príjemcu.

Výsledky týchto štúdií potvrdzujú stonkovú povahu prekurzora stromálnej kostnej drene, z ktorej bola získaná klonálna línia. Súčasne dokazujú, že nie všetky klonovanie v bunkách kultúry sú skutočne multipotentné kmeňové bunky. Niektorí vedci sa domnievajú, sme vyjadrili svoj názor, že najpresnejšie informácie o skutočnom potenciáli odlíšenie jednotlivých klonov možno získať iba in vivo po transplantácii, skôr než stanovením fenotypu ich derivátov in vitro. Expresie v osteo- kultúra fenotypových markerov hondro- alebo adipogeneze (stanovené z mRNA, alebo prostredníctvom histochemické techniky), a to aj výroba mineralizovanej matrica neodráža stupeň pluripotentním jedného klonu in vivo. Identifikácia kmeňových buniek v skupine stromálnych buniek je preto možná iba za poschodia za vhodných podmienok testu biologickej transplantácie. Najmä chondrogenesis veľmi zriedka pozorované v transplantačných otvorených systémoch, zatiaľ čo tvorba chrupavky nie je nezvyčajné v uzavretých systémoch, ako sú napríklad difúzne komory, alebo v mikromassnyh kultúrach stromálnych buniek in vitro, vyznačujúci sa tým dosiahne lokálne nízky tlak kyslíka, prispievajú k tvorbe chrupavky. Preto aj technika transplantácie, ako aj nešpecifické kultivačné podmienky in vitro významne ovplyvňujú rozsah MSC diferenciácie.

Experimentálna transplantácia s dodržaním daných experimentálnych podmienok je zlatým štandardom pre stanovenie potenciálu diferenciácie stromálnych buniek kostnej drene a kľúčovým prvkom ich správnej identifikácie. Historicky, štúdie transplantácie kostnej drene kostnej drene sú spojené s bežným problémom transplantácie kostnej drene. Bolo zistené, že hemopoetické mikroprostredie je vytvorené transplantáciou stromálnych buniek kostnej drene a poskytuje ektopický vývoj hemopoetického tkaniva v transplantačnej zóne. Vznik mikroprostredia od darcu a hematopoetické tkanivo - od hostiteľa nám umožňuje liečiť ektopickú kosť ako skutočnú "obrátenú" transplantáciu kostnej drene. Miestna transplantácia stromálnych buniek kostnej drene podporuje efektívnu korekciu kostných defektov, výraznejšia ako pri spontánnej reparačnej regenerácii. V niekoľkých predklinických štúdiách na zvieracích modeloch presvedčivo preukázali možnosť transplantácie stromálne bunky kostnej drene v ortopédii, aj keď pre optimalizáciu týchto metód, a to aj v najjednoduchších prípadoch vyžadujú obozretnejšie prácu a analýzu. Najmä optimálnych podmienok pre rozšírenie ex vivo osteogénny bunky strómy doteraz nastavená, žiadne výfukové Štruktúra a zloženie sú vhodné nosiče a počet buniek potrebných pre regeneráciu objemu kosti.

Okrem použitia vypestované ex vivo kostnú stromálnych buniek pre regeneráciu tkanív mesenchymálního pôvodu neortodoxný duktilita MSC otvára potenciálne použitie pre regeneráciu nervových buniek, alebo dodanie génových produktov v CNS. V zásade to zjednodušuje bunkovú terapiu pri porážke nervového systému, pretože nie je potrebné získavať autológne nervové kmeňové bunky od ľudí. Uvádzajú sa možnosti použitia buniek kostnej drene na generovanie kardiomyocytov a myogénnych prekurzorových buniek ako skutočný stromálny a vonkajší pôvod.

