Nervové kmeňové bunky

Experimentálne dôkazy o možnosti regenerácie buniek CNS boli získané oveľa skôr ako objav embryonálnych kmeňových buniek v štúdiách, ktoré preukázali prítomnosť buniek v neokortexe, hipokampe a čuchových bulboch mozgu dospelých potkanov, ktoré zachytávajú 3H-tymidín, t. j. sú schopné syntézy a delenia bielkovín. Ešte v 60. rokoch minulého storočia sa predpokladalo, že tieto bunky sú prekurzormi neurónov a priamo sa podieľajú na procesoch učenia a pamäte. O niečo neskôr sa odhalila prítomnosť synapsií na neurónoch vytvorených de novo a objavili sa prvé práce o využití embryonálnych kmeňových buniek na účely indukcie neurogenézy in vitro. Koncom 20. storočia experimenty s riadenou diferenciáciou embryonálnych kmeňových buniek (ESC) na nervové progenitorové bunky, dopaminergné a serotonergné neuróny viedli k revízii klasických predstáv o schopnosti regenerácie nervových buniek cicavcov. Výsledky mnohých štúdií presvedčivo dokázali realitu reštrukturalizácie neurónových sietí a prítomnosť neurogenézy počas celého obdobia postnatálneho života cicavčieho organizmu.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Zdroje nervových kmeňových buniek

Ľudské nervové kmeňové bunky sa izolujú počas operácií na subventrikulárnej oblasti laterálnych komôr a gyrus dentatus hipokampu, ktorých bunky v kultúre tvoria neurosféry (neurálne gule) a po disperzii a preformácii týchto - všetky hlavné typy buniek centrálneho nervového systému alebo v špeciálnom médiu nové mikrosféry. V suspenzných kultúrach disociovaného tkaniva izolovaného z periventrikulárnych oblastí embryonálneho mozgu vznikajú aj neurosféry.

Medzi markery nezrelých mozgových buniek patrí nestín, beta-tubulín III (marker neuronálnej línie), vimentín, GFAP a NCAM, ktoré sa identifikujú imunocytochemicky pomocou monoklonálnych protilátok. Nestín (intermediárny neurofilamentový proteín typu IV) je exprimovaný multipotentnými neuroektodermálnymi bunkami. Tento proteín sa používa na identifikáciu a izoláciu multipotentných neuroepiteliálnych progenitorových buniek z CNS pomocou monoklonálnych protilátok Rat-401, ktoré dokážu detegovať až 95 % buniek neurálnej trubice u embryí potkanov v jedenásty deň tehotenstva. Nestín nie je exprimovaný na diferencovaných potomkoch nervových kmeňových buniek, ale je prítomný v skorých nervových progenitorových bunkách, postmitotických neurónoch a skorých neuroblastoch. Tento marker sa používa na identifikáciu neuroepiteliálnych progenitorových buniek a na preukázanie existencie kmeňových buniek v CNS. Vimentín (intermediárny neurofilamentový proteín typu III) je exprimovaný nervovými a gliovými progenitorovými bunkami, ako aj neurónmi, fibroblastmi a bunkami hladkého svalstva. Preto oba imunocytochemické markery nemajú špecificitu potrebnú na samostatnú identifikáciu nervových kmeňových a progenitorových buniek. Beta-tubulín III určuje neuronálny smer diferenciácie kmeňových buniek, zatiaľ čo astrocyty typu I sú identifikované expresiou GFAP a oligodendrocyty špecificky exprimujú galaktocerebrozid (Ga!C).

