Mezenchýmové kmeňové bunky

Medzi regionálnymi kmeňovými bunkami zaujímajú osobitné miesto mezenchymálne kmeňové bunky (MSC), ktorých deriváty tvoria stromálnu matricu všetkých orgánov a tkanív ľudského tela. Priorita vo výskume MSC patrí predstaviteľom ruskej biologickej vedy.

V polovici minulého storočia bola v laboratóriu A. Friedensteina prvýkrát izolovaná homogénna kultúra multipotentných stromálnych kmeňových buniek kostnej drene. Mezenchymálne kmeňové bunky pripojené k substrátu si dlhodobo udržiavali vysokú intenzitu proliferácie a v kultúrach s nízkou hustotou výsevu po fixácii na substráte tvorili klony buniek podobných fibroblastom, ktoré nemali fagocytárnu aktivitu. Ukončenie proliferácie MSC sa skončilo ich spontánnou diferenciáciou in vitro na bunky kostí, tuku, chrupavky, svalov alebo spojivového tkaniva. Ďalšie štúdie umožnili stanoviť osteogénny potenciál buniek podobných fibroblastom strómy kostnej drene rôznych druhov cicavcov, ako aj ich aktivitu tvorby kolónií. Experimenty in vivo ukázali, že hetero- aj ortotopická transplantácia buniek podobných fibroblastom tvoriacich kolónie vedie k tvorbe kostného, chrupavkového, fibrózneho a tukového tkaniva. Keďže stromálne kmeňové bunky kostnej drene sa vyznačujú vysokou schopnosťou samoobnovy a mnohostrannou diferenciáciou v rámci jednej bunkovej línie, nazývajú sa multipotentné mezenchymálne progenitorové bunky.

Treba poznamenať, že za 45 rokov základného výskumu mezenchymálnych kmeňových buniek sa vytvorili reálne podmienky pre využitie ich derivátov v klinickej praxi.

Dnes niet pochýb o tom, že všetky tkanivá ľudského tela sú tvorené z kmeňových buniek rôznych bunkových línií v dôsledku procesov proliferácie, migrácie, diferenciácie a dozrievania. Až donedávna sa však predpokladalo, že kmeňové bunky v dospelom organizme sú tkanivovo špecifické, t. j. schopné produkovať línie špecializovaných buniek iba tých tkanív, v ktorých sa nachádzajú. Tento koncepčný postoj bol vyvrátený faktami transformácie hematopoetických kmeňových buniek nielen na bunkové prvky periférnej krvi, ale aj na oválne bunky pečene. Okrem toho sa ukázalo, že nervové kmeňové bunky sú schopné dať vzniknúť neurónom aj gliovým elementom, ako aj včasným viazaným líniám hematopoetických progenitorových buniek. Mezenchymálne kmeňové bunky, ktoré zvyčajne produkujú bunkové prvky kostí, chrupavky a tukového tkaniva, sú zase schopné transformácie na nervové kmeňové bunky. Predpokladá sa, že v procese rastu, fyziologickej a reparatívnej regenerácie tkaniva sa neviazané progenitorové bunky generujú z tkanivovo nešpecifických kmeňových rezerv. Napríklad, oprava svalového tkaniva sa môže uskutočniť vďaka migrácii mezenchymálnych kmeňových buniek z kostnej drene do kostrových svalov.

Hoci takúto krížovú zameniteľnosť kmeňových buniek neuznávajú všetci výskumníci, možnosť klinického využitia mezenchymálnych kmeňových buniek ako zdroja pre bunkovú transplantáciu a bunkového vektora genetickej informácie už nikto nespochybňuje, rovnako ako multipotenciu stromálnych kmeňových buniek kostnej drene, ktoré sa dajú relatívne ľahko izolovať a rozmnožovať v in vitro kultúre. Zároveň sa vo vedeckej literatúre naďalej objavujú správy o potenciálnej pluripotencii stromálnych kmeňových buniek kostnej drene. Ako dôkaz sa uvádzajú výskumné protokoly, v ktorých sa pod vplyvom špecifických induktorov transdiferenciácie MSC transformujú na nervové bunky, kardiomyocyty a hepatocyty. Niektorí vedci však majú vážne pochybnosti o možnosti opakovanej aktivácie a expresie génov od obdobia ranej embryogenézy. Zároveň každý chápe, že ak sa nájdu podmienky pre rozšírenie multipotencie mezenchymálnych kmeňových buniek na pluripotenciu embryonálnych kmeňových buniek (ESC), automaticky sa vyriešia mnohé etické, morálne, náboženské a právne problémy v regeneratívnej plastickej medicíne. Navyše, keďže v tomto prípade sa zdrojom regeneračného kmeňového potenciálu stávajú autológne stromálne bunky pacienta, rieši sa aj problém imunitného odmietnutia bunkového transplantátu. Blízka budúcnosť ukáže, aké realistické sú tieto vyhliadky.

[ 1 ], [ 2 ]

Využitie mezenchymálnych kmeňových buniek v medicíne

V klinickej praxi sa použitie derivátov mezenchymálnych kmeňových buniek primárne spája s obnovou tkanivových defektov, ktoré sa vyskytujú pri rozsiahlych a hlbokých termických léziách kože. V predklinickom štádiu sa uskutočnilo experimentálne posúdenie uskutočniteľnosti použitia alogénnych mezenchymálnych kmeňových buniek podobných fibroblastom na liečbu hlbokých popálenín. Ukázalo sa, že mezenchymálne kmeňové bunky podobné fibroblastom z kostnej drene tvoria v kultúre monovrstvu, čo umožňuje ich transplantáciu s cieľom optimalizovať regeneračné procesy hlbokých popálenín. Autori poznamenávajú, že embryonálne fibroblasty majú podobnú vlastnosť, ale ich klinické použitie je obmedzené existujúcimi etickými a právnymi problémami. Hlboké termické popálenie s poškodením všetkých vrstiev kože bolo modelované na potkanoch Wistar. Plocha popáleniny predstavovala 18 – 20 % celkového povrchu kože. Prvú experimentálnu skupinu tvorili potkany s hlbokým termickým popálením a transplantáciou alogénnych mezenchymálnych kmeňových buniek podobných fibroblastom. Druhú skupinu tvorili zvieratá s hlbokým termickým popálením a transplantáciou alogénnych embryonálnych fibroblastov. Tretiu skupinu predstavovali kontrolné potkany s hlbokým termickým popálením, ktoré nepodstúpili bunkovú terapiu. Suspenzia fibroblastom podobných mezenchymálnych kmeňových buniek a embryonálnych fibroblastov bola aplikovaná na povrch popáleninovej rany pomocou pipety v množstve 2 x 10⁻⁴ ^.bunky na 2. deň po modelácii popáleniny a excízii výslednej nekrotickej chrasty. Po transplantácii buniek bol povrch popáleniny pokrytý gázovou obrúskou navlhčenou izotonickým roztokom chloridu sodného s gentamicínom. Bunky kostnej drene boli odobraté na získanie MSC s ich následnou indukciou do línie fibroblastom podobných mezenchymálnych kmeňových buniek z dospelých potkanov Wistar zo stehenných kostí. Embryonálne fibroblasty boli získané z pľúc 14-17 dní starých embryí. Embryonálne fibroblasty a bunky kostnej drene na získanie MSC boli predbežne kultivované v Petriho miskách pri teplote 37 °C v CO2 inkubátore, v atmosfére s 5 % CO2 pri 95 % vlhkosti. Embryonálne fibroblasty boli kultivované 4-6 dní, pričom tvorba monovrstvy MSC si vyžadovala 14 až 17 dní. Následne boli MSC kryokonzervované ako zdrojový materiál pre fibroblastom podobné mezenchymálne kmeňové bunky, ktoré boli získané rozmrazením a kultiváciou MSC počas 4 dní. Počet vytvorených fibroblastom podobných mezenchymálnych kmeňových buniek bol viac ako 3-krát vyšší ako počet embryonálnych fibroblastov vytvorených počas rovnakého kultivačného obdobia. Na identifikáciu transplantovaných buniek v popáleninových ranách v štádiu kultivácie bol ich genóm označený pomocou vírusového kyvadlového vektora založeného na rekombinantnom adenovíruse typu V nesúcom gén 1ac-2 kódujúci ß-galaktozidázu E. coli. Živé bunky v rôznych časoch po transplantácii boli imunohistochemicky detegované v kryorezoch s pridaním substrátu X-Gal, ktorý poskytuje charakteristické modrozelené farbenie. V dôsledku dynamického vizuálneho, planimetrického a histologického hodnotenia stavu popáleninovej rany sa zistilo, že už na 3. deň po transplantácii buniek sa vo vybraných skupinách objavujú významné rozdiely v priebehu procesu rany. Tento rozdiel sa stal obzvlášť výrazným na 7. deň po transplantácii buniek. U zvierat prvej skupiny, ktorým boli transplantované fibroblastom podobné mezenchymálne kmeňové bunky, rana nadobudla rovnomerne intenzívnu ružovú farbu, granulačné tkanivo prerástlo po celej ploche až na úroveň epidermy a povrch popáleniny sa výrazne zmenšil. Kolagénový film vytvorený na povrchu rany sa síce trochu stenčil, ale naďalej pokrýval celú plochu popáleniny. U zvierat druhej skupiny, ktorým boli transplantované embryonálne fibroblasty, granulačné tkanivo stúplo na úroveň epidermy okrajov rany, ale iba miestami, zatiaľ čo plazmorea z rany bola intenzívnejšia ako v 1. skupine a pôvodne vytvorený kolagénový film prakticky zmizol. U zvierat, ktoré nedostali bunkovú terapiu, bola popáleninová rana na 7. deň bledá, jamkovitá, s nekrotickým tkanivom pokrytým fibrínom. Plazmorea bola pozorovaná na celom povrchu popáleniny. Histologicky zvieratá 1. a 2. skupiny vykazovali pokles bunkovej infiltrácie a rozvoj cievnej siete.a tieto príznaky začínajúceho regeneračného procesu boli výraznejšie u potkanov 1. skupiny. V kontrolnej skupine sa pozorovali príznaky bunkovej infiltrácie rany, histologický obraz novovytvorených ciev chýbal. V 15. – 30. deň pozorovania bola plocha popáleninového povrchu u zvierat 1. skupiny výrazne menšia ako u potkanov ostatných skupín a granulačný povrch bol viac vyvinutý. U zvierat 2. skupiny sa plocha popáleninového povrchu tiež zmenšila v porovnaní s veľkosťou popáleninových rán u potkanov kontrolnej skupiny, čo sa stalo v dôsledku marginálnej epitelizácie. V kontrolnej skupine zostal popáleninový povrch miestami bledý so zriedkavými granuláciami, objavili sa na ňom cievne hviezdičky, boli tam ostrovčeky fibrínového plaku, po celom povrchu popáleniny pokračovala mierna plazmorea a na niektorých miestach zostala ťažko oddeliteľná chrasta. Vo všeobecnosti sa u zvierat 3. skupiny veľkosť rany tiež zmenšila, ale okraje rany zostali podkopané.

Počas porovnávacej štúdie rýchlosti hojenia rán s použitím fibroblastom podobných mezenchymálnych kmeňových buniek a embryonálnych fibroblastov, ako aj bez použitia bunkovej terapie, sa teda pozorovalo zrýchlenie rýchlosti hojenia popáleninového povrchu v dôsledku transplantácie fibroblastom podobných mezenchymálnych kmeňových buniek a embryonálnych fibroblastov. Avšak v prípade použitia alogénnych fibroblastom podobných mezenchymálnych kmeňových buniek bola rýchlosť hojenia rán vyššia ako pri transplantácii embryonálnych fibroblastov. To sa prejavilo v zrýchlení zmeny fáz regeneračného procesu - skrátili sa termíny bunkovej infiltrácie, zvýšila sa rýchlosť rastu cievnej siete, ako aj tvorba granulačného tkaniva.

Výsledky dynamickej planimetrie naznačujú, že miera spontánneho hojenia popáleninovej rany (bez použitia bunkovej terapie) bola najnižšia. 15. a 30. deň po transplantácii alogénnych mezenchymálnych kmeňových buniek podobných fibroblastom bola miera hojenia rán vyššia ako pri transplantácii embryonálnych fibroblastov. Histochemická metóda na detekciu beta-galaktozidázy ukázala, že po transplantácii mezenchymálnych kmeňových buniek podobných fibroblastom a embryonálnych fibroblastov zostávajú transplantované bunky životaschopné na povrchu aj v hĺbke regenerujúcich sa rán počas celého obdobia pozorovania. Autori sa domnievajú, že vyššia miera regenerácie popáleninovej rany pri použití mezenchymálnych kmeňových buniek podobných fibroblastom je spôsobená uvoľňovaním biologicky aktívnych rastových stimulačných faktorov týmito bunkami počas procesu dozrievania.

V klinickej praxi sa na liečbu popálenín používa aj transplantácia auto- alebo alogénnych keratinocytov a alogénnych fibroblastov. Treba poznamenať, že chirurgická liečba detí s rozsiahlymi hlbokými popáleninami je zložitá úloha kvôli vysokej traumatickej povahe a viacnásobným chirurgickým zákrokom, významnej strate krvi a rôznym reakciám na použité infúzne médiá. Hlavné ťažkosti pri vykonávaní plastických operácií kože pri rozsiahlych hlbokých popáleninách s plochou presahujúcou 40 % povrchu tela sú spôsobené závažnosťou stavu obetí a nedostatkom zdrojov darcovskej kože. Použitie sieťových transplantátov s vysokým koeficientom perforácie problém nerieši, pretože bunky vytvorené po perforácii epitelizujú veľmi pomaly a samotné kožné laloky často lýzujú alebo vysychajú. Takéto krytia popálenín, ako je xenokoža, kadaverózne alotransplantáty, syntetické filmové krytia, nie sú vždy dostatočne účinné, preto sa vyvíjajú nové metódy pokrytia povrchov popálenín vrstvami kultivovaných keratinocytov a fibroblastov. Konkrétne bola navrhnutá metóda pokrytia popáleninových povrchov pomocou kultivovaných alofibroblastov, ktoré po transplantácii majú výrazný stimulačný účinok na proliferáciu epidermocytov zachovaných v rane pri hraničných popáleninách, ako aj keratinocytov v septách sieťovaných transplantátov. Práca L. Budkevicha a spoluautorov (2000) predstavuje výsledky použitia tejto metódy na liečbu popálenín u detí. Štúdia zahŕňala 31 detí s tepelnou traumou vo veku od 1 roka do 14 rokov. U troch detí bola celková plocha popáleninových rán stupňa IIIA-B - IV 40 %, u 25 50-70 %, u ďalších troch 71-85 % povrchu tela. Včasná chirurgická nekrektómia bola kombinovaná s transplantáciou kultivovaných alofibroblastov a autodermoplastikou. Prvá fáza liečby zahŕňala excíziu nekrotických tkanív, druhá fáza zahŕňala transplantáciu kultivovaných alofibroblastov na nosičových filmoch a tretia fáza (48 hodín po transplantácii kultivovaných alofibroblastov) zahŕňala odstránenie matrice a autodermoplastiku kožnými lalokmi s pomerom perforácie 1:4. Traja pacienti prijatí na kliniku s ťažkou popáleninovou chorobou mali kultivované alofibroblasty transplantované na granulujúce rany. Transplantácia kultivovaných alofibroblastov bola vykonaná raz u 18 detí, dvakrát u 11 detí a trikrát u dvoch pacientov. Plocha povrchu rany pokrytá bunkovou kultúrou sa pohybovala od 30 do 3500 cm2. Účinnosť kultivovaných alofibroblastov bola hodnotená celkovým percentom uchytenia kožného štepu, časom hojenia popálenín a počtom úmrtí v dôsledku ťažkej tepelnej traumy. Uchytenie štepu bolo úplné u 86 % pacientov. Čiastočné neuchytenie kožných štepov bolo zaznamenané v 14 % prípadov. Napriek liečbe zomrelo šesť (19,3 %) detí. Celková plocha poškodenia kože u nich sa pohybovala od 40 do 70 % povrchu tela.Transplantácia kultivovaných alofibroblastov nebola u žiadneho pacienta spojená s úmrtnosťou pri popáleninovom poranení.