Prebiehajú experimenty na systémovú transplantáciu stromálnych buniek kostnej drene na liečbu bežných ochorení skeletu. Niet pochýb o tom, že stromálne bunky kostnej drene sú populácie zodpovedné za genetických porúch ochorení skeletu, ktorý je dobre vidieť do prenosového vektora pomocou genetickej informácie buniek, čo vedie k tvorbe patologickej kostného tkaniva u pokusných zvierat. Avšak schopnosť stromálnych buniek implantovať, rásť, množiť a diferencovať v kostiach kostry po zavedení do celkového krvného obehu ešte nebola preukázaná.

To je čiastočne spôsobené tým, že štandardný postup strómy kostnej drene nie sú transplantované krvotvorné tkanivá, takže prísne kritériá pre hodnotenie úspešné uchytiť sa systémové podávanie stromálne bunky majú byť ešte vyvinuté. Malo by sa pamätať na to, že prítomnosť markerových génov v tkanivových extraktoch alebo izolácia buniek pôvodu z darcov v kultúre neznamená, že by došlo k vylúčeniu buniek, ale iba k ich prežitiu. Aj intraarteriálnej injekcie stromálne bunky kostnej drene v myšiam končatiny môže viesť k prakticky nulovej výsledok štepu, a to napriek skutočnosti, že bunky darcu odvodené nachádza vo veľkom množstve v rámci siete mikrovaskulárna kostnej drene. Bohužiaľ, takéto bunky sú zvyčajne opísané ako "engrafované" iba na základe výsledkov stanovenia génov markerových darcov v podmienkach ex vivo kultivácie. Okrem toho je potrebné poskytnúť presvedčivé dôkazy o dlhodobej integrácii diferencovaných a funkčne aktívnych buniek pôvodu darcov v tkanivách. V mnohých uverejnených dielach, kde sa uvádza, že v štruktúre sa ukladajú stromálne bunky kostnej drene, nedostatok jasných údajov tohto druhu je pozoruhodný. Napriek tomu je potrebné poznamenať, že v niektorých správnych pokusoch na zvieratách sa však po systemickom podávaní stanovilo obmedzené, ale skutočné vytesnenie stromálnych progenitorových buniek.

Tieto údaje sú v súlade s výsledkami štúdie o možnosti dodania myogénnych prekurzorových buniek kostnej drene do svalov cez cievny systém. Nesmie sa však zabúdať, že počas vývoja a rastu vzniká ako kostrové, tak svalové tkanivo na základe extravaskulárnych pohybov buniek, ktoré využívajú migračné procesy, ktoré nezahŕňajú cirkuláciu v krvi. Ak skutočne existuje nezávislá obehová dráha na dodávanie prekurzorových buniek do tkanív v tuhej fáze, je možné umožniť existenciu fyziologicky cirkulujúcich mezenchýmových progenitorových buniek? Aký je pôvod týchto buniek v rozvíjajúcom sa i postnatálnom organizme a ako prenikajú do cievnej steny? Riešenie týchto problémov je absolútne nevyhnutné a vyžaduje najdôkladnejšiu predklinickú analýzu. Dokonca aj po nájdení odpovedí na tieto otázky, problematické kinetické aspekty spojené s rastom skeletu a prestavbou spojivového tkaniva zostávajú nevyriešené. Súčasná liečba porúch osteogenézy nahradením celej populácie mutovaných skeletálnych progenitorových buniek zdravými stromálnymi bunkami sa javí ako skutočná klinická perspektíva. V tomto prípade miestnej deformácie alebo zlomenia v dôsledku patologických zóna osteogenesis a kostí deštruktívne zmeny môžu byť opravené pomocou in vitro kultivované stromálne kmeňové bunky. Preto by smer budúceho výskumu mal byť zameraný na problémy transformácie alebo genetickej korekcie autológnych mutovaných osteogénnych progenitorových buniek ex vivo.