FGF2 a EGF slúžia ako mitogény pre nervové progenitorové bunky a podporujú proliferáciu nediferencovaných progenitorových buniek v kultúre s tvorbou neurosfér. Rýchlosť delenia nervových kmeňových buniek sa významne zvyšuje pod vplyvom FGF2, ako aj pri použití kombinácie FGF2 + EGF. Proliferačné účinky FGF2 sú sprostredkované receptormi FGF2-R1. Heparín zvyšuje afinitu väzby receptora FGF2 a dramaticky zvyšuje jeho mitogénny účinok na neuroepiteliálne bunky. V skorých štádiách embryogenézy sú receptory FGF2 exprimované v telencefalone potkanov, zatiaľ čo v neskorších štádiách je ich lokalizácia obmedzená na ventrikulárnu zónu. Vrchol expresie FGF2-R1 postmitotickými bunkami sa pozoruje po ukončení obdobia skorej neurogenézy. Počiatočné obdobie vývoja telencefalonu sa vyznačuje nízkou úrovňou expresie receptora EGF, najmä v bunkách ventrálnej oblasti. V neskorších štádiách embryogenézy sa expresia EGF-R zvyšuje v dorzálnom smere. V mozgu hlodavcov má EGF vysokú afinitu k receptoru transformujúceho rastového faktora beta (TGF-beta-R), na ktorý sa prednostne viaže. Nepriamy dôkaz o funkčnej úlohe EGF-R poskytujú údaje o kortikálnej dysgenéze predného mozgu, ktorá sa vyskytuje v neskorom období embryogenézy a postnatálnej ontogenézy, zníženej funkcii predného mozgu, kortikálnej bunkovej smrti a hipokampálnej ektopii u myší s knockoutom génu receptora EGF. Okrem toho je prítomnosť TGF-a v živnom médiu absolútne nevyhnutná pre tvorbu neurosfér. Po odstránení rastových faktorov z podmieneného média sa bunky prestanú deliť a podliehajú spontánnej diferenciácii s tvorbou neurónov, astrocytov a oligodendroblastov.

Vzhľadom na to sa reagregácia disociovaných kmeňových buniek a kultivácia neurosfér vykonávajú v živných médiách obsahujúcich EGF a bázický FGF alebo FGF2, ale bez pridania séra. Ukázalo sa, že EGF indukuje proliferáciu kmeňových buniek subependymálnej zóny laterálnych komôr a bázický FGF podporuje proliferáciu kmeňových buniek striata, hipokampu, neokortexu a zrakového nervu zrelého mozgu. Kombinácia EGF a bázického FGF je absolútne nevyhnutná pre aktívnu proliferáciu kmeňových buniek izolovaných z ependymu tretej a štvrtej komory predného mozgu, ako aj z miechového kanála hrudnej a bedrovej miechy.

Po disociácii sa suspenzia nervových kmeňových buniek kultivuje v plastových miskách alebo viacjamkových platniach bez adhezívneho substrátu, aby sa zväčšila veľkosť nových vytvorených neurosfér, čo zvyčajne trvá približne 3 týždne. Metóda viacnásobnej disperzie a reprodukcie neurosfér umožňuje získať dostatočný počet lineárnych klonov multipotentných kmeňových buniek pre intracerebrálnu transplantáciu. Tento princíp je tiež základom pre vytvorenie banky kmeňových buniek izolovaných z ľudského embryonálneho mozgu. Ich dlhodobé (počas niekoľkých rokov) klonovanie umožňuje získať stabilné línie nervových kmeňových buniek, z ktorých sa počas indukovanej diferenciácie tvoria katecholaminergné neuróny.

Ak sa neurosféry nedispergujú a nepestujú na adhezívnych substrátoch v médiu bez rastových faktorov, proliferujúce kmeňové bunky sa začnú spontánne diferencovať a tvoria neuronálne a gliové prekurzorové bunky exprimujúce markery všetkých typov nervových buniek: MAP2, Tau-1, NSE, NeuN, beta-tubulín III (neuróny), GFAP (astrocyty) a CalC, 04 (oligodendrocyty). Na rozdiel od myších a potkaních buniek tvoria neuróny viac ako 40 % všetkých diferencovaných buniek v kultúrach ľudských nervových kmeňových buniek (od 1 do 5 % u hlodavcov), ale tvorí sa výrazne menej oligodendrocytov, čo je veľmi dôležité z hľadiska bunkovej terapie demyelinizačných ochorení. Problém sa rieši pridaním kultivačného média B104, ktoré stimuluje tvorbu buniek produkujúcich myelín.