Pri analýze výsledkov liečby autori poznamenávajú, že predtým hlboké tepelné poškodenie kože pokrývajúce 35 – 40 % povrchu tela bolo považované za nezlučiteľné so životom (u mladších detí – do 3 rokov – sú kritické hlboké popáleniny pokrývajúce 30 % povrchu tela, u starších detí – viac ako 40 % povrchu tela). Pri vykonávaní chirurgickej nekrektómie s transplantáciou kultivovaných alofibroblastov a následnou autodermoplastikou kožnými lalokmi s vysokým koeficientom perforácie zostávajú popáleniny IIIB – IV stupňa kritické, ale v súčasnosti existujú v mnohých prípadoch vyhliadky na záchranu života aj takýchto obetí. Chirurgická nekrektómia v kombinácii s transplantáciou kultivovaných alofibroblastov a autodermoplastikou u detí s hlbokými popáleninami sa ukázala ako obzvlášť účinná u pacientov s rozsiahlymi kožnými léziami s nedostatkom darcovských miest. Aktívna chirurgická taktika a transplantácia kultivovaných alofibroblastov prispievajú k rýchlej stabilizácii celkového stavu takýchto pacientov, zníženiu počtu infekčných komplikácií popáleninových ochorení, vytvoreniu priaznivých podmienok pre uchytenie transplantátov, skráteniu času na obnovu stratenej kože a trvania hospitalizácie, zníženiu frekvencie smrteľných následkov u obetí s rozsiahlymi popáleninami. Transplantácia kultivovaných alofibroblastov s následnou autodermoplastikou s kožnými lalokmi teda umožňuje zotavenie detí s ťažkými popáleninami, ktoré boli predtým považované za odsúdené na zánik.

Všeobecne sa uznáva, že primárnym cieľom liečby popálenín je čo najúplnejšia a najrýchlejšia obnova poškodenej kože, aby sa predišlo toxickým účinkom, infekčným komplikáciám a dehydratácii. Výsledky použitia kultivovaných buniek do značnej miery závisia od pripravenosti samotnej popáleninovej rany na transplantáciu. V prípadoch transplantácie kultivovaných keratinocytov na povrch rany po chirurgickej nekrektómii sa v priemere 55 % (podľa plochy) transplantovaných buniek uchytí, zatiaľ čo pri granulujúcich ranách sa miera uchytenia znižuje na 15 %. Preto úspešná liečba rozsiahlych hlbokých popálenín kože vyžaduje v prvom rade aktívnu chirurgickú taktiku. Pri popáleninách IIIB-IV stupňa sa povrch popálenín okamžite zbaví nekrotického tkaniva, aby sa znížila intoxikácia a znížil počet komplikácií popálenín. Použitie takejto taktiky je kľúčom k skráteniu času od okamihu popálenia až po uzavretie rán a dĺžky pobytu pacientov s rozsiahlymi popáleninami v nemocnici a tiež výrazne znižuje počet smrteľných prípadov.

Prvé správy o úspešnom použití kultivovaných keratinocytov na pokrytie popáleninových povrchov sa objavili začiatkom 80. rokov 20. storočia. Následne sa táto manipulácia vykonávala s použitím vrstiev kultivovaných keratinocytov, najčastejšie získaných z autobuniek, oveľa menej často z alokeratinocytov. Technológia autokeratinocytoplastiky však neumožňuje vytvorenie bunkovej banky, pričom čas potrebný na vytvorenie transplantátu keratinocytov s dostatočnou plochou je dlhý a dosahuje 3 – 4 týždne. Počas tohto obdobia prudko stúpa riziko vzniku infekčných a iných komplikácií popáleninovej choroby, čo výrazne predlžuje celkový čas pobytu pacientov v nemocnici. Okrem toho sa autokeratinocyty pri transplantácii na granulujúce popáleninové rany prakticky neuchytia a vysoké náklady na špeciálne rastové médiá a biologicky aktívne stimulátory rastu keratinocytov výrazne obmedzujú ich klinické využitie. Iné biotechnologické metódy, ako je kolagenoplastika, transplantácia kryokonzervovanej xenokožy a použitie rôznych biopolymérnych povlakov, zvyšujú účinnosť liečby rozsiahlych povrchových, ale nie hlbokých popálenín. Metóda pokrytia povrchu rany kultivovanými fibroblastmi sa zásadne líši v tom, že ako hlavná zložka kultivovanej bunkovej vrstvy sa používajú fibroblasty, a nie keratinocyty.

Predpokladom pre vývoj metódy boli údaje, že pericyty obklopujúce malé cievy sú progenitorové mezenchymálne bunky schopné transformácie na fibroblasty, ktoré produkujú mnoho rastových faktorov a zabezpečujú hojenie rán vďaka silnému stimulačnému účinku na proliferáciu a adhéziu keratinocytov. Použitie kultivovaných fibroblastov na uzavretie povrchov rán okamžite odhalilo množstvo významných výhod tejto metódy v porovnaní s použitím kultivovaných keratinocytov. Najmä získanie fibroblastov v kultúre nevyžaduje použitie špeciálnych živných médií a rastových stimulantov, čo znižuje náklady na transplantáciu viac ako 10-krát v porovnaní s nákladmi na získanie keratinocytov. Fibroblasty sa ľahko pasivujú, počas čoho čiastočne strácajú povrchové antigény histokompatibility, čo následne otvára možnosť použitia alogénnych buniek na výrobu transplantátov a vytváranie ich bánk. Čas potrebný na získanie transplantátov pripravených na použitie v klinike sa skracuje z 3 týždňov (pre keratinocyty) na 1-2 dni (pre fibroblasty). Primárnu kultúru fibroblastov je možné získať kultiváciou buniek z fragmentov kože odobratých počas autodermoplastiky a hustota výsevu buniek na získanie subkultúr ľudských fibroblastov je iba 20 x 10³ ^na 1 ^cm².

Za účelom štúdia vplyvu fibroblastov a ich regulačných proteínov na proliferáciu a diferenciáciu keratinocytov bola vykonaná porovnávacia analýza morfológie a proliferácie keratinocytov na substrátoch kolagénu typu I a III, ako aj fibronektínu v spoločnej kultúre s ľudskými fibroblastmi. Ľudské keratinocyty boli izolované z fragmentov kože pacientov s popáleninami, odobratých počas autodermoplastiky. Hustota výsevu keratinocytov bola 50 x 103 buniek na 1 cm2. Klinická účinnosť transplantácie kultivovaných fibroblastov bola hodnotená u 517 pacientov. Všetci pacienti boli rozdelení do dvoch skupín: Skupina 1 - dospelí pacienti s popáleninami IIA, B - IV stupňa; Skupina 2 - deti s hlbokými popáleninami IIIB - IV stupňa. Vyhodnotenie dynamiky štrukturálnej a funkčnej organizácie monovrstvových kultúr fibroblastov s ohľadom na úlohu glykozaminoglykánov, fibronektínu a kolagénu v regeneračných procesoch umožnilo autorom určiť 3. deň ako najpriaznivejšie obdobie na použitie kultúr fibroblastov na výrobu transplantátov. Štúdia vplyvu fibroblastov na proliferáciu a diferenciáciu keratinocytov ukázala, že fibroblasty in vitro majú výrazný stimulačný účinok, predovšetkým na procesy adhézie keratinocytov, čím zvyšujú počet pripojených buniek a rýchlosť ich fixácie viac ako 2-násobne. Stimulácia adhéznych procesov je sprevádzaná zvýšením intenzity syntézy DNA a úrovne proliferácie keratinocytov. Okrem toho sa ukázalo, že prítomnosť fibroblastov a nimi tvorenej extracelulárnej matrice je nevyhnutnou podmienkou pre tvorbu tonofibrilárneho aparátu keratinocytov, medzibunkových spojení a v konečnom dôsledku pre diferenciáciu keratinocytov a tvorbu bazálnej membrány. Pri liečbe detí s hlbokými popáleninami sa preukázala vysoká klinická účinnosť transplantácie kultúry alofibroblastov, najmä v skupine pacientov s rozsiahlymi kožnými léziami v podmienkach nedostatku darcovského miesta. Komplexná morfofunkčná štúdia ukázala, že transplantované fibroblasty sa vyznačujú aktívnou syntézou DNA, ako aj kolagénu, fibronektínu a glykozaminoglykánov, ktoré sú súčasťou extracelulárnej matrice tvorenej bunkami. Autori poukazujú na vysoké percento uchytenia transplantovaných fibroblastov (až 96 %), výrazné skrátenie času ich prijatia (do 24 – 48 hodín namiesto 2 – 3 týždňov v prípade použitia keratinocytov), výrazné zrýchlenie epitelizácie popáleninového povrchu, ako aj výrazné zníženie nákladov (až 10-násobne) na technológiu pestovania transplantátu z fibroblastov v porovnaní s transplantáciou keratinocytov. Použitie transplantácie kultivovaných alofibroblastov umožňuje zachrániť životy detí s kritickými popáleninami – tepelným poškodením viac ako 50 % povrchu tela,čo sa predtým považovalo za nezlučiteľné so životom. Treba poznamenať, že transplantáciou alogénnych embryonálnych fibroblastov sa presvedčivo preukázala nielen rýchlejšia regenerácia rán a rekonvalescencia pacientov s rôznym stupňom a oblasťou popálenín, ale aj významné zníženie ich úmrtnosti.

Autológne fibroblasty sa používajú aj v takej zložitej oblasti plastickej chirurgie, ako je rekonštrukčná korekcia poranení hlasiviek. Na tento účel sa zvyčajne používa hovädzí kolagén, ktorého trvanie účinku je obmedzené jeho imunogenicitou. Keďže je hovädzí kolagén cudzím proteínom, je citlivý na kolagenázu príjemcu a môže vyvolať imunitné reakcie, na zníženie rizika ktorých boli vyvinuté technológie na získanie kolagénových prípravkov zosieťovaných glutaraldehydom. Ich výhodou je väčšia stabilita a nižšia imunogenicita, čo našlo praktické uplatnenie pri odstraňovaní defektov a atrofie hlasiviek. Injekcie autológneho kolagénu boli prvýkrát použité v roku 1995. Táto technika zabezpečila zachovanie primárnej štruktúry autológnych kolagénových vlákien vrátane intramolekulárnych enzymaticky katalyzovaných zosieťovaní. Faktom je, že prirodzené kolagénové vlákna sú odolnejšie voči deštrukcii proteázami ako rekonštituovaný kolagén, v ktorom sú telopeptidy štiepené. Integrita telopeptidov je dôležitá pre kvartérnu štruktúru kolagénových vlákien a tvorbu zosieťovaní medzi susednými molekulami kolagénu. Na rozdiel od prípravkov z hovädzieho kolagénu autológny kolagén nespôsobuje u príjemcu imunitné reakcie, ale nie je dostatočne účinný ako doplňujúci prostriedok. Stabilnú korekciu možno dosiahnuť lokálnou produkciou kolagénu transplantáciou autológnych fibroblastov. Počas štúdie účinnosti autológnej transplantácie fibroblastov v klinických podmienkach sa však zistili určité ťažkosti. V skorom období po transplantácii fibroblastov bol klinický účinok slabší v porovnaní s účinkom po zavedení hovädzieho kolagénu. Pri kultivácii autológnych fibroblastov nemožno vylúčiť možnosť transformácie normálnych fibroblastov na patologické, tzv. myofibroblasty, zodpovedné za rozvoj fibrózy a tvorbu jaziev, o čom svedčí kontrakcia kolagénového gélu spôsobená špecifickou interakciou fibroblastov a kolagénových fibríl. Okrem toho po sériovom pasážovaní in vitro fibroblasty strácajú schopnosť syntetizovať proteíny extracelulárnej matrice.

V súčasnosti však bola experimentálne vyvinutá metóda kultivácie autológnych ľudských fibroblastov, ktorá eliminuje vyššie uvedené nedostatky a nevedie k onkogénnej transformácii normálnych fibroblastov. Autológne fibroblasty získané touto metódou sa používajú na obnovu defektov v mäkkých tkanivách tváre. V štúdii G. Kellera a kol. (2000) bolo ošetrených 20 pacientov vo veku 37 až 61 rokov s vráskami a atrofickými jazvami. Kožné biopsie (4 mm) z retroaurikulárnej oblasti boli transportované do laboratória v sterilných skúmavkách obsahujúcich 10 ml kultivačného média (Eagleho médium s antibiotikom, mykoseptikom, pyruvátom a fetálnym teľacím sérom). Materiál bol umiestnený do 3-5 kultivačných misiek s priemerom 60 mm a inkubovaný v termostate s atmosférou obsahujúcou 5 % CO2. Po 1 týždni boli bunky z misiek odstránené trypsinizáciou a umiestnené do 25 cm2 liekoviek. Bunky boli pacientom injekčne podané v množstve 4 x 107. Významný a pretrvávajúci klinický účinok sa pozoroval u pacientov počas korekcie nasolabiálnych rýh, ako aj u pacientov s jazvami 7 a 12 mesiacov po tretej transplantácii autológnych fibroblastov. Podľa prietokovej cytometrie kultivované fibroblasty produkovali veľké množstvo kolagénu typu I. Štúdie in vitro preukázali normálnu kontraktilitu injikovaných fibroblastov. Dva mesiace po subkutánnom podaní kultivovaných fibroblastov v dávke 4 x 107 buniek neboli u nahých myší zistené žiadne nádory. Injikované fibroblasty nespôsobili u pacientov zjazvenie ani difúznu fibrózu. Podľa autora sú vštepené autológne fibroblasty schopné neustále produkovať kolagén, čo zabezpečí kozmetický omladzujúci efekt. Zároveň, keďže životnosť diferencovaných buniek je obmedzená, fibroblasty odobraté od mladého pacienta sú účinnejšie ako tie, ktoré boli získané od starších ľudí. V budúcnosti sa predpokladá, že bude možné kryokonzervovať kultúru fibroblastov odobratých od mladého darcu za účelom neskoršej transplantácie vlastných mladých buniek staršiemu pacientovi. Záverom možno konštatovať, že autológne fibroblasty, za predpokladu ich funkčnej konzervácie, sú ideálnym prostriedkom na korekciu defektov mäkkých tkanív tváre. Zároveň samotný autor poznamenáva, že počas štúdie sa vyskytli niektoré problematické situácie súvisiace s použitím autológneho systému fibroblastov a kolagénu. Klinický účinok bol často slabší ako pri použití hovädzieho kolagénu, čo u pacientov spôsobovalo sklamanie.