Génové inžinierstvo bunky, dočasne alebo trvalo, sa stal základom bunkovej a molekulárnej biológie, zdroj mnohých vedeckých poznatkov týkajúcich sa úlohy jednotlivých proteínov v bunkovom metabolizme in vitro látkami a in vivo. Využitie molekulárnych techník pre korekciu dedičné choroby a ľudských ochorení je veľmi sľubné pre praktické medicíne, pretože vlastnosti stromálne kmeňové bunky kostnej drene sa nechá vyvíjať jedinečné obvodov transplantáciu pre korekciu genetických ochorení skeletu. V tomto prípade mezenchýme progenitorové bunky možno získať pomerne ľahko z budúceho príjemcu, sú prístupné genetickej manipulácie a sú schopné množiť vo veľkom množstve v krátkom časovom období. Použitie mezenchymálnych kmeňových buniek zabraňuje obmedzeniam a rizikám spojeným s dodávaním genetického informačného materiálu priamo pacientovi prostredníctvom vektorových štruktúr. Takáto stratégia je uplatniteľná na embryonálne kmeňové bunky, avšak autológne postnatálne stromálne bunky kostnej drene sú najvýhodnejším materiálom, pretože ich podávanie vylučuje možné imunologické posttransplantačné komplikácie. Za účelom dosiahnutia krátkodobý efekt, napríklad za účelom urýchlenia regenerácie kostí, optimálna metóda je genetická modifikácia mezenchymálnych kmeňových buniek za použitia elektroporatsrsh, chemické syntézy, lipofekce, plazmidov a adenovirové konštrukty. Konkrétne vírusová transfekcia do stromálnych buniek BMP-2 kostnej drene bola účinná pri urýchlení regenerácie kostí v experimentálnej polytraume. Tvorba adenovírusových vektorových štruktúr je výhodnejšia kvôli absencii toxicity. Avšak genetická modifikácia stromálnych buniek kostnej drene je v tomto prípade charakterizovaná mimoriadne nízkou stabilitou. Navyše, normálne transformované stromálne bunky kostnej drene vyžadujú použitie vektorových nosičov genetickej informácie 10 krát viac infekčných ako iné bunkové typy, čo významne zvyšuje percento úmrtia transfekovaných buniek.

Na liečbu recesívne ochorení spôsobených nízkou alebo žiadnou biologickú aktivitu určitých génov potrebné kratšie alebo trvalé modifikácie mezenchymálnych kmeňových buniek, čo vyžaduje použitie prasitrynes-asociované vírusy, retrovírusy, lentiviry a prasitrynes-retrovirusove chiméry. Dopravné časti týchto vírusov sú schopné prenášať veľké DNA transfektomy (8 kb). V odbornej literatúre sa už objavili informácie o biologickej aktivite exogénnych stromálne bunky kostnej drene transfektovaných retrovirusove konštrukty kódujúce syntézu regulačných molekúl, a markerov - IL-3, CD2, faktor VIII, a enzýmy podieľajúce sa na syntéze L-DOPA. Ale v týchto dielach autori poukazujú na niekoľko obmedzení, ktoré treba prekonať ešte predtým, ako začne praktická aplikácia tejto technológie. Prvým problémom je optimalizácia procesu modifikácie MCK ex vivo. Je známe, že prolongácia (3-4 týždňov) proliferácie stromálnych buniek kostnej drene in vitro znižuje ich transfekciu. Súčasne je potrebných niekoľko cyklov transfúzie na dosiahnutie vysokej úrovne genetickej modifikácie MSC. Druhý problém súvisí s trvaním expresie terapeutického génu, ktorý ešte nepresahuje štyri mesiace. Prirodzený pokles účinnej expresie génov je spôsobený inaktiváciou promótorov a smrťou modifikovaných buniek. Všeobecne vyhliadky prenosu genetickej informácie pomocou mezenchymálnych kmeňových buniek Výsledky predbežných štúdií ukazujú, že je potrebné pre ďalšiu optimalizáciu transfekčních metód ex vivo, výberom zodpovedajúce promótor reguluje biologickej aktivity v správnom smere, a zvyšuje schopnosť modifikovaných kostnej stromálnych buniek kostnej drene samoobnoveni in vivo po transplantácii. Je potrebné poznamenať, že použitie retrovírusových konštruktov pre modifikáciu stromálne bunky kostnej drene v požadovanom smere nevyžaduje vždy ich povinné uchytiť sa štepu. Transfekované mezenchymálnych kmeňových buniek možno vykonať nápravné funkcie na pozadí stabilné a bydliska bez nutnosti fyzického aktívne začlenenie a fungujúce v spojivovom tkanive. V tomto prípade by sa mali považovať za biologickú mini-pumpu, ktorá produkuje in vivo faktor, ktorého deficit určuje prejav genetickej patológie.