Pri kultivácii nervových progenitorových buniek z mozgu ľudských embryí v médiu obsahujúcom EGF, bázický FGF a LIF sa počet prekurzorových buniek nervovej línie zvyšuje 10 miliónovkrát. Bunky expandované in vitro si po transplantácii do mozgu dospelých potkanov zachovávajú schopnosť migrovať a diferencovať sa na nervové a gliové elementy. In vivo je však počet delení multipotentných prekurzorových buniek obmedzený. Opakovane sa uvádza, že Hayflickov limit pre „dospelé“ nervové kmeňové bunky (približne 50 mitóz) je stále nedosiahnuteľný ani v experimente – bunky vo forme neurosfér si zachovávajú svoje vlastnosti iba 7 mesiacov a až po 8 pasážach. Predpokladá sa, že je to spôsobené zvláštnosťami ich disperzných metód počas pasážovania (trypsinizácia alebo mechanické pôsobenie), ktoré výrazne znižujú proliferačnú aktivitu buniek v dôsledku narušenia medzibunkových kontaktov. Ak sa namiesto disperzie použije metóda delenia neurosfér na 4 časti, životaschopnosť buniek počas pasážovania sa výrazne zvyšuje. Táto metóda umožňuje kultivovať ľudské nervové kmeňové bunky 300 dní. Po tomto období však bunky strácajú mitotickú aktivitu a podliehajú degenerácii alebo vstupujú do štádia spontánnej diferenciácie s tvorbou neurónov a astrocytov. Na tomto základe sa autor domnieva, že 30 mitóz je maximálny počet delení pre kultivované nervové kmeňové bunky.

Keď sa ľudské nervové kmeňové bunky kultivujú in vitro, tvoria sa prevažne GABAergné neuróny. Bez špeciálnych podmienok nervové progenitorové bunky dávajú vznik dopaminergným neurónom (nevyhnutným pre bunkovú terapiu Parkinsonovej choroby) iba v prvých pasážach, po ktorých všetky neuróny v kultúre pozostávajú výlučne z GABAergných buniek. U hlodavcov IL-1 a IL-11, ako aj fragmenty membrán nervových buniek, LIF a GDNF, spôsobujú indukciu dopaminergných neurónov in vitro. Tento metodologický prístup sa však u ľudí ukázal ako neúspešný. Napriek tomu, keď sa GABAergné neuróny transplantujú intracerebrálne in vivo, pod vplyvom faktorov mikroprostredia vznikajú nervové bunky s rôznymi fenotypmi mediátorov.

Hľadanie kombinácií neurotrofických faktorov ukázalo, že FGF2 a IL-1 indukujú tvorbu dopaminergných neuroblastov, ktoré však nie sú schopné produkovať dopaminergné neuróny. Diferenciácia hipokampálnych kmeňových buniek na excitačné glutamatergné a inhibičné GABA-ergné neuróny prebieha pod vplyvom neurotrofínov a EGF a IGF1 indukujú tvorbu glutamatergných a GABA-ergných neurónov z nervových progenitorových buniek ľudských embryí. Postupné pridanie kyseliny retínovej a neurotrofínu 3 (NT3) do kultúry významne zvyšuje diferenciáciu zrelých mozgových hipokampálnych kmeňových buniek na neuróny rôznej mediátorovej povahy, zatiaľ čo kombinácia mozgového neurotrofického faktora (BNDF), NT3 a GDNF môže produkovať pyramídové neuróny v hipokampálnych a neokortikálnych kultúrach.

Výsledky početných štúdií teda naznačujú, že po prvé, kmeňové bunky z rôznych mozgových štruktúr sú pod vplyvom lokálnych špecifických tkanivových faktorov schopné diferenciácie in vivo na neuronálne fenotypy vlastné týmto štruktúram. Po druhé, cielená indukovaná diferenciácia nervových kmeňových buniek in vitro pomocou klonovania progenitorových buniek umožňuje získať nervové a gliové bunky so špecifickými fenotypovými charakteristikami pre intracerebrálnu transplantáciu pri rôznych formách mozgovej patológie.