Vo všeobecnosti vyzerajú údaje z literatúry o perspektívach klinického využitia mezenchymálnych kmeňových buniek pomerne optimisticky. Robia sa pokusy o použitie autológnych multipotentných mezenchymálnych progenitorových buniek kostnej drene na liečbu degeneratívnych lézií kĺbov. Vykonávajú sa prvé klinické skúšky použitia kultivovaných mezenchymálnych progenitorových buniek pri liečbe komplexných zlomenín kostí. Auto- a alogénne mezenchymálne stromálne bunky kostnej drene sa používajú na vytvorenie chrupavkového tkaniva na transplantáciu pri korekcii defektov kĺbovej chrupavky v dôsledku traumy alebo autoimunitných lézií. Vyvíjajú sa metódy klinického využitia multipotentných mezenchymálnych progenitorových buniek na elimináciu kostných defektov u detí s ťažkou formou neúplnej osteogenézy spôsobenej mutáciami v géne kolagénu typu I. Po myeloablácii sa deťom-recipientom transplantuje kostná dreň od zdravých darcov kompatibilných s HLA, pretože nefrakcionovaná kostná dreň môže obsahovať dostatočný počet mezenchymálnych kmeňových buniek na kompenzáciu ťažkého kostného defektu. Po transplantácii alogénnej kostnej drene sa u takýchto detí prejavili pozitívne histologické zmeny v trabekulárnych kostiach, zvýšenie rýchlosti rastu a zníženie výskytu zlomenín kostí. V niektorých prípadoch sa pozitívny klinický výsledok dosiahne transplantáciou blízko príbuznej alogénnej kostnej drene a osteoblastov. Transplantácia MSC sa tiež používa na liečbu vrodenej krehkosti kostí spôsobenej nerovnováhou osteoblastov a osteoklastov v kostnom tkanive. V tomto prípade sa obnova tvorby kostí dosahuje chimerizáciou zásoby kmeňových a progenitorových stromálnych buniek v kostnom tkanive pacientov.

Pokračuje zdokonaľovanie metód genetickej modifikácie darcovských mezenchymálnych kmeňových buniek za účelom korekcie genetických defektov stromálnych tkanív. Predpokladá sa, že v blízkej budúcnosti sa mezenchymálne progenitorové bunky budú používať v neurológii na cielenú chimerizáciu mozgových buniek a vytvorenie zdravého súboru buniek schopných generovať deficitný enzým alebo faktor zodpovedný za klinické prejavy ochorenia. Transplantácia mezenchymálnych kmeňových buniek sa môže použiť na obnovu strómy kostnej drene u pacientov s rakovinou po rádio- a chemoterapii a v kombinácii s bunkami kostnej drene na obnovu hematopoézy. Vývoj substitučnej terapie zameranej na elimináciu defektov pohybového aparátu pomocou MSC je podporovaný technickým vývojom v oblasti navrhovania matricových biomateriálov alebo biomimetík tvoriacich rámce osídlené potomstvom mezenchymálnych kmeňových buniek.

Zdroje mezenchymálnych kmeňových buniek

Hlavným zdrojom mezenchymálnych kmeňových buniek je kostná dreň, ktorej hematopoetické kmeňové bunky sa v tele cicavcov neustále diferencujú na bunky krvi a imunitného systému, zatiaľ čo mezenchymálne kmeňové bunky sú reprezentované malou populáciou fibroblastom podobných buniek strómy kostnej drene a prispievajú k zachovaniu nediferencovaného stavu hematopoetických kmeňových buniek. Za určitých podmienok sa mezenchymálne kmeňové bunky diferencujú na bunky chrupavky a kostného tkaniva. Pri nasiatí na kultivačné médium za podmienok s nízkou hustotou výsadby tvoria mononukleárne stromálne bunky kostnej drene kolónie adhezívnych buniek, ktoré sú v skutočnosti fibroblastom podobnými multipotentnými mezenchymálnymi progenitorovými bunkami. Niektorí autori sa domnievajú, že v kostnej dreni sa ukladajú neviazané mezenchymálne kmeňové bunky, ktoré vďaka svojej schopnosti samoobnovy a vysokému diferenciačnému potenciálu poskytujú všetkým tkanivám tela mezenchymálne prekurzory stromálnych prvkov počas celého života cicavčieho organizmu.

V kostnej dreni tvoria stromálne bunkové elementy sieť vypĺňajúcu priestor medzi sinusoidami a kostným tkanivom. Obsah dormantných MSC v kostnej dreni dospelého človeka je porovnateľný s množstvom hematopoetických kmeňových buniek a nepresahuje 0,01 – 0,001 %. Mezenchymálne kmeňové bunky izolované z kostnej drene a nekultivované neobsahujú adhézne molekuly. Takéto MSC neexprimujú CD34, ICAM, VCAM, kolagén typu I a III, CD44 a CD29. V dôsledku toho in vitro nie sú na kultivačnom substráte fixované mezenchymálne kmeňové bunky, ale pokročilejšie progenitorové deriváty mezenchymálnych kmeňových buniek, ktoré už vytvorili zložky cytoskeletu a receptorový aparát molekúl bunkovej adhézie. Stromálne bunky s fenotypom CD34 sa nachádzajú aj v periférnej krvi, hoci v kostnej dreni je ich výrazne menej ako CD34-pozitívnych mononukleárnych buniek. CD34 bunky izolované z krvi a prenesené do kultúry sa prichytávajú k substrátu a tvoria kolónie buniek podobných fibroblastom.

Je známe, že v embryonálnom období vzniká stromálny základ všetkých orgánov a tkanív cicavcov a ľudí zo spoločného súboru mezenchymálnych kmeňových buniek pred a v štádiu organogenézy. Preto sa predpokladá, že v zrelom organizme by sa väčšina mezenchymálnych kmeňových buniek mala nachádzať v spojivovom a kostnom tkanive. Bolo zistené, že hlavnú časť bunkových prvkov strómy riedkeho spojivového a kostného tkaniva predstavujú komitované progenitorové bunky, ktoré si však zachovávajú schopnosť proliferovať a tvoriť klony in vitro. Po zavedení takýchto buniek do krvného obehu sa viac ako 20 % mezenchymálnych progenitorových buniek implantuje medzi stromálne prvky hematopoetického tkaniva a parenchymatóznych orgánov.

Potenciálnym zdrojom mezenchymálnych kmeňových buniek je tukové tkanivo, medzi ktorými boli identifikované prekurzory adipocytov v rôznej miere viazané na iné bunky. Najmenej zrelými progenitorovými prvkami tukového tkaniva sú stromálne-vaskulárne bunky, ktoré sú podobne ako multipotentné mezenchymálne prekurzorové bunky kostnej drene schopné diferencovať sa na adipocyty pod vplyvom glukokortikoidov, inzulínu podobného rastového faktora a inzulínu. V kultúre sa stromálne-vaskulárne bunky diferencujú na adipocyty a chondrocyty a v tukovom tkanive kostnej drene sa nachádzajú bunky, ktoré tvoria adipocyty a osteoblasty.

Stromálne kmeňové bunky sa našli aj vo svaloch. V primárnej kultúre buniek izolovaných z ľudského kostrového svalstva sa detegujú hviezdicovité bunky a viacjadrové myotuby. V prítomnosti konského séra hviezdicovité bunky proliferujú in vitro bez známok cytodiferenciácie a po pridaní dexametazónu do živného média je ich diferenciácia charakterizovaná výskytom bunkových prvkov s fenotypom buniek kostrového a hladkého svalstva, kostí, chrupaviek a tukového tkaniva. Preto sú v ľudskom svalovom tkanive prítomné viazané aj neviazané multipotentné mezenchymálne progenitorové bunky. Ukázalo sa, že populácia progenitorových buniek prítomných v kostrovom svalstve pochádza z neviazaných multipotentných mezenchymálnych progenitorových buniek kostnej drene a líši sa od myogénnych satelitných buniek.

V myokarde novonarodených potkanov sa tiež našli adhezívne hviezdicovité bunky zodpovedajúce multipotentným mezenchymálnym progenitorovým bunkám v diferenciačnom potenciáli, pretože pod vplyvom dexametazónu sa diferencujú na adipocyty, osteoblasty, chondrocyty, bunky hladkého svalstva, myotuby kostrového svalstva a kardiomyocyty. Ukázalo sa, že bunky hladkého svalstva ciev (pericyty) sú derivátmi nediferencovaných perivaskulárnych multipotentných mezenchymálnych progenitorových buniek. V kultúre perivaskulárne mezenchymálne kmeňové bunky exprimujú α-aktín hladkého svalstva a receptor rastového faktora odvodeného z krvných doštičiek a sú schopné diferenciácie aspoň na bunky hladkého svalstva.

Zvláštne miesto z hľadiska kmeňových rezerv zaujíma chrupavkové tkanivo, ktorého extrémne nízky reparačný potenciál je pravdepodobne spôsobený nedostatkom multipotentných mezenchymálnych progenitorových buniek alebo diferenciačných a rastových faktorov. Predpokladá sa, že multipotentné mezenchymálne progenitorové bunky vopred určené pre chondro- a osteogenézu vstupujú do chrupavkového tkaniva z iných tkanivových zdrojov.

Pôvod tkaniva a podmienky väzby mezenchymálnych progenitorových buniek v šľachách tiež neboli stanovené. Experimentálne pozorovania naznačujú, že v skorom postnatálnom období si bunky Achillovej šľachy králikov v primárnych kultúrach a pri prvej pasáži zachovávajú expresiu kolagénu typu I a dekorínu, ale pri ďalšej kultivácii strácajú diferenciačné markery tenocytov.

Treba poznamenať, že odpoveď na otázku, či sú multipotentné mezenchymálne progenitorové bunky lokalizované v rôznych tkanivách skutočne neustále prítomné v ich stróme, alebo či je tkanivový pool mezenchymálnych kmeňových buniek dopĺňaný migráciou stromálnych kmeňových buniek kostnej drene, zatiaľ nebola prijatá.

Okrem kostnej drene a iných mezenchymálnych tkanivových zón dospelého organizmu môže byť ďalším zdrojom MSC pupočná krv. Ukázalo sa, že pupočná žilová krv obsahuje bunky, ktoré majú podobné morfologické a antigénne vlastnosti ako multipotentné mezenchymálne progenitorové bunky, sú schopné adhézie a nie sú horšie ako multipotentné mezenchymálne progenitorové bunky kostnej drene v diferenciačnom potenciáli. V kultúrach mezenchymálnych kmeňových buniek pupočníkovej krvi sa našlo 5 až 10 % neviazaných multipotentných mezenchymálnych progenitorových buniek. Ukázalo sa, že ich počet v pupočníkovej krvi je nepriamo úmerný gestačnému veku, čo nepriamo naznačuje migráciu multipotentných mezenchymálnych progenitorových buniek do rôznych tkanív počas fetálneho vývoja. Objavili sa prvé informácie o klinickom využití mezenchymálnych kmeňových buniek izolovaných z pupočníkovej krvi, ako aj buniek získaných z embryonálneho biomateriálu, ktoré je založené na známej schopnosti fetálnych kmeňových buniek integrovať sa, uchytiť sa a fungovať v orgánoch a tkanivových systémoch dospelých príjemcov.

Hľadanie nových zdrojov mezenchymálnych kmeňových buniek

Použitie mezenchymálnych kmeňových buniek embryonálneho pôvodu, ako aj iných fetálnych buniek, vytvára množstvo etických, právnych, súdnych a legislatívnych problémov. Preto pokračuje hľadanie extraembryonálneho darcovského bunkového materiálu. Pokus o klinické využitie ľudských kožných fibroblastov bol neúspešný, čo bolo predurčené nielen vysokou finančnou kapacitou technológie, ale aj rýchlou diferenciáciou fibroblastov na fibrocyty, ktoré majú výrazne nižší proliferačný potenciál a produkujú obmedzený počet rastových faktorov. Ďalší pokrok v štúdiu biológie MSC a multipotentných mezenchymálnych progenitorových buniek kostnej drene nám umožnil vyvinúť stratégiu pre klinické využitie autológnych mezenchymálnych kmeňových buniek. Technológia ich izolácie, kultivácie, ex vivo reprodukcie a cielenej diferenciácie si vyžadovala v prvom rade štúdium spektra molekulárnych markerov MSC. Ich analýza ukázala, že primárne kultúry ľudského kostného tkaniva obsahujú niekoľko typov multipotentných mezenchymálnych progenitorových buniek. Proosteoblastový fenotyp bol detegovaný v bunkách exprimujúcich marker stromálnych progenitorových buniek STRO-1, ale nenesúcich osteoblastový marker - alkalickú fosfatázu. Takéto bunky sa vyznačujú nízkou schopnosťou tvoriť mineralizovanú kostnú matricu, ako aj absenciou expresie osteopontínu a receptora parathormónu. Deriváty STRO-1-pozitívnych buniek, ktoré neexprimujú alkalickú fosfatázu, sú reprezentované stredne a úplne diferencovanými osteoblastami. Zistilo sa, že bunkové prvky klonovaných línií STRO-1-pozitívnych ľudských trabekulárnych kostných buniek sú schopné diferenciácie na zrelé osteocyty a adipocyty. Smer diferenciácie týchto buniek závisí od účinku polynenasýtených mastných kyselín, prozápalových cytokínov - IL-1b a tumor nekrotizujúceho faktora a (TNF-a), ako aj protizápalového a imunosupresívneho TGF-b.

Neskôr sa zistilo, že multipotentné mezenchymálne progenitorové bunky nemajú špecifický fenotyp, ktorý je im vlastný, ale exprimujú komplex markerov charakteristických pre mezenchymálne, endotelové, epitelové a svalové bunky pri absencii imunofenotypových antigénov hematopoetických buniek - CD45, CD34 a CD14. Okrem toho mezenchymálne kmeňové bunky konštitutívne a indukovateľne produkujú hematopoetické a nehematopoetické rastové faktory, interleukíny a chemokíny a receptory pre niektoré cytokíny a rastové faktory sú exprimované na multipotentných mezenchymálnych progenitorových bunkách. Medzi bunkami stromálnej matrice ľudského tela sa našli dormančné alebo pokojové bunky s imunofenotypom takmer identickým s antigénovým profilom multipotentných mezenchymálnych progenitorových buniek neošetrených 5-fluóruracilom - obe bunky exprimujú CD117, ktorý označuje „dospelé“ kmeňové bunky.

Bunkový marker jedinečný pre mezenchymálne kmeňové bunky teda zatiaľ nebol identifikovaný. Predpokladá sa, že kľudové bunky predstavujú populáciu neviazaných multipotentných mezenchymálnych progenitorových buniek, pretože neexprimujú markery buniek viazaných na osteo- (Cbfa-1) alebo adipogenézu (PPAR-γ-2). Dlhodobé vystavenie pomaly proliferujúcich kľudových buniek fetálnemu bovinnému séru vedie k tvorbe terminálne diferencujúcich sa viazaných progenitorov charakterizovaných rýchlym rastom. Klonálna expanzia takýchto mezenchymálnych kmeňových buniek je podporovaná FGF2. Zdá sa, že genóm stromálnych kmeňových buniek je pomerne pevne „uzavretý“. Existujú správy o absencii spontánnej diferenciácie v MSC – bez špeciálnych podmienok pre viazanie sa netransformujú ani na bunky mezenchymálnej línie.