Použitie transformovaných kostnej stromálnych buniek kostnej drene pre liečenie dominantné genetické ochorenie, ktoré sa vyznačuje tým, expresie génu alebo abnormálne patologické biologickej aktivity, je oveľa viac problematické, pretože v tomto prípade je nutné blokovať prenos alebo predaj genetickej informácie skreslený. Jednou z metód genetického inžinierstva je homológna rekombinácia embryonálnych kmeňových buniek s cieľom vytvoriť transgénne zvieratá. Avšak, veľmi nízka úroveň homológnej rekombinantným, v kombinácii s problematikou identifikácie, oddelenie a rozšírenie týchto rekombinantným je nepravdepodobné, že by podporovať široké využitie tejto techniky v blízkej budúcnosti, a to aj v prípade, pri vývoji nových technologických postupov. Druhý prístup ku génovej terapii je založený na dominantné patológiu automatickej korekcie poškodenej DNA ako genetické mutácie môžu byť opravené zavedenie exogénne DNA s požadovanou sekvenciou (krátke DNA oligonukleotidov, alebo chimerická RNA / DNA oligonukleotidov), ktoré sa viažu na homolog v poškodenej genómu. Tretí vykonanie tohto vynálezu poskytuje patologické nálezy prenosový zámok, ktorého je dosiahnuté pomocou špeciálne navrhnutých oligonukleotidov, ktoré sa viažu na určitý gén za vzniku ternárního skrutkovitými štruktúru, ktorá vylučuje možnosť transkripcie.

Aj keď je korekcia genetických chorôb na úrovni genómu, je optimálny a výhodné liečebná metóda, mRNA je tiež sľubným vektor (možno ešte prístupné) pre blokovanie dominantný negatívny gén. Aby bolo možné inhibíciu translácie a / alebo pri zvýšení degradácie mRNA už dlho používa sa proteínové molekuly antisencie oligonukleotidových sekvencií alebo plné blokovanie naviazanie mRNA biosyntetického aparátu bunky. Navyše dvojvláknová RNA indukuje rýchlu degradáciu mRNA, ktorej mechanizmus zostáva nejasný. Je však nepravdepodobné, že samotné odstránenie mRNA transkribovaných z mutantný alely s krátkymi alebo jednotlivých mutácií bude podporovať expresiu mRNA z normálnej alely. Alternatívou je použitie ribozinov Hammerhead a Vlásenka, majú schopnosť viazať sa na vysoko špecifických miestach mRNA s následnou indukciou ich štiepenie a inaktiváciu počas prekladu. V súčasnosti sa skúma možnosť použitia tejto metódy na liečbu patologickej osteogenézy. Bez ohľadu na to, čo je presne cieľ - genómovej alebo cytoplazmatickej prvky úspech nových technológií génovej terapie bude stanovená účinnosť zahrnutím činidiel v kostnej stromálnych buniek kostnej drene ex vivo, optimálnu voľbu konkrétneho vektora a stabilné schopnosti mezenchýmových kmeňových buniek, ktoré exprimujú požadovaný faktorov in vivo.

To znamená, že objav mezenchymálnych kmeňových buniek s ich neočakávané vlastnosti vytvára nový koncepčný rámec bunkových línií. Ale pochopiť biologickú úlohu stromálnych kmeňových buniek, na ich povahu, schopnosť transdiferenciace alebo dediferenciaci, ich fyziologický význam v procese embryonálneho vývoja, postnatálny rast, dozrievanie a starnutia, ako aj v ľudských chorôb vyžadujú interdisciplinárny výskum.