Niet pochýb o tom, že pluripotentné kmeňové bunky izolované z embryí alebo dospelého CNS možno považovať za zdroj nových neurónov a použiť v klinickej praxi na liečbu neurologickej patológie. Hlavnou prekážkou rozvoja praktickej bunkovej neurotransplantácie je však skutočnosť, že väčšina nervových kmeňových buniek sa po implantácii do ne-neurogénnych zón zrelého CNS nediferencuje na neuróny. Na obídenie tejto prekážky sa navrhuje veľmi originálna inovatívna metóda, ktorá umožňuje in vitro získať čistú populáciu neurónov z ľudských fetálnych nervových kmeňových buniek po transplantácii do CNS dospelého potkana. Autori dokazujú, že diferenciácia buniek implantovaných touto metódou končí tvorbou neurónov cholinergného fenotypu, čo je spôsobené vplyvom faktorov okolitého mikroprostredia. Navrhovaná technológia je zaujímavá z hľadiska vývoja nových typov terapie založenej na kmeňových bunkách a nahradenia neurónov poškodených v dôsledku poranenia alebo neurodegeneratívneho ochorenia, pretože cholinergné neuróny zohrávajú vedúcu úlohu vo vývoji motorických, pamäťových a učebných funkcií. Cholinergné neuróny izolované z ľudských kmeňových buniek sa môžu použiť najmä na nahradenie motorických neurónov stratených pri amyotrofickej laterálnej skleróze alebo poraneniach miechy. V súčasnosti neexistujú žiadne informácie o metódach na produkciu významného počtu cholinergných neurónov z populácie mitogénom preformovaných kmeňových buniek. Autori navrhujú pomerne jednoduchú, ale účinnú metódu na stimuláciu mitogénom preformovaných primárnych ľudských embryonálnych nervových kmeňových buniek k vývoju na prakticky čisté neuróny po implantácii do neurogénnych aj neurogénnych zón CNS dospelého potkana. Najdôležitejším výsledkom ich práce je premena dostatočne veľkého počtu transplantovaných buniek na cholinergné neuróny po implantácii do strednej membrány a miechy.

Okrem toho sa na preformáciu nervových kmeňových buniek z 8-týždňovej ľudskej embryonálnej mozgovej kôry na cholinergné neuróny in vitro navrhuje použiť rôzne kombinácie nasledujúcich trofických faktorov a chemických prvkov: rekombinantný bázický FGF, EGF, LIF, myší amino-terminálny zdravý peptid (Shh-N), kyselina trans-retínová, NGF, BDNF, NT3, NT4, prírodný laminín a myší heparín. Pôvodná línia ľudských nervových kmeňových buniek (K048) bola udržiavaná in vitro dva roky a odolala 85 pasážam bez zmien v proliferačných a diferenciačných vlastnostiach pri zachovaní normálneho diploidného karyotypu. Nedispergované neurosféry z pasáží 19–55 (týždne 38–52) boli nanesené na poly-d-lyzín a laminín a potom ošetrené vyššie uvedenými faktormi v rôznych koncentráciách, kombináciách a sekvenciách. Kombinácia bázického FGF, heparínu a laminínu (skrátene FHL) poskytla jedinečný účinok. Po jednom dni kultivácie embryonálnych nervových kmeňových buniek v médiu FHL s alebo bez Shh-N (kombinácia Shh-N + FHL v skratke SFHL) sa pozorovala rýchla proliferácia veľkých planárnych buniek. Všetky ostatné jednodňové protokoly (ako napríklad základný FGF + laminín) naopak viedli k obmedzenému radiálnemu šíreniu vretenovito tvarovaných buniek a tieto bunky neopúšťali jadro neurosfér. Po 6 dňoch aktivácie a následných 10 dňoch diferenciácie v médiu obsahujúcom B27 sa na okraji sfér aktivovaných FHL detegovali veľké multipolárne bunky podobné neurónom. V iných skupinách protokolov zostala väčšina buniek podobných neurónom malá a bipolárna alebo unipolárna. Imunocytochemická analýza ukázala, že malé (< 20 μm) bipolárne alebo unipolárne bunky boli buď GABAergné, alebo glutamatergné, zatiaľ čo väčšina veľkých multipolárnych buniek lokalizovaných na okraji neurosfér aktivovaných FHL bola cholinergná a exprimovala markery charakteristické pre cholinergné neuróny (Islet-1 a ChAT). Niektoré z týchto neurónov súčasne exprimovali synapsín 1. V dôsledku piatich sérií nezávislých experimentov autori zistili, že celková populácia buniek v jednovrstvových zónach sa diferencovala na neuróny TuJ1+ o 45,5 %, zatiaľ čo cholinergné (ChAT^) neuróny tvorili iba 27,8 % buniek tej istej populácie. Po 10 dňoch dodatočnej diferenciácie in vitro sa v neurosférach aktivovaných FHL okrem cholinergných neurónov našiel aj významný počet malých neurónov - glutamatergných (6,3 %), GABA-ergných (11,3 %), ako aj astrocytov (35,2 %) a nestín-pozitívnych buniek (18,9 %). Pri použití iných kombinácií rastových faktorov chýbali cholinergné neuróny a okrajové bunky neurosfér tvorili buď astrocyty, alebo malé glutamatergné a GABA-ergné neuróny. Monitorovanie rezervných a aktívnych potenciálov pomocou techniky patch clamp pre celé bunky ukázalo, že po siedmich dňoch aktivácie FHL mala väčšina veľkých polypolárnych buniek pokojový potenciál -29,0 ± 2,0 mV bez akčného potenciálu. Po 2 týždňoch sa pokojový potenciál zvýšil na -63.6 ± 3,0 mV a akčné potenciály boli pozorované v momente indukcie depolarizačných prúdov a boli blokované 1 M tetrodotoxínom, čo naznačuje funkčnú aktivitu cholinergných nezrelých neurónov.