Na štúdium populačnej štruktúry derivátov mezenchymálnych kmeňových buniek sa vykonáva hľadanie diferenciačných markerových proteínov na stromálnych bunkových líniách a v primárnych kultúrach. In vitro klonálna analýza buniek tvoriacich kolónie kostnej drene ukázala, že EGF zvyšuje priemernú veľkosť kolónií a znižuje klonálnu expresiu alkalickej fosfatázy pri aplikácii na primárne kultúry, zatiaľ čo pridanie hydrokortizónu aktivuje expresiu alkalickej fosfatázy, ktorá je markerom osteogénneho smeru diferenciácie MSC. Monoklonálne protilátky proti STRO-1 umožnili separovať a študovať populáciu adhezívnych buniek pozitívnych na STRO-1 v heterogénnom systéme Dexterových kultúr. Bolo stanovené spektrum cytokínov, ktoré regulujú nielen proliferáciu a diferenciáciu hematopoetických a lymfoidných buniek, ale podieľajú sa aj na tvorbe, formovaní a resorpcii kostrových tkanív prostredníctvom para-, auto- a endokrinných mechanizmov. Receptorom sprostredkované uvoľňovanie sekundárnych poslov, ako je cAMP, diacylglycerol, inozitoltrifosfát a Ca2+, sa tiež používa na analýzu markerov rôznych kategórií buniek stromálneho tkaniva exprimujúcich zodpovedajúce receptory. Použitie monoklonálnych protilátok ako markerov umožnilo stanoviť príslušnosť retikulárnych buniek strómy lymfoidných orgánov k T- a B-dependentným zónam.

Vedecké debaty o možnosti pôvodu MSC z hematopoetických kmeňových buniek pokračovali istý čas. Keď sa suspenzie buniek kostnej drene explantujú do monovrstvových kultúr, skutočne v nich rastú samostatné kolónie fibroblastov. Ukázalo sa však, že prítomnosť prekurzorov fibroblastových kolónií a rôznych klíčkov diferenciácie hematopoetického tkaniva v kostnej dreni nie je dôkazom ich spoločného pôvodu z hematopoetickej kmeňovej bunky. Pomocou diskriminačnej analýzy kmeňových buniek kostnej drene sa zistilo, že mikroprostredie počas heterotopickej transplantácie kostnej drene nie je prenášané hematopoetickými bunkami, čo dokazuje existenciu populácie MSC v kostnej dreni, ktorá je histogeneticky nezávislá od hematopoetických buniek.

Okrem toho metóda selektívneho klonovania umožnila identifikovať novú kategóriu stromálnych progenitorových buniek v monovrstvových kultúrach buniek kostnej drene, určiť ich počet a študovať ich vlastnosti, proliferačný a diferenciačný potenciál. Ukázalo sa, že stromálne fibroblastom podobné bunky proliferujú in vitro a tvoria diploidné kolónie, ktoré po transplantácii späť do tela zabezpečujú tvorbu nových hematopoetických orgánov. Výsledky štúdie jednotlivých klonov naznačujú, že medzi stromálnymi progenitorovými bunkami existuje populácia buniek, ktoré si svojím proliferačným a diferenciačným potenciálom môžu nárokovať úlohu kmeňových buniek stromálneho tkaniva, histogeneticky nezávislých od hematopoetických kmeňových buniek. Bunky tejto populácie sa vyznačujú samoudržateľným rastom a diferencujú sa na progenitorové bunkové elementy kosti, chrupavky a retikulárneho tkaniva kostnej drene.

Veľmi zaujímavé sú výsledky štúdií R. Chailakhyana a spoluautorov (1997-2001), ktorí kultivovali stromálne progenitorové bunky kostnej drene z králikov, morčiat a myší na živnom médiu a-MEM s prídavkom fetálneho teľacieho séra. Autori vykonali explantáciu s počiatočnou hustotou 2-4 x 103 buniek kostnej drene na 1 cm2. Ako kŕmidlo boli použité homológne alebo heterológne bunky kostnej drene inaktivované žiarením v dávke, ktorá zachovala kŕmiaci účinok, ale úplne blokovala ich proliferáciu. Dvojtýždňové primárne diskrétne kolónie fibroblastov boli trypsinizované, aby sa získali monoklonálne kmene. Dôkaz o klonálnom pôvode kolónií bol získaný pomocou chromozomálneho markera v zmiešaných kultúrach kostnej drene samcov a samíc morčiat, časozberným snímaním živých kultúr a v zmiešaných kultúrach syngénnej kostnej drene myší CBA a CBAT6T6. Transplantácia suspenzie čerstvo izolovaných buniek kostnej drene alebo in vitro pestovaných stromálnych fibroblastov pod obličkovou kapsulou sa uskutočnila v pórovitých lešeniach z ivalonu alebo želatíny, ako aj v inaktivovanej matrici králika z hubovitej kosti. Na transplantáciu klonov do kostného puzdra boli stehenné kosti morčiat zbavené mäkkých tkanív a periostu, epifýzy boli orezané a kostná dreň bola dôkladne premytá. Kosť bola narezaná na fragmenty (3-5 mm), vysušená a ožiarená dávkou 60 Gy. Jednotlivé kolónie fibroblastov boli umiestnené do kostných puzdier a implantované intramuskulárne. Na intraperitoneálnu transplantáciu stromálnych fibroblastov pestovaných in vitro sa použili difúzne komory typu A (V=0,015 cm3, h=0,1 mm) a O (V=0,15 cm3, h=2 mm).

Pri štúdiu dynamiky rastu klonálnych kmeňov R. Chailakhyan a kol. (2001) zistili, že jednotlivé bunky tvoriace fibroblastové kolónie, ako aj ich potomkovia, majú obrovský proliferačný potenciál. Do 10. pasáže bol počet fibroblastov v niektorých kmeňoch 1,2 – 7,2 x 109 ^buniek. Počas svojho vývoja vykonali až 31 – 34 zdvojení buniek. V tomto prípade heterotopická transplantácia kmeňov odvodených z kostnej drene, vytvorených stromálnymi prekurzormi niekoľkých desiatok klonov, viedla k prenosu mikroprostredia kostnej drene a vzniku nového hematopoetického orgánu v transplantačnej zóne. Autori si položili otázku, či sú jednotlivé klony schopné preniesť mikroprostredie kostnej drene stromálnych buniek, alebo či je na to potrebná spolupráca niekoľkých rôznych klonogénnych stromálnych prekurzorov? A ak sú jednotlivé klony schopné preniesť mikroprostredie, bude úplné pre všetky tri hematopoetické klíčky, alebo rôzne klony zabezpečujú tvorbu mikroprostredia pre rôzne hematopoetické klíčky? Na vyriešenie týchto problémov bola vyvinutá technológia kultivácie stromálnych progenitorových buniek na kolagénovom géli, ktorá umožňuje odstrániť vypestované kolónie fibroblastov z povrchu pre následnú heterotopickú transplantáciu. Jednotlivé klony stromálnych fibroblastov vypestovaných z buniek kostnej drene myší a morčiat CBA boli vyrezané spolu s fragmentom gélového povlaku a heterotopicky transplantované - pod obličkové puzdro syngénnych myší alebo do brušného svalu autológnych morčiat. Po transplantácii do svalu boli kolónie na géli umiestnené do kostných pošv.

Autori zistili, že 50 – 90 dní po transplantácii fibroblastových kolónií kostnej drene sa v transplantačnej zóne v 20 % prípadov pozoroval vývoj kostného alebo kostného a hematopoetického tkaniva. U 5 % recipientných zvierat obsahovali vytvorené ložiská kostného tkaniva dutinu vyplnenú kostnou dreňou. Vo vnútri kostných valcov mali takéto ložiská zaoblený tvar a kapsulu budovanú z kostného tkaniva s osteocytmi a dobre vyvinutou osteoblastickou vrstvou. Dutina kostnej drene obsahovala retikulárne tkanivo s myeloidnými a erytroidnými bunkami, ktorých proporcionálny pomer sa nelíšil od normálnej kostnej drene. V obličke bol transplantát typickým orgánom kostnej drene vytvoreným počas transplantácie natívnej kostnej drene, pričom kostná kapsula pokrývala dutinu kostnej drene iba zo strany obličkovej kapsuly. Hematopoetické tkanivo obsahovalo myeloidné, erytroidné a megakaryocytové prvky. Stroma dutiny kostnej drene mala dobre vyvinutý sínusový systém a obsahovala typické tukové bunky. Zároveň sa v transplantačnej zóne niektorých kolónií pod kapsulou obličiek našlo kostné tkanivo bez známok hematopoézy. Štúdium proliferačného a diferenciačného potenciálu jednotlivých klonov pokračovalo na monoklonálnych kmeňoch kostnej drene králikov, ktorých bunky boli resuspendované v živnom médiu a v samostatnej ivalonovej špongii s hmotnosťou 1-2 mg boli transplantované pod obličkovú kapsulu darcu kostnej drene králika. Bunky 21 monoklonálnych kmeňov boli podrobené takejto autotransplantácii. Výsledky boli zohľadnené po 2-3 mesiacoch. Autori zistili, že v 14 % prípadov transplantované monoklonálne kmene vytvorili orgán kostnej drene pozostávajúci z kostného tkaniva a dutiny kostnej drene vyplnenej hematopoetickými bunkami. V 33 % prípadov transplantované kmene vytvorili kompaktnú kosť rôznej veľkosti s osteocytmi zamurovanými v dutinách a vyvinutou osteoblastickou vrstvou. V niektorých prípadoch sa v špongiách s transplantovanými klonmi vyvinulo retikulárne tkanivo bez kosti alebo hematopoetických prvkov. Niekedy sa vytvorila retikulárna stróma s dobre rozvinutou sieťou sinusoidov, ale nebola osídlená hematopoetickými bunkami. Získané výsledky boli teda podobné údajom získaným počas transplantácie klonov na kolagénový gél. Ak však transplantácia klonov pestovaných na substráte viedla k tvorbe tkaniva kostnej drene v 5 % prípadov, kostného tkaniva v 15 % a retikulárneho tkaniva v 80 % prípadov, potom pri transplantácii monoklonálnych kmeňov sa tvorba prvkov kostnej drene pozorovala v 14 % prípadov, kostného tkaniva v 53 % a retikulárneho tkaniva v 53 % prípadov. Podľa autorov to naznačuje, že podmienky pre realizáciu proliferačného a diferenciačného potenciálu stromálnych fibroblastov počas transplantácie na porézne lešenia boli optimálnejšie ako počas ich transplantácie do kostných pošvov a na kolagénový substrát.Je možné, že použitie pokročilejších metód kultivácie a reverznej transplantácie klonov môže zlepšiť podmienky pre realizáciu ich diferenciačného potenciálu klonmi a zmeniť tieto pomery. Tak či onak, ale hlavný význam vykonaných štúdií spočíva v tom, že niektoré klony stromálnych buniek sú schopné tvoriť kostné tkanivo a súčasne poskytovať stromálne hematopoetické mikroprostredie pre tri klíčky hematopoézy kostnej drene naraz: erytroidné, myeloidné a megakaryocytové, čím vytvárajú pomerne veľké platformy hematopoetického tkaniva a určitú kostnú hmotu.

Autori sa následne zaoberali otázkou schopnosti jednotlivých klonogénnych stromálnych progenitorových buniek podstúpiť tieto typy bunkovej diferenciácie v uzavretom systéme difúznych komôr. Okrem toho bolo potrebné určiť, či jednotlivé klony majú polypotenciu, alebo či prejav diferenciačného potenciálu vyžaduje kooperatívnu interakciu niekoľkých klonov s fixným cytodiferenciačným znakom, ktorých rôzne pomery určujú preferenčnú tvorbu kostného, retikulárneho alebo chrupavkového tkaniva. Kombináciou dvoch metodologických prístupov - získaním monoklonálnych kmeňov stromálnych progenitorových buniek kostnej drene a ich transplantáciou do difúznych komôr - R. Chailakhyan a spoluautori (2001) dosiahli výsledky, ktoré im umožnili priblížiť sa k pochopeniu štrukturálnej organizácie strómy kostnej drene. Transplantácia monoklonálnych kmeňov stromálnych progenitorových buniek do komôr typu O viedla k tvorbe kostného aj chrupavkového tkaniva, čo naznačuje schopnosť potomkov jednej stromálnej kolónie tvoriacej bunky súčasne tvoriť kostné a chrupavkové tkanivo. Predpoklad, že kostné a chrupavkové tkanivo pochádza zo spoločnej stromálnej progenitorovej bunky, bol opakovane predložený. Táto hypotéza však nemala žiadne správne experimentálne potvrdenie. Tvorba kosti a chrupavky v difúznych komorách bola nevyhnutným dôkazom existencie spoločnej progenitorovej bunky pre tieto dva typy tkaniva medzi stromálnymi kmeňovými bunkami kostnej drene.

Následne bolo 29 klonálnych kmeňov z druhej až tretej pasáže získaných z primárnych kultúr králičej kostnej drene umiestnených do difúznych komôr a intraperitoneálne implantovaných do homológnych zvierat. Štúdie ukázali, že 45 % monoklonálnych kmeňov kostnej drene má osteogénny potenciál. Deväť komôr obsahovalo výlučne retikulárne tkanivo, ale bolo prítomné spolu s kostným a chrupavkovým tkanivom v ďalších 13 komorách, čo predstavovalo 76 % všetkých kmeňov. V komorách typu O, kde bola možná diferenciácia kostného aj chrupavkového tkaniva, bolo študovaných 16 kmeňov. V štyroch komorách (25 %) sa tvorilo kostné aj chrupavkové tkanivo. Treba ešte raz poznamenať, že v štúdiách R. Chailakhyana a kol. (2001) jednotlivé progenitorové bunky prešli 31 až 34 zdvojeniami v rámci bunkového kmeňa a ich potomstvo pozostávalo z 0,9 – 2,0 x 109 ^buniek. Počet mitóz, ktoré prešli progenitorové bunky polyklonálnych kmeňov, bol prakticky identický s počtom mitóz monoklonálnych kmeňov. Rýchlosť vývoja polyklonálnych kmeňov, najmä v prvej fáze ich vzniku, do značnej miery závisela od počtu kolónií použitých na iniciáciu kmeňov. Diploidné kmene ľudských embryonálnych fibroblastov (WI-38) pri reklonovaní na úrovni 12-15 zdvojení tiež tvorili kolónie, ktoré sa líšili priemerom a obsahom buniek. Veľké kolónie obsahujúce viac ako 103 buniek tvorili iba 5-10 %. So zvyšujúcim sa počtom delení sa percento veľkých kolónií znižovalo. Mono- a polyklonálne kmene stromálnych fibroblastov kostnej drene si po 20 alebo viacerých zdvojeniach zachovali diploidnú sadu chromozómov a tendencia ich vývoja bola porovnateľná s dynamikou vývoja diploidných kmeňov embryonálnych fibroblastov. Analýza diferenciačného potenciálu jednotlivých stromálnych progenitorových buniek kostnej drene, vykonaná transplantáciou monoklonálnych kmeňov do difúznych komôr, ukázala, že polovica z nich bola osteogénna. Veľké kolónie tvorili 10 % z ich celkového počtu. V dôsledku toho počet osteogénnych buniek tvoriacich kolónie zodpovedal približne 5 % ich celkovej populácie. Celková hmotnosť osteogénnych progenitorových buniek identifikovaných autormi zahŕňala bunky schopné súčasne tvoriť kostné a chrupavkové tkanivo. Navyše sa po prvýkrát zistilo, že tieto dva typy tkaniva v dospelom organizme majú spoločnú progenitorovú bunku: 25 % testovaných klonov bolo vytvorených takýmito bunkami a ich počet v celkovej populácii progenitorových buniek bol najmenej 2,5 %.

Heterotopická transplantácia jednotlivých klonov fibroblastov kostnej drene teda odhalila nové aspekty štrukturálnej organizácie populácie mezenchymálnych progenitorových buniek. Boli objavené stromálne progenitorové bunky, ktoré sú schopné prenášať špecifické mikroprostredie pre všetky hematopoetické klíčky naraz, pričom ich počet medzi veľkými klonmi študovanými v rôznych modeloch sa pohybuje od 5 do 15 % (0,5 – 1,5 % z celkového počtu detegovaných progenitorových buniek). Spolu s klonmi, ktoré prenášajú kompletné mikroprostredie kostnej drene, existujú progenitorové bunky určené iba na osteogenézu, ktoré pri prenose v otvorenom systéme tvoria kostné tkanivo, ktoré nepodporuje rozvoj hematopoézy. Ich počet z celkového počtu progenitorových buniek je 1,5 – 3 %. Niektoré z týchto buniek sú schopné tvoriť kostné tkanivo s obmedzeným obdobím samoudržiavania. V dôsledku toho je populácia stromálnych progenitorových buniek heterogénna vo svojom diferenciačnom potenciáli. Medzi nimi existuje kategória buniek, ktoré sa označujú za stromálne kmeňové bunky, schopné diferenciácie vo všetkých troch smeroch charakteristických pre stromálne tkanivo kostnej drene, pričom tvoria kosť, chrupavku a retikulárne tkanivo. Prezentované údaje nám umožňujú dúfať, že pomocou rôznych bunkových markerov bude možné určiť príspevok každého typu stromálnych buniek k organizácii špecifického mikroprostredia a podpore hematopoézy v Dexterových kultúrach.

Vlastnosti mezenchymálnych kmeňových buniek

V posledných rokoch sa zistilo, že v stacionárnych kultúrach kostnej drene sú multipotentné mezenchymálne progenitorové bunky reprezentované obmedzenou populáciou malých agranulárnych buniek (bunky RS-1), ktoré sa vyznačujú nízkou schopnosťou tvoriť kolónie a absenciou expresie antigénu Ki-67 špecifického pre proliferujúce bunky. Antigénne parametre dormantných buniek RS-1 sa líšia od spektra antigénov rýchlo proliferujúcich viazaných stromálnych progenitorových buniek. Zistilo sa, že vysoká miera proliferácie viazaných progenitorových buniek sa pozoruje iba v prítomnosti buniek RS-1. Bunky RS-1 zase zvyšujú svoju rýchlosť rastu pod vplyvom faktorov vylučovaných najzrelejšími derivátmi multipotentných mezenchymálnych progenitorových buniek. Zdá sa, že bunky RS-1 sú podtriedou neviazaných MSC schopných recyklácie. In vitro sa 5-fluóruracil-rezistentné stromálne progenitorové bunky kostnej drene vyznačujú nízkym obsahom RNA a vysokou expresiou génu ornitíndekarboxylázy, markera neproliferujúcich buniek.

Intenzívna proliferácia stromálnych progenitorových buniek začína po ich fixácii na substráte. V tomto prípade sa exprimuje markerový profil slabo diferencovaných buniek: SH2 (receptor TGF-(3)), SH3 (signálna proteínová doména), kolagén typu I a III, fibronektín, adhézne receptory VCAM-1 (CD106) a ICAM (CD54), kadherín-11, CD44, CD71 (transferínový receptor), CD90, CD120a a CD124, ale bez expresie charakteristických markerov hematopoetických kmeňových buniek (CD34, CD14, CD45). Klonálny rast umožňuje opakované pasážovanie mezenchymálnych kmeňových buniek s tvorbou početných geneticky homogénnych stromálnych progenitorových pluripotentných buniek v kultúre. Po 2-3 pasážach ich počet dosahuje 50-300 miliónov. V kultúre s dostatočnou hustotou sa po zastavení proliferácie stromálne progenitorové bunky, na rozdiel od fibroblastov hematopoetického tkaniva, diferencujú na adipocyty, myocyty, chrupavkové a kostné bunky. Kombinácia troch regulačných diferenciačných signálov, vrátane 1-metylizobutylxantínu (induktor intracelulárnej tvorby cAMP), dexametazónu (inhibítor fosfolipáz A a C) a indometacínu (inhibítor cyklooxygenázy, ktorý tiež znižuje aktivitu tromboxánsyntázy), premieňa až 95 % progenitorových mezenchymálnych buniek na adipocyty. Tvorba adipocytov z nezrelých stromálnych elementov je potvrdená expresiou génu lipoproteínovej lipázy, histochemickou detekciou apolipoproteínov a peroxizomálnych receptorov. Bunky toho istého klonu pod vplyvom TGF-b v bezsérovom médiu vytvárajú homogénnu populáciu chondrocytov. Viacvrstvová bunková kultúra tohto chrupavkového tkaniva sa vyznačuje vyvinutou medzibunkovou matricou pozostávajúcou z proteoglykánu a kolagénu typu II. V živnom médiu s 10 %. Účinok komplexu diferenciačného signálu pozostávajúceho z b-glycerofosfátu (anorganický donor fosfátu), kyseliny askorbovej a dexametazónu v rovnakej kultúre stromálnych progenitorových buniek vedie k tvorbe bunkových agregátov. V takýchto bunkách sa pozoruje progresívny nárast aktivity alkalickej fosfatázy a hladín osteopontínu, čo naznačuje tvorbu kostného tkaniva, ktorého mineralizácia buniek je potvrdená progresívnym nárastom intracelulárneho obsahu vápnika.

Podľa niektorých údajov je schopnosť mezenchymálnych kmeňových buniek k neobmedzenému deleniu a reprodukcii rôznych typov buniek mezenchymálnej diferenciačnej línie kombinovaná s vysokým stupňom plasticity. Po zavedení do mozgových komôr alebo bielej hmoty migrujú mezenchymálne kmeňové bunky do parenchýmu nervového tkaniva a diferencujú sa na deriváty gliovej alebo neuronálnej bunkovej línie. Okrem toho existujú informácie o transdiferenciácii MSC na hematopoetické kmeňové bunky in vitro aj in vivo. Podrobnejšia analýza v niektorých štúdiách určila mimoriadne vysokú plasticitu MSC, ktorá sa prejavuje v ich schopnosti diferencovať sa na astrocyty, oligodendrocyty, neuróny, kardiomyocyty, bunky hladkého svalstva a bunky kostrového svalstva. Množstvo štúdií o transdiferenciačnom potenciáli MSC in vitro a in vivo preukázalo, že multipotentné mezenchymálne progenitorové bunky kostnej drene sa terminálne diferencujú na bunkové línie, ktoré tvoria kosť, chrupavku, svaly, nervy a tukové tkanivo, ako aj šľachy a strómu, ktoré podporujú hematopoézu.

Iné štúdie však neodhalili žiadne známky obmedzenia pluripotencie genómu mezenchymálnych kmeňových buniek a progenitorových populácií stromálnych buniek, hoci bolo študovaných viac ako 200 klonov MSC izolovaných z jednej primárnej kultúry na testovanie možnej pluripotencie stromálnych buniek. Prevažná väčšina klonov in vitro si zachovala schopnosť diferenciácie v osteogénnom, chondrogénnom a adipogénnom smere. Pri vylúčení pravdepodobnosti migrácie recipientných buniek transplantáciou mezenchymálnych kmeňových buniek pod kapsulu obličiek alebo do difúznych komôr sa ukázalo, že stromálne progenitorové bunky in situ si zachovávajú heterogénny fenotyp, čo naznačuje buď absenciu reštrikčných faktorov v transplantačnej zóne, alebo absenciu pluripotencie MSC ako takej. Zároveň sa pripúšťa existencia vzácneho typu somatických pluripotentných kmeňových buniek, ktoré sú spoločnými prekurzormi všetkých dospelých kmeňových buniek.

Multi-, ale nie pluripotencia, pravých mezenchymálnych kmeňových buniek, ktoré tvoria veľmi malú časť buniek kostnej drene a sú schopné proliferovať za určitých podmienok počas kultivácie in vitro bez diferenciácie, sa prejavuje ich indukovanou väzbou na bunky kostného, chrupavkového, tukového a svalového tkaniva, ako aj na tenocyty a stromálne prvky, ktoré podporujú hematopoézu. Dlhodobé vystavenie kultivačnému médiu s fetálnym teľacím sérom spravidla vyvoláva uvoľňovanie MSC do viazaných stromálnych progenitorových buniek, ktorých potomstvo podlieha spontánnej terminálnej diferenciácii. In vitro je možné dosiahnuť cielenú tvorbu osteoblastov pridaním dexametazónu, ß-glycerofosfátu a kyseliny askorbovej do kondicionačného média, zatiaľ čo kombinácia dexametazónu a inzulínových diferenciačných signálov indukuje tvorbu adipocytov.

Bolo zistené, že pred vstupom do štádia terminálnej diferenciácie sa MSC kostnej drene za určitých kultivačných podmienok spočiatku diferencujú na fibroblastom podobné mezenchymálne kmeňové bunky. Deriváty týchto buniek in vivo sa podieľajú na tvorbe kostí, chrupaviek, šliach, tukového a svalového tkaniva, ako aj strómy, ktorá podporuje hematopoézu. Mnohí autori chápu pojem „multipotentné mezenchymálne progenitorové bunky“ ako samotné MSC aj ako angažované stromálne progenitorové bunky kostnej drene a mezenchymálnych tkanív. Klonálna analýza multipotentných mezenchymálnych progenitorových buniek kostnej drene ukázala, že o niečo viac ako tretina všetkých klonov sa diferencuje na osteo-, chondro- a adipocyty, zatiaľ čo bunky zostávajúcich klonov majú iba osteogénny potenciál a tvoria iba chondro- a osteocyty. Klon multipotentných mezenchymálnych progenitorových buniek, ako je BMC-9, sa za vhodných podmienok mikroprostredia diferencuje na bunky s fenotypom a funkčnými charakteristikami nielen osteoblastov, chondrocytov a adipocytov, ale aj stromálnych buniek, ktoré podporujú hematopoézu. Klon buniek RCJ3.1 izolovaných z kostnej drene potkaních plodov sa diferencuje na mezenchymálne bunky rôznych fenotypov. Pri kombinovanom pôsobení kyseliny askorbovej, b-glycerofosfátu a dexametazónu bunkové prvky tohto klonu najprv tvoria multinukleárne myocyty a potom postupne adipocyty, chondrocyty a ostrovčeky mineralizovaného kostného tkaniva. Populácia granulárnych buniek z periostu potkaních plodov zodpovedá neviazaným multipotentným mezenchymálnym progenitorovým bunkám, pretože sa vyznačuje nízkou mierou proliferácie, neexprimuje diferenciačné markery a za kultivačných podmienok sa diferencuje za vzniku chondro-, osteo- a adipocytov, ako aj buniek hladkého svalstva.

Preto by sa malo uznať, že otázka pluri- alebo multipotencie genómu mezenchymálnych kmeňových buniek zostáva otvorená, čo v dôsledku toho ovplyvňuje aj predstavy o diferenciačnom potenciáli stromálnych progenitorových buniek, ktorý tiež nebol definitívne stanovený.

Experimentálne overenou a dôležitou charakteristikou mezenchymálnych kmeňových buniek je ich schopnosť opustiť tkanivovú niku a cirkulovať v krvnom obehu. Na aktiváciu programu genetickej diferenciácie musia takéto cirkulujúce kmeňové bunky vstúpiť do vhodného mikroprostredia. Ukázalo sa, že pri systematickom zavádzaní MSC do krvného obehu recipientných zvierat sa nezrelé bunky implantujú do rôznych orgánov a tkanív, kde sa potom diferencujú na krvné bunky, myocyty, adipocyty, chondrocyty a fibroblasty. V dôsledku toho v lokálnych tkanivových zónach dochádza k signálno-regulačným interakciám medzi neviazanými a viazanými stromálnymi progenitorovými bunkami, ako aj medzi nimi a okolitými zrelými bunkami. Predpokladá sa, že diferenciáciu indukujú parakrinné regulačné faktory mezenchymálneho a nemezenchymálneho pôvodu (rastové faktory, eikosanoidy, molekuly extracelulárnej matrice), ktoré zabezpečujú priestorové a časové prepojenia v mikroprostredí multipotentných mezenchymálnych progenitorových buniek. Lokálne poškodenie mezenchymálneho tkaniva by preto malo viesť k tvorbe zón mikroprostredia multipotentných mezenchymálnych progenitorových buniek, ktoré sú kvalitatívne odlišné od komplexu regulačných signálov intaktných tkanív, v ktorých prebiehajú skôr fyziologické než reparačné regeneračné procesy. Tento rozdiel je mimoriadne dôležitý z hľadiska špecializácie bunkového fenotypu v normálnom a poškodením indukovanom mikroprostredí.

Podľa týchto konceptov sú práve tu zakotvené mechanizmy zásadného rozdielu medzi dvoma známymi procesmi - fyziologickou regeneráciou a zápalovou proliferáciou. Prvý z nich končí obnovou špecializovaného bunkového zloženia tkaniva a jeho funkcie, zatiaľ čo výsledkom realizácie proliferačného procesu je tvorba zrelých prvkov spojivového tkaniva a strata funkcie poškodenej tkanivovej zóny. Pre vývoj optimálnych programov pre využitie multipotentných mezenchymálnych progenitorových buniek v regeneratívno-plastickej medicíne je preto potrebné dôkladné štúdium charakteristík vplyvu faktorov mikroprostredia na diferenciáciu MSC.

Závislosť štruktúry kompartmentu kmeňových buniek od bunkových para- a autokrinných regulátorov, ktorých expresia je modulovaná vonkajšími signálmi, je nepochybná. Medzi funkciami regulačných faktorov sú najdôležitejšie kontrola asymetrického delenia MSC a expresia génov určujúcich štádiá viazania a počet bunkových delení. Externé signály, od ktorých závisí ďalší vývoj MSC, poskytuje ich mikroprostredie. V nezrelom stave MSC proliferujú dlho, pričom si zachovávajú schopnosť diferencovať sa na línie adipocytov, myofibroblastov, strómy hematogénneho tkaniva, chrupavkových a kostných buniek. Bolo zistené, že obmedzená populácia CD34-negatívnych stromálnych bunkových elementov cirkulujúcich v krvi sa vracia z celkového krvného obehu do strómy kostnej drene, kde sa transformuje na línie CD34-pozitívnych hematopoetických kmeňových buniek. Tieto pozorovania naznačujú, že recirkulácia progenitorových mezenchymálnych buniek v krvnom obehu udržiava tkanivovú rovnováhu stromálnych kmeňových buniek v rôznych orgánoch mobilizáciou spoločného súboru nezrelých stromálnych elementov kostnej drene. Diferenciácia MSC na bunky s viacerými mezenchymálnymi fenotypmi a ich účasť na regenerácii alebo oprave kostí, chrupaviek, tukového tkaniva a šliach in vivo bola dokázaná pomocou modelov adoptívneho prenosu na experimentálnych zvieratách. Podľa iných autorov je vzdialená migrácia MSC pozdĺž cievneho riečiska kombinovaná s krátkodobým alebo lokálnym pohybom multipotentných mezenchymálnych progenitorových buniek v tkanive počas opravy chrupavky, regenerácie svalov a iných regeneračných procesov.

Lokálne kmeňové rezervy bázy stromálneho tkaniva pôsobia ako zdroj buniek v procesoch fyziologickej regenerácie tkanív a sú dopĺňané vzdialeným transportom MSC, keďže sa spotrebúvajú zdroje kmeňa stromálneho tkaniva. Avšak v podmienkach potreby núdzovej mobilizácie reparačného bunkového potenciálu, napríklad pri polytraume, sa na procesoch reparatívnej regenerácie zúčastňuje celý sled MSC a mezenchymálne progenitorové bunky kostnej drene sú prostredníctvom celkového prietoku krvi presúvané na perifériu.

Transplantácia mezenchymálnych kmeňových buniek

Medzi procesmi fyziologickej regenerácie tkanív a ich tvorbou počas vnútromaternicového vývoja možno vysledovať určité paralely. V embryogenéze u ľudí a cicavcov dochádza k tvorbe rôznych typov špecializovaných buniek z ekto-, mezo- a endodermálneho poolu zárodočných vrstiev, ale za povinnej účasti mezenchýmu. Riedka bunková sieť embryonálneho mezenchýmového tkaniva vykonáva početné regulačné, metabolické, rámcové a morfogenetické funkcie. K kladeniu provizórnych orgánov dochádza až po kondenzácii mezenchýmu v dôsledku klonogénneho rastu progenitorových buniek, ktoré generujú primárne morfogenetické signály organogenézy. Stromálne deriváty embryonálneho mezenchýmu vytvárajú bunkovú kostru provizórnych orgánov a tvoria základ pre ich budúce energeticko-plastické zásobovanie v dôsledku rastu primárnych krvných a lymfatických ciev. Inými slovami, stromálne prvky mikrocirkulačnej jednotky fetálnych orgánov vznikajú pred tvorbou ich štrukturálnych a funkčných jednotiek. Okrem toho aktívna migrácia mezenchymálnych buniek počas organogenézy zabezpečuje priestorovú orientáciu vyvíjajúcich sa orgánov tým, že vyznačuje ich objemové hranice prostredníctvom obmedzenia homeotických Hox-typov. Stromálna kostra slúži aj ako základ pre zostavenie štrukturálnych a funkčných jednotiek parenchymatóznych orgánov, ktoré často zahŕňajú morfogeneticky a funkčne úplne odlišné bunky. V dôsledku toho sú počas embryogenézy funkcie mezenchýmu primárne a realizujú sa prostredníctvom generovania regulačných signálov, ktoré aktivujú regionálnu proliferáciu a diferenciáciu progenitorových epitelových buniek. Embryonálne mezenchýmové bunky produkujú rastové faktory, ako sú HGF-β, HGF-β, CSF, pre ktoré majú parenchymálne progenitorové bunky zodpovedajúce receptory. V diferencovanom zrelom tkanive dospelého organizmu stromálna sieť buniek generuje aj signály na udržanie životaschopnosti a proliferácie progenitorových buniek nemezenchymálneho pôvodu. Spektrum stromálnych regulačných signálov v postnatálnej ontogenéze je však odlišné (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF atď.) a je zamerané na zabezpečenie fyziologickej regenerácie alebo opravy poškodených tkanivových zón. Spektrálne charakteristiky stromálnych regulačných faktorov sú navyše v každom type tkaniva a dokonca aj v rámci jedného orgánu odlišné. Najmä hematopoéza a lymfopoéza s proliferáciou a diferenciáciou hematopoetických a imunokompetentných buniek sa vyskytujú iba v určitých orgánoch, v rámci ktorých funguje stromálne mikroprostredie, ktoré poskytuje podmienky pre dozrievanie hematopoetických a lymfoidných buniek. Schopnosť hematopoetických a lymfoidných buniek znovu osídliť daný orgán, proliferovať a dozrievať v jeho mikroštrukturálnych výklenkoch závisí od regulačných faktorov mikroprostredia.

Medzi zložkami extracelulárnej matrice, ktoré produkujú multipotentné mezenchymálne progenitorové bunky, treba spomenúť fibronektín, laminín, kolagén a proteoglykány, ako aj CD44 (receptor pre hyaluronan a osteopontín), ktoré zohrávajú hlavnú úlohu v organizácii medzibunkových interakcií a tvorbe extracelulárnej matrice v kostnej dreni a kostnom tkanive. Bolo dokázané, že multipotentné mezenchymálne progenitorové bunky kostnej drene vytvárajú stromálne mikroprostredie, ktoré poskytuje indukčné a regulačné signály nielen MSC, ale aj hematopoetickým progenitorom a iným nemezenchymálnym kmeňovým bunkám kostnej drene. Je známe, že účasť MSC na hematopoéze je určená ich schopnosťou diferencovať sa na stromálne bunky, ktoré podporujú hematopoézu, a tento inštruktívny signál MSC prijímajú priamo z hematopoetických kmeňových buniek. Preto v kultúre sieť stromálnych progenitorových buniek slúži ako výživná základňa pre vývoj všetkých klonov hematopoetických buniek.

V zrelom organizme je intenzita hemo- a lymfopoézy v stave dynamickej rovnováhy s „výdajom“ zrelých krviniek a buniek imunitného systému na periférii. Keďže stromálne bunky kostnej drene a lymfoidných orgánov sa obnovujú extrémne zriedkavo, nedochádza v nich k významnej reštrukturalizácii stromálnych štruktúr. Systém môže byť vyvedený z dynamickej rovnováhy mechanickým poškodením ktoréhokoľvek z orgánov hemo- alebo lymfoidnej činnosti, čo vedie k rovnomerným postupným zmenám, ktoré sa týkajú nielen a ani nie tak hematopoetických alebo lymfoidných prvkov, ako skôr stromálnych štruktúr poškodeného orgánu. V procese reparačnej regenerácie sa najprv vytvorí stromálna báza, ktorá je potom znovu osídľovaná hematopoetickými alebo imunokompetentnými bunkami. Táto dlhodobo známa skutočnosť robí z posttraumatickej regenerácie vhodný model na štúdium stromálneho mikroprostredia hematopoetických orgánov. Najmä mechanické vyprázdňovanie dreňovej dutiny tubulárnych kostí sa používa na štúdium reparatívnej regenerácie kostnej drene - kyretáže, ktorá umožňuje rýchle a účinné odstránenie hematopoetického tkaniva zo stavu dynamickej rovnováhy. Pri štúdiu procesov reparatívnej regenerácie hematopoetických a stromálnych zložiek kostnej drene po mechanickom vyprázdnení dreňovej dutiny holennej kosti morčiat sa zistilo, že neexistuje priama korelácia medzi indexmi regenerácie hematopoetických a stromálnych buniek (počet hematopoetických buniek, koncentrácia a počet stromálnych progenitorových buniek). Okrem toho sa ukázalo, že k nárastu populácie stromálnych progenitorových buniek dochádza skôr po kyretáži a samotné stromálne fibroblasty sa stávajú fosfatázovo pozitívnymi, čo je typické pre osteogénne tkanivo. Bolo tiež zistené, že kyretáž 3-5 tubulárnych kostí vedie k rastu tejto bunkovej populácie v kostnej dreni neoperovaných kostí a dokonca aj v slezine, ktorá je u morčiat výlučne lymfopoetickým orgánom.

Morfologický obraz reparačných procesov v kostnej dreni kyretovaných holenných kostí morčiat vo všeobecnosti zodpovedá údajom opísaným v literatúre získaným v experimentoch na zvieratách iných druhov a dynamika zmien, ku ktorým dochádza po odstránení krvotvorného tkaniva, je pre všetky druhy zvierat rovnaká a rozdiel sa týka iba časových parametrov. Morfologicky pozostáva fázové poradie obnovy krvotvorby vo vyprázdnenej miechovej dutine z postupných procesov organizácie krvnej zrazeniny, tvorby hrubého vláknitého kostného tkaniva, jeho resorpcie, vývoja sinusoidov a tvorby retikulárnej strómy, ktorá je následne znovu osídľovaná krvotvornými prvkami. V tomto prípade sa počet progenitorových krvotvorných buniek v procese regenerácie tkaniva kostnej drene zvyšuje súbežne so zvyšujúcim sa obsahom krvotvorných kmeňových buniek.

Yu. Gerasimov a spoluautori (2001) porovnávali zmeny v počte hematopoetických buniek a počte stromálnych progenitorových buniek v jednotlivých fázach regeneračného procesu. Ukázalo sa, že kvantitatívne zmeny v bunkách kostnej drene v kyretovanej kosti zodpovedajú dynamike morfologických charakteristík regenerácie. Autori spájajú pokles bunkového obsahu v regeneráte počas prvých troch dní so smrťou hematopoetických buniek v dôsledku nepriaznivého vplyvu mikroprostredia vytvoreného proliferujúcim retikulárnym tkanivom v zachovanej kostnej dreni v oblasti epifýzy, ako aj s tvorbou ložísk osteoidného tkaniva v nej a poškodením ciev počas kyretáže. Na 7. – 12. deň sa zvýšenie hladiny jadrových buniek zhoduje s výskytom jednotlivých ložísk myeloidnej hematopoézy v zónach proliferácie stromálnych elementov. Na 20. deň sa objavujú významné oblasti regenerovanej kostnej drene a dobre vyvinuté dutiny, čo je sprevádzané významným zvýšením celkového počtu buniek. Počet hematopoetických prvkov počas tohto obdobia však predstavuje 68 % kontrolnej úrovne. To je v súlade s predtým publikovanými údajmi, že počet hematopoetických buniek po kyretáži dosahuje normu až 35. – 40. deň po operácii.

V skorom posttraumatickom období je hlavným zdrojom obnovy hematopoézy lokálne bunkové elementy zachované počas kyretáže. V neskorších štádiách je hlavným zdrojom regenerácie hematopoetického tkaniva kostnej drene kmeňové bunky repopulujúce voľné stromálne zóny. Pokiaľ ide o jednotlivé kategórie stromálnych buniek (endotelové, retikulárne a osteogénne), zdroje, ktoré zabezpečujú ich tvorbu počas reorganizácie dutiny kostnej drene, zostávajú nejasné. Výsledky štúdie Yu. V. Gerasimova a spoluautorov (2001) naznačujú, že v kostnej dreni zachovanej po kyretáži je koncentrácia buniek tvoriacich kolónie fibroblastov výrazne vyššia ako v normálnej kostnej dreni. Autori sa domnievajú, že kyretáž vedie k intenzívnejšiemu selektívnemu vymývaniu hematopoetických buniek v porovnaní so stromálnymi bunkami tvoriacimi kolónie, ktoré sa podieľajú na tvorbe strómy a sú silnejšie spojené s jej hlavnou substanciou ako hematopoetické bunky.

Dynamika zmeny počtu buniek tvoriacich fibroblastové kolónie koreluje s intenzitou procesov osteogenézy, následnou resorpciou kostných trabekúl a tvorbou retikulárnej strómy, ktorá je osídlená hematopoetickými bunkami. Väčšina stromálnych progenitorových buniek v stanovených termínoch regenerácie tvorí hrubé vláknité kostné tkanivo a retikulárnu strómu. V prípade zlomenín stehennej kosti za podmienok predĺženej osteosyntézy sa na 5. deň v regeneračnej zóne zvyšuje koncentrácia a počet buniek tvoriacich fibroblastové kolónie a počas obdobia intenzívnej tvorby kosti sa ich počet zvyšuje 6-krát. Je známe, že bunky kostnej drene tvoriace fibroblastové kolónie majú osteogénne vlastnosti. Počet stromálnych progenitorových buniek sa zvyšuje pred osídlením kyretovaného územia kostnej drene hematopoetickými bunkami. To je v súlade s údajmi, že stromálne bunky zabezpečujú tvorbu hematopoetického mikroprostredia. Zdá sa, že vytvorenie hematopoetického mikroprostredia zodpovedá určitej úrovni regenerácie stromálneho tkaniva a počet hematopoetických buniek sa zvyšuje s rozširovaním stromálnej platformy vhodnej pre hematopoézu.

Najzaujímavejšie sú údaje autorov, že bezprostredne po kyretáži sa zvyšuje počet stromálnych progenitorových buniek v odľahlých častiach kostry. Od šiestej hodiny až do dvadsiateho dňa vrátane sa v kontralaterálnej holennej kosti pozoruje viac ako dvojnásobný nárast koncentrácie aj počtu buniek tvoriacich fibroblastové kolónie. Mechanizmus tohto javu pravdepodobne súvisí so skutočnosťou, že masívne poškodenie kostnej drene vedie k tvorbe veľkého množstva krvných zrazenín so súčasnou deštrukciou významného počtu krvných doštičiek a uvoľnením rastového faktora odvodeného z krvných doštičiek (PDGF) do krvi, o ktorom je známe, že spôsobuje proliferáciu buniek tvoriacich fibroblastové kolónie nachádzajúcich sa v tele mimo proliferačného poolu. V experimentoch na králikoch lokálne podávanie MSC podporuje obnovu chrupavkového tkaniva chirurgicky poškodeného kolenného kĺbu, čo môže súvisieť s tvorbou chondrocytov pochádzajúcich z injikovaných MSC. Reparatívna regenerácia kostných defektov u laboratórnych potkanov je však významne zlepšená použitím mezenchymálnych kmeňových buniek uzavretých v keramickej štruktúre. Preto sa dá predpokladať, že ak nie RBOC, tak nejaký iný faktor pochádzajúci z poškodených stromálnych buniek má vzdialený stimulačný účinok na proliferáciu mezenchymálnych progenitorových buniek v intaktných zónach kostnej drene a stimuluje ich migráciu do oblasti defektu kostnej drene. Toto je zase v rozpore s údajmi z literatúry z predchádzajúcich rokov, ktoré naznačujú, že stromálne bunky zodpovedné za mikroprostredie, na rozdiel od hematopoetických buniek, nie sú schopné migrácie a pochádzajú z lokálnych zdrojov.

Výsledky štúdie Yu. Gerasimova a spoluautorov (2001) však naznačujú, že mechanická trauma spôsobuje nielen prudkú reštrukturalizáciu stromálneho tkaniva v kyretovanej kosti, ale aj významné zmeny v stróme vo vzdialených intaktných kostiach, t. j. existuje systémová reakcia stromálneho tkaniva na lokálnu traumu. Navyše, pri polytraume - viacnásobnej kyretáži - je táto reakcia zosilnená a pozoruje sa nielen v operovanej kosti a vzdialených častiach kostry, ale aj v lymfoidných orgánoch, najmä v slezine. Mechanizmus takejto systémovej reakcie stromálneho tkaniva kostnej drene a sleziny na lokálnu traumu a polytraumu zostáva neznámy. Predpokladá sa, že tento proces je spojený s pôsobením humorálneho faktora vylučovaného mezenchymálnou strómou dreňovej dutiny kostnej drene. Možnosť produkcie orgánovo nešpecifického humorálneho faktora zodpovedného za proliferáciu buniek tvoriacich fibroblastové kolónie stromálnymi bunkami kostnej drene a sleziny dokazujú údaje o ich aktivite stimulujúcej kolónie v monovrstvových kultúrach kostnej drene.

V tejto súvislosti stojí za zmienku, že pri systémovom podávaní multipotentných mezenchymálnych progenitorových buniek ich deriváty repopulujú nielen kostnú dreň, ale aj iné tkanivá, čo sa používa najmä na génovú terapiu. Ukázalo sa, že pri intravenóznom podávaní veľkého množstva MSC s genómom divokého typu myšiam s mutáciou v géne kolagénu I darcovské bunky nahradia až 30 % buniek v kostnom a chrupavkovom tkanive príjemcov a transfekované myšie mezenchymálne kmeňové bunky vylučujúce ľudský IL-3 účinne podporujú hematopoézu počas 9 mesiacov v prípade ich súčasného podávania s ľudskými hematopoetickými kmeňovými bunkami imunodeficientným myšiam.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Genetická modifikácia mezenchymálnych kmeňových buniek

Medzi úspechmi experimentálnej genetickej modifikácie MSC stojí za zmienku transfekcia génu faktora IX do ľudských MSC s následným prenosom transfektovaných buniek imunodeficientným myšiam, čo vedie k výskytu antihemofilného faktora B v krvi počas 8 týždňov po transplantácii. V tomto experimente sa v transfekovaných bunkách uskutočnila posttranslačná modifikácia faktora IX pomocou γ-glutamylkarboxylázy. Transdukcia MSC retrovírusovým vektorom kódujúcim ľudský faktor IX bola menej úspešná - následné podanie týchto buniek psovi s hemofíliou B poskytlo terapeutickú hladinu faktora IX, ktorá udržiavala normálnu intenzitu koagulačnej hemostázy, iba 12 dní.

Transplantácia mezenchymálnych kmeňových buniek do mozgového parenchýmu zvierat ukázala, že nezrelé bunky darcov sa transformujú na neuronálne aj gliové populácie. Engraftment neuronálnych derivátov mezenchymálneho tkaniva zdravého darcu teoreticky umožňuje korigovať genetické abnormality metabolizmu mozgu u pacientov s Gaucherovou chorobou a inými poruchami metabolizmu lipidov, gangliozidov alebo sacharidov.

Experimentálne hľadanie podmienok pre transdiferenciáciu stromálnych kmeňových buniek kostnej drene na progenitorové bunky nervového a pečeňového tkaniva stále prebieha. Pozornosť výskumníkov sa zameriava na kombinácie induktorov diferenciácie a špeciálnych podmienených médií. Konkrétne, na izoláciu primárnej kultúry stromálnych buniek sa bunky kostnej drene premyté a resuspendované v kultivačnom médiu DMEM/F12 (1/1) s 10 % fetálnym teľacím sérom vysievajú v hustote 200 000/cm2. Po 24 hodinách sa nepriľnuté bunky odstránia a bunky podobné fibroblastom pripojené k plastu sa kultivujú jeden týždeň. Na diferenciáciu stromálnych buniek kostnej drene na neuroblasty sa používa kondicionované médium získané trojdňovou kultiváciou primárnej kultúry myších embryonálnych fibroblastov, ako aj médium DMEM/F12 (1/1) s 2 % fetálnym teľacím sérom a pridaním 20 ng/ml NF alebo 10-6 M kyseliny retínovej (neuroinduktory, ktoré sa používajú na neurálnu diferenciáciu myších a ľudských embryonálnych kmeňových buniek). Diferenciácia stromálnych buniek kostnej drene na prekurzorové bunky hepatocytov sa indukuje v kondicionovanom médiu vytvorenom ako výsledok trojdňovej kultivácie primárnej kultúry myších embryonálnych pečeňových buniek v médiu DMEM/F12 (1/1) s pridaním 10 % fetálneho teľacieho séra.

Tu treba ešte raz poznamenať, že kolónie tvoriace bunky strómy kostnej drene sú heteromorfné a možno ich rozdeliť na dva typy. Prvý typ zahŕňa bunky podobné fibroblastom, ktoré tvoria filopódie s veľkými jadrami a jedným alebo dvoma jadierkami. Druhý typ predstavujú malé vretenovité bunky. Pri kultivácii buniek oboch typov v podmienenom médiu získanom na podpôrnej vrstve primárnych myších embryonálnych fibroblastov sa bunky podobné neuroblastom objavujú v kultúre na 3. až 4. deň. V tomto štádiu majú najčastejšie vretenovitý tvar s jedným alebo dvoma dlhými výbežkami končiacimi filopódiami. Menej časté sú pyramídové alebo hviezdicovité bunky s krátkymi dendritmi. Dendrity niektorých neuroblastov majú charakteristické rozšírenia (rastové púčiky) a vetvy v distálnej časti, zatiaľ čo iné majú zreteľné rastové kužele s filopódiami, cez ktoré dendrity rastú. Podobné morfologické znaky (púčiky a rastové kužele s filopódiami) vlastné neuroblastom diferencujúcim sa na neuróny boli podrobne opísané v štúdiách neurogenézy. Na základe toho niektorí autori dospeli k záveru, že bunky, ktoré v kultúre našli, sú neuroblasty. Konkrétne E. Ščegelská a spoluautori (2002) po kultivácii primárnej kultúry stromálnych buniek počas dvoch týždňov v podmienenom médiu, ktoré sa menilo každé 3. až 4. deň, zistili, že niektoré bunky proliferovali a zároveň si zachovali nediferencovaný stav. Navonok sa takéto bunky podobali fibroblastom a v kultúre boli detegované spolu s diferencujúcimi sa neuroblastami. Väčšina buniek (približne 80 %) bola v rôznych štádiách diferenciácie na bunky nervového tkaniva, predovšetkým na neuróny. Dendritické výbežky týchto buniek boli v úzkom kontakte, takže bunky postupne tvorili na substráte úseky nervovej siete vo forme dlhých mnohobunkových vlákien. Dendritické výbežky neuroblastov sa výrazne predĺžili, niektoré z nich 8 až 10-krát presiahli dĺžku samotného tela neurónu. Podiel pyramídových a hviezdicových buniek sa postupne zvyšoval. Dendrity hviezdicových buniek sa rozvetvili. Podľa autorov neskoršia diferenciácia pyramídových a hviezdicových buniek v porovnaní s vretenovito tvarovanými bunkami zodpovedá postupnosti štádií normálnej neurogenézy u zvierat. Autori preto dospeli k záveru, že stromálne kmeňové bunky kostnej drene prechádzajú indukovanou neurogenézou, počas ktorej sa z neuroblastov in vitro tvoria všetky tri hlavné typy neurónov. Prekurzory nervových buniek boli tiež detegované počas kultivácie stromálnych buniek kostnej drene počas 3 – 4 dní v médiu s 2 % fetálnym sérom a 20 ng/ml LIF. V tomto prípade sa však kmeňové bunky delili veľmi pomaly, diferenciácia neuroblastov sa vyskytla iba v 30 % prípadov a netvorili neurónové siete. Použitím kyseliny retínovej ako jedného z induktorov diferenciácie nervových buniek autori získali v kultúre až 25 – 30 % nervových buniek.s prevahou gliových elementov - astrocytov a oligodendrocytov. Neuróny tvorili iba tretinu všetkých nervových buniek, hoci boli zastúpené všetkými tromi typmi: vretenovité, pyramídové a hviezdicovité bunky. Na 6. deň kultivácie stromálnych buniek v médiu s kyselinou retinovou sa nervové bunky viac diferencovali a v jednotlivých pyramídových neurónoch sa našli axóny, ktoré sa pri normálnej neuroontogenéze objavujú neskôr ako tvorba dendritických výbežkov. Podľa autorov má metóda indukcie kyselinou retinovou napriek nízkemu výťažku nervových buniek svoje výhody: oligodendrocyty a astrocyty vykonávajú myelinačné a nutričné funkcie počas rastu dendritov a axónov a sú nevyhnutné pre normálnu tvorbu nervového tkaniva. Preto je na opravu jeho poškodených oblastí in vivo lepšie použiť suspenziu neurónov obohatenú gliovými bunkami.

V druhej sérii experimentov sa autori pokúsili indukovať diferenciáciu stromálnych buniek kostnej drene na pečeňové bunky. Po troch dňoch kultivácie stromálnych kmeňových buniek kostnej drene v podmienenom médiu získanom inkubáciou myších embryonálnych hepatocytov sa našli veľké, guľovité bunky, často dvojjadrové, s cytoplazmatickými inklúziami rôznych veľkostí. Tieto bunky boli v rôznych štádiách diferenciácie a líšili sa veľkosťou, počtom jadier a inklúziami v cytoplazme. Vo väčšine týchto buniek bol detegovaný glykogén, na základe čoho ich autori identifikovali ako prekurzorové bunky hepatocytov. Keďže v kultúre sa nenašli žiadne bunky podobné neuroblastom, dospeli k záveru, že podmienené médium získané v dôsledku kultivácie embryonálnych hepatocytov neobsahovalo diferenciačné faktory nervových buniek a naopak obsahovalo faktory indukujúce diferenciáciu stromálnych buniek kostnej drene na prekurzorové bunky hepatocytov. Záverom autori naznačujú prítomnosť pluripotencie v stromálnych bunkách kostnej drene, pretože sa in vitro diferencujú na nervové alebo pečeňové tkanivové bunky v závislosti od použitého špecifického podmieneného média a induktorov.

Niektoré štúdie skutočne správne preukázali diferenciáciu stromálnych buniek kostnej drene na kardiomyocyty, chrupavkové, kostné a nervové tkanivové bunky. Existujú dôkazy o tom, že medzi bunkami kostnej drene existujú populácie kmeňových buniek schopných diferenciácie na hepatocyty. Vzhľadom na tieto údaje možno výsledky vyššie uvedených experimentov na myšiach stále považovať za ďalšie potvrdenie prítomnosti pluripotentných mezenchymálnych kmeňových buniek v kostnej dreni schopných diferenciácie na bunky rôznych tkanív dospelého organizmu.

Transplantácia mezenchymálnych kmeňových buniek

V klinickej transplantológii sa ľudské mezenchymálne kmeňové bunky môžu použiť na zabezpečenie expanzie hematopoetických kmeňových buniek, ako aj ich skorých prekombinovaných potomkov. Najmä zavedenie autológnych hematopoetických kmeňových buniek a MSC pacientom s rakovinou po vysokodávkovej chemoterapii urýchľuje obnovu počtu neutrofilov a krvných doštičiek v periférnej krvi. Alo- a autológne transplantáty mezenchymálnych kmeňových buniek sa používajú na liečbu mnohopočetného myelómu, aplastickej anémie a spontánnej trombocytopénie - ochorení spojených s primárnym defektom v stróme hematopoetického tkaniva. Účinnosť bunkovej terapie v onkohematologickej patológii je v mnohých prípadoch vyššia pri súčasnom zavedení stromálnych a hematopoetických kmeňových buniek, čo sa prejavuje skrátením pooperačného obdobia obnovy hematopoézy, znížením počtu úmrtí v dôsledku neselektívnej deštrukcie regionálnych a cirkulujúcich rakovinových buniek, pri ktorých odumierajú aj pacientove vlastné progenitorové hematopoetické bunky. Perspektívy využitia MSC a iných multipotentných mezenchymálnych progenitorových buniek v klinickej praxi sú spôsobené relatívnou ľahkosťou ich získania z aspirátov kostnej drene, expanziou v kultúre a transfekciou terapeutických génov. Zároveň sa lokálna implantácia multipotentných mezenchymálnych progenitorových buniek môže použiť na kompenzáciu lokálnych tkanivových defektov a v prípade systémových dysfunkcií tkanív mezenchymálneho pôvodu nie je vylúčené ich zavedenie do krvného obehu.

Autori prác, v ktorých analyzujú perspektívy využitia MSC pre lokálnu, systémovú transplantáciu a génovú terapiu z hľadiska biológie stromálnych buniek, sú vo svojom uvažovaní opatrnejší. Postnatálna kostná dreň sa tradične považuje za orgán pozostávajúci z dvoch hlavných systémov jasne definovaných bunkových línií - samotného hematopoetického tkaniva a s ním spojenej podpornej strómy. Preto boli mezenchymálne kmeňové bunky kostnej drene spočiatku považované výlučne za zdroj stromálneho základu pre produkciu regulačných faktorov hematopoetického mikroprostredia. Potom sa pozornosť výskumníkov presunula na štúdium úlohy MSC ako kmeňového zdroja kostrových tkanív. Najnovšie údaje naznačujú neočakávaný potenciál diferenciácie stromálnych buniek kostnej drene s tvorbou nervového alebo svalového tkaniva. Inými slovami, mezenchymálne kmeňové bunky vykazujú transgermálnu plasticitu - schopnosť diferencovať sa na bunkové typy fenotypovo nesúvisiace s bunkami pôvodného tkaniva. Zároveň niektoré aspekty biológie stromálnych buniek kostnej drene zostávajú nejasné a nevyriešené, a to ako vo všeobecných biologických pojmoch, tak aj v jednotlivých detailoch, vrátane identifikácie, povahy, pôvodu, vývoja a funkcie stromálnych buniek kostnej drene in vivo, ako aj prípustného diferenciačného potenciálu ex vivo a možností terapeutického využitia in vivo. Získané údaje o potenciáli MSC, ako aj výsledky štúdií regeneračného potenciálu iných kmeňových buniek, sú v ostrom rozpore s dogmami zavedenými v biológii.

Pri kultivácii s nízkou hustotou tvoria stromálne kmeňové bunky kostnej drene odlišné kolónie, z ktorých každá pochádza z jednej progenitorovej bunky. Percento stromálnych progenitorových buniek v jadrových bunkách kostnej drene, určené schopnosťou tvoriť kolónie, je vysoko závislé od kultivačných podmienok aj od druhu MSC. Napríklad u hlodavcov je prítomnosť ožiarených kŕmnych buniek kostnej drene a séra v kultúre absolútne nevyhnutná na získanie maximálneho počtu stromálnych progenitorových buniek, zatiaľ čo u ľudí je účinnosť mezenchymálnych kmeňových buniek pri tvorbe kolónií nezávislá od kŕmneho média aj kultivačného média. Počet známych mitogénnych faktorov, ktoré stimulujú proliferáciu stromálnych progenitorových buniek, je obmedzený. Patria sem PDGF, EGF, FGF, TGF-β a IGF1. Za optimálnych kultivačných podmienok dokážu polyklonálne línie MSC odolať viac ako 50 bunkovým deleniam in vitro, čo umožňuje získať miliardy stromálnych buniek kostnej drene z 1 ml ich aspirátu.

Populácia stromálnych buniek kostnej drene je však heterogénna, čo sa prejavuje variabilitou veľkosti kolónií, rôznou rýchlosťou ich tvorby a rozmanitosťou bunkovej morfológie, ktorá pokrýva rozsah od fibroblastom podobných vretenovito tvarovaných buniek až po veľké ploché bunky. Počas vývoja takýchto kultúr sa po 20 dňoch pozoruje aj fenotypová heterogenita. Niektoré kolónie sa vyznačujú vysokou expresiou alkalickej fosfatázy, iné ju vôbec neexprimujú a kolónie tretieho typu sú v centrálnej oblasti pozitívne na fosfatázu a na periférii negatívne na fosfatázu. Jednotlivé kolónie tvoria uzlíky kostného tkaniva (nástup mineralizácie matrice je označený farbením alizarínovou červenou alebo na vápnik podľa Van Kossa). V iných kolóniách dochádza k akumulácii tuku, ktorá sa identifikuje G-farbením olejovou červenou. Menej často kolónie mezenchymálnych kmeňových buniek tvoria chrupavky farbené alciánovou modrou).

Po ektopickej transplantácii experimentálnym zvieratám tvoria polyklonálne línie MGK ektopickú kosť s retikulárnou strómou spojenou s myelopoézou a adipocytmi a menej často s chrupavkovým tkanivom. Pri transplantácii monoklonálnych línií stromálnych buniek kostnej drene sa v niektorých prípadoch pozoruje chimerizmus, pri ktorom de novo kosť pozostáva z buniek kostného tkaniva, obsahuje strómu a adipocyty darcovského pôvodu, zatiaľ čo bunky hematopoetickej línie a cievneho systému pochádzajú od príjemcu.

Výsledky týchto štúdií potvrdzujú kmeňovú povahu progenitorových buniek stromy kostnej drene, z ktorých bola klonálna línia odvodená. Naznačujú tiež, že nie všetky bunky klonogénne v kultúre sú skutočne multipotentné kmeňové bunky. Niektorí výskumníci sa domnievajú a my zdieľame ich názor, že najspoľahlivejšie informácie o skutočnom diferenciačnom potenciáli jednotlivých klonov možno získať iba in vivo po transplantácii a nie určením fenotypu ich derivátov in vitro. Expresia fenotypových markerov osteo-, chondro- alebo adipogenézy v kultúre (stanovená mRNA alebo histochemickými technikami) a dokonca ani produkcia mineralizovanej matrice neodrážajú stupeň pluripotencie jednotlivého klonu in vivo. Preto je identifikácia kmeňových buniek v skupine stromálnych buniek možná iba a posteriori, za vhodných podmienok biologického transplantačného testu. Chondrogenéza sa najmä veľmi zriedkavo pozoruje v otvorených transplantačných systémoch, zatiaľ čo tvorba chrupavky nie je ani zďaleka nezvyčajná v uzavretých systémoch, ako sú difúzne komory alebo in vitro mikromasové kultúry stromálnych buniek, kde sa dosahuje lokálne nízky tlak kyslíka, čo podporuje tvorbu chrupavkového tkaniva. Preto aj transplantačná technika, ako aj nešpecifické podmienky kultivácie in vitro, významne ovplyvňujú rozsah diferenciácie MSC.

Experimentálna transplantácia za špecifikovaných experimentálnych podmienok je zlatým štandardom pre určenie diferenciačného potenciálu stromálnych buniek kostnej drene a kľúčovým prvkom pri ich identifikácii. Historicky sú štúdie transplantácie stromálnych buniek kostnej drene spojené s všeobecným problémom transplantácie kostnej drene. Bolo zistené, že hematopoetické mikroprostredie sa vytvára transplantáciou stromálnych bunkových línií kostnej drene a zabezpečuje ektopický vývoj hematopoetického tkaniva v transplantačnej zóne. Pôvod mikroprostredia od darcu a hematopoetického tkaniva od hostiteľa nám umožňuje považovať ektopickú kosť za skutočnú „invertovanú“ transplantáciu kostnej drene. Lokálna transplantácia stromálnych buniek kostnej drene podporuje účinnú korekciu kostných defektov, výraznejšiu ako pri spontánnej reparatívnej regenerácii. Niekoľko predklinických štúdií na experimentálnych modeloch presvedčivo preukázalo možnosť použitia transplantácií stromálnych buniek kostnej drene v ortopédii, hoci na optimalizáciu týchto metód je potrebná najdôkladnejšia práca a analýza, a to aj v najjednoduchších prípadoch. Najmä optimálne podmienky pre expanziu osteogénnych stromálnych buniek ex vivo ešte neboli stanovené, štruktúra a zloženie ideálneho nosiča, ako aj počet buniek potrebných na objemovú regeneráciu kostí, zostávajú nevyvinuté.

Okrem použitia ex vivo expandovaných stromálnych buniek kostnej drene na regeneráciu tkanív mezenchymálneho pôvodu, neortodoxná plasticita MSC otvára potenciálne aplikácie pre regeneráciu nervových buniek alebo dodávanie génových produktov do CNS. V princípe to zjednodušuje bunkovú terapiu poškodenia nervového systému, pretože nie je potrebné získavať autológne ľudské nervové kmeňové bunky. Boli hlásené potenciálne aplikácie buniek kostnej drene na generovanie kardiomyocytov a myogénnych progenitorových buniek pravého stromálneho aj extrastromálneho pôvodu.

Experimenty sa vykonávajú so systémovou transplantáciou stromálnych buniek kostnej drene na liečbu bežných ochorení kostry. Niet pochýb o tom, že stromálne bunky kostnej drene sú populáciou zodpovednou za genetické poruchy pri ochoreniach kostry, čo dobre ilustruje vektorový prenos genetickej informácie pomocou týchto buniek, ktorý vedie k tvorbe patologického kostného tkaniva u experimentálnych zvierat. Schopnosť stromálnych buniek implantovať, uchytiť sa, proliferovať a diferencovať sa v kostných kostiach po zavedení do krvného obehu však ešte nebola preukázaná.

Je to čiastočne preto, že pri štandardnej transplantácii kostnej drene sa stróma netransplantuje spolu s hematopoetickým tkanivom, takže prísne kritériá na hodnotenie úspešného prihojenia systémovo podávaných stromálnych buniek ešte neboli vyvinuté. Treba mať na pamäti, že prítomnosť markerových génov v tkanivových extraktoch alebo izolácia buniek darcovského pôvodu v kultúre neindikuje prihojenie buniek, ale iba ich prežitie. Dokonca aj intraarteriálna injekcia stromálnych buniek kostnej drene do končatiny myši môže viesť k prakticky nulovému prihojeniu, a to aj napriek tomu, že bunky darcovského pôvodu sa nachádzajú vo veľkom počte v mikrocirkulácii kostnej drene. Takéto bunky sa, žiaľ, zvyčajne opisujú ako „prihojené“ len na základe detekcie markerových génov pre darcovské bunky v ex vivo kultúre. Okrem toho je potrebné poskytnúť presvedčivé dôkazy o dlhodobej integrácii diferencovaných a funkčne aktívnych buniek darcovského pôvodu v skúmaných tkanivách. V mnohých publikovaných prácach, ktoré informujú o prihojení stromálnych buniek kostnej drene v kostre, je absencia jasných údajov tohto druhu zarážajúca. Treba však poznamenať, že niektoré správne experimenty na zvieratách skutočne preukázali obmedzené, ale skutočné uchytenie stromálnych progenitorových buniek po ich systémovom podaní.

Tieto údaje sú v súlade s výsledkami štúdií o možnosti dodávania myogénnych progenitorových buniek kostnej drene do svalu prostredníctvom cievneho systému. Netreba však zabúdať, že kostrové aj svalové tkanivo sa tvoria počas vývoja a rastu na základe extravaskulárnych pohybov buniek, ktoré využívajú migračné procesy nezahŕňajúce krvný obeh. Ak existuje nezávislá obehová cesta pre dodávanie progenitorových buniek do tkanív v pevnej fáze, je možné predpokladať existenciu fyziologicky cirkulujúcich mezenchymálnych progenitorových buniek? Aký je pôvod týchto buniek vo vyvíjajúcom sa aj postnatálnom organizme a ako prenikajú cievnou stenou? Riešenie týchto otázok sa javí ako absolútne nevyhnutné a vyžaduje si čo najdôkladnejšiu predklinickú analýzu. Aj po nájdení odpovedí na tieto otázky zostanú problematické kinetické aspekty spojené s rastom kostry a remodeláciou spojivového tkaniva nevyriešené. Zároveň sa liečba porúch osteogenézy nahradením celej populácie mutovaných kostrových progenitorových buniek zdravými stromálnymi prvkami javí ako reálna klinická perspektíva. V tomto prípade je možné lokálne zóny zlomenín alebo deformácie v dôsledku patologickej osteogenézy, ako aj deštruktívne zmeny v kostnom tkanive, korigovať pomocou stromálnych kmeňových buniek kultivovaných in vitro. Preto je vhodné zamerať budúci výskum na problémy transformácie alebo genetickej korekcie autológnych mutovaných osteogénnych progenitorových buniek ex vivo.

Genetické inžinierstvo buniek, krátkodobé alebo trvalé, sa stalo základom bunkovej a molekulárnej biológie, zdrojom mnohých vedeckých objavov týkajúcich sa úlohy jednotlivých proteínov v bunkovom metabolizme in vitro a in vivo. Využitie molekulárnych technológií na korekciu dedičných patológií a ľudských ochorení je pre praktickú medicínu veľmi sľubné, pretože vlastnosti stromálnych kmeňových buniek kostnej drene umožňujú vyvinúť jedinečné transplantačné schémy na korekciu genetických ochorení kostry. Zároveň sa mezenchymálne prekurzorové bunky dajú ľahko získať od budúceho príjemcu, sú prístupné genetickej manipulácii a sú schopné sa množiť vo veľkom množstve v krátkom časovom období. Použitie mezenchymálnych kmeňových buniek umožňuje vyhnúť sa obmedzeniam a rizikám spojeným s dodávaním genetického informačného materiálu priamo pacientovi prostredníctvom intravaskulárnych vektorových konštruktov. Podobná stratégia je použiteľná aj pre embryonálne kmeňové bunky, ale autológne postnatálne stromálne bunky kostnej drene sú výhodnejším materiálom, pretože ich zavedenie vylučuje možné imunologické komplikácie po transplantácii. Na dosiahnutie krátkodobého účinku, napríklad na urýchlenie regenerácie kostí, je najoptimálnejšou metódou genetická modifikácia mezenchymálnych kmeňových buniek pomocou elektroporácie, chemickej fúzie, lipofekcie, plazmidov a adenovírusových konštruktov. Najmä vírusová transfekcia do stromálnych buniek kostnej drene BMP-2 sa ukázala ako účinná pri urýchľovaní regenerácie kostí pri experimentálnej polytraume. Vytvorenie adenovírusových vektorových konštruktov je výhodnejšie kvôli absencii toxicity. Genetická modifikácia stromálnych buniek kostnej drene sa však v tomto prípade vyznačuje extrémne nízkou stabilitou. Okrem toho normálne transformované stromálne bunky kostnej drene vyžadujú použitie vektorových nosičov genetickej informácie, ktoré sú 10-krát infekčnejšie ako iné typy buniek, čo významne zvyšuje percento úmrtia transfekovaných buniek.

Liečba recesívnych ochorení spôsobených nízkou alebo nulovou biologickou aktivitou určitých génov vyžaduje dlhodobú alebo trvalú modifikáciu mezenchymálnych kmeňových buniek, čo si vyžaduje použitie adeno-asociovaných vírusov, retrovírusov, lentivírusov alebo adeno-retrovírusových chimér. Transportné oblasti týchto vírusov sú schopné prenášať veľké DNA transfekty (až do 8 kb). Vedecká literatúra už informovala o exogénnej biologickej aktivite stromálnych buniek kostnej drene transfekovaných retrovírusovými konštruktmi kódujúcimi syntézu regulačných a markerových molekúl - IL-3, CD2, faktora VIII, ako aj enzýmov zapojených do syntézy L-DOPA. Avšak aj v týchto štúdiách autori poukazujú na množstvo obmedzení, ktoré je potrebné prekonať pred praktickým použitím tejto technológie. Prvým problémom je optimalizácia procesu modifikácie MSC ex vivo. Je známe, že dlhodobá (3-4 týždne) proliferácia stromálnych buniek kostnej drene in vitro znižuje ich transfekciu. Zároveň je na dosiahnutie vysokej úrovne genetickej modifikácie MSC potrebné vykonať niekoľko transfekčných cyklov. Druhý problém súvisí s trvaním terapeutickej génovej expresie, ktorá zatiaľ nepresahuje štyri mesiace. Prirodzený pokles efektívnej génovej expresie je spôsobený inaktiváciou promótora a smrťou modifikovaných buniek. Vzhľadom na všeobecné vyhliadky prenosu genetickej informácie pomocou mezenchymálnych kmeňových buniek výsledky predbežných štúdií naznačujú potrebu ďalšej optimalizácie metód ex vivo transfekcie, výberu adekvátneho promótora regulujúceho biologickú aktivitu v požadovanom smere a zvýšenie schopnosti modifikovaných stromálnych buniek kostnej drene k samoudržiavaniu in vivo po transplantácii. Treba poznamenať, že použitie retrovírusových konštruktov na modifikáciu stromálnych buniek kostnej drene v požadovanom smere si nie vždy vyžaduje ich povinné uchytenie. Transfekované mezenchymálne kmeňové bunky môžu vykonávať korekčnú funkciu na pozadí stabilnej rezidencie a bez povinného aktívneho fyzického začlenenia a fungovania v spojivovom tkanive. V tomto prípade by sa mali považovať za biologickú mini-pumpu produkujúcu in vivo faktor, ktorého nedostatok určuje prejavy genetickej patológie.

Použitie transformovaných stromálnych buniek kostnej drene na liečbu dominantnej genetickej patológie, ktorá sa vyznačuje expresiou génu s patologickou alebo abnormálnou biologickou aktivitou, je oveľa problematickejšie, pretože v tomto prípade je potrebné blokovať prenos alebo implementáciu skreslenej genetickej informácie. Jednou z metód genetického inžinierstva je homológna rekombinácia embryonálnych kmeňových buniek za účelom vytvorenia transgénnych zvierat. Extrémne nízky stupeň homológnej rekombinácie v kombinácii s problémami identifikácie, separácie a expanzie takýchto rekombinantov však pravdepodobne neprispeje k širokému použitiu tejto metódy v blízkej budúcnosti, a to ani v prípade vývoja nových technologických metód. Druhý prístup v génovej terapii dominantnej patológie je založený na automatickej korekcii poškodenej DNA, pretože genetické mutácie je možné korigovať zavedením exogénnej DNA s požadovanou sekvenciou (krátke DNA oligonukleotidy alebo chimérické RNA/DNA oligonukleotidy), ktorá sa viaže na homológy v poškodenom genóme. Tretia možnosť zahŕňa blokovanie prenosu patologickej informácie, čo sa dosahuje použitím špecificky navrhnutých oligonukleotidov, ktoré sa viažu na špecifický gén a vytvárajú ternárnu helikálnu štruktúru, ktorá eliminuje možnosť transkripcie.

Hoci korekcia genetického ochorenia na úrovni genómu zostáva najoptimálnejšou a najpreferovanejšou terapeutickou metódou, mRNA je tiež sľubným vektorom (možno ešte dostupnejším) na blokovanie dominantne negatívneho génu. Molekuly proteínov s antisense oligonukleotidom alebo kompletnými sekvenciami, ktoré blokujú väzbu mRNA na bunkový biosyntetický aparát, sa už dlho používajú na inhibíciu translácie a/alebo zvýšenie degradácie mRNA. Okrem toho dvojvláknová RNA indukuje rýchlu degradáciu mRNA, ktorej mechanizmus zostáva nejasný. Je však nepravdepodobné, že samotná eliminácia mRNA transkribovaných z mutantnej alely s krátkymi alebo jednoduchými mutáciami podporí expresiu mRNA normálnej alely. Alternatívou je použitie kladivkových a vlásenkových ribosyntéz, ktoré majú schopnosť viazať sa na vysoko špecifické oblasti mRNA s následnou indukciou ich štiepenia a inaktivácie počas translácie. Možnosť použitia tejto metódy v terapii patologickej osteogenézy sa v súčasnosti skúma. Bez ohľadu na to, čo je presne cieľom – genomické alebo cytoplazmatické prvky, úspech nových technológií génovej terapie bude určený účinnosťou začlenenia činidiel do stromálnych buniek kostnej drene ex vivo, optimálnym výberom špecifického vektora a stabilnou schopnosťou mezenchymálnych kmeňových buniek exprimovať potrebné faktory in vivo.

Objav mezenchymálnych kmeňových buniek s ich neočakávanými vlastnosťami teda vytvára novú koncepčnú schému pre vývoj bunkových línií. Na pochopenie biologickej úlohy stromálnych kmeňových buniek, ich povahy, ich schopnosti transdiferenciácie alebo dediferenciácie, ich fyziologického významu počas embryonálneho vývoja, postnatálneho rastu, dozrievania a starnutia, ako aj pri ľudských ochoreniach je však potrebný ďalší interdisciplinárny výskum.