Autori ďalej zistili, že aktivácia FHL alebo SFHL in vitro sama o sebe nevedie k tvorbe zrelých neurónov a pokúsili sa zistiť, či sú kmeňové bunky preformované FHL alebo SFHL schopné diferenciácie na cholinergné neuróny po transplantácii do CNS dospelých potkanov. Na tento účel boli aktivované bunky injektované do neurogénnej zóny (hipokampu) a do niekoľkých ne-neurogénnych zón vrátane prefrontálneho kortexu, strednej membrány a miechy dospelých potkanov. Implantované bunky boli sledované pomocou vektora CAO-^^p. Je známe, že OCP bez úniku označuje bunkovú ultraštruktúru aj bunkové procesy (molekulárna úroveň) a možno ich priamo vizualizovať. Okrem toho si nervové kmeňové bunky značené OCP zachovávajú profil neuronálnej a gliovej diferenciácie identický s profilom netransformovaných kmeňových buniek embryonálneho mozgu.

Jeden až dva týždne po implantácii 5 x 104 ^{aktivovaných} a značených nervových kmeňových buniek sa tieto našli v mieche alebo mozgu potkanov, pričom OCD+ bunky sa nachádzali prevažne v blízkosti miesta vpichu. Migračné a integračné procesy sa pozorovali už mesiac po transplantácii. Limity migrácie sa líšili v závislosti od miesta vpichu: pri injekcii do prefrontálneho kortexu sa OCD+ bunky nachádzali 0,4 – 2 mm od miesta vpichu, zatiaľ čo v prípade implantácie do strednej membrány, hipokampu alebo miechy migrovali bunky na oveľa väčšie vzdialenosti – až 1 – 2 cm. Transplantované bunky boli lokalizované vo vysoko organizovaných štruktúrach CNS, vrátane frontálneho kortexu, strednej membrány, hipokampu a miechy. OCD-značené neurónové elementy boli viditeľné už v prvom týždni po transplantácii, pričom ich počet sa významne zvýšil mesiac po operácii. Stereologická analýza ukázala vyššiu mieru prežitia implantovaných buniek v rôznych štruktúrach mozgu v porovnaní s miechou.

Je známe, že vo väčšine tkanív dospelého cicavčieho organizmu je zachovaná populácia regionálnych kmeňových buniek, ktorých transformácia na zrelé bunky je regulovaná špecifickými tkanivovými faktormi. Proliferácia kmeňových buniek, diferenciácia progenitorových buniek a tvorba neuronálnych fenotypov špecifických pre danú mozgovú štruktúru in vivo sa v oveľa väčšej miere prejavujú v embryonálnom mozgu, čo je určené prítomnosťou vysokých koncentrácií morfogenetických faktorov lokálneho mikroprostredia - neurotrofínov BDNF, NGF, NT3, NT4/5 a rastových faktorov FGF2, TGF-a, IGF1, GNDF, PDGF.

Kde sa nachádzajú nervové kmeňové bunky?

Bolo zistené, že nervové kmeňové bunky exprimujú gliový kyslý fibrilárny proteín, ktorý sa medzi zrelými bunkami nervovej línie zachováva iba na astrocytoch. Astrocytové bunky preto môžu byť rezervou kmeňa v zrelej CNS. V skutočnosti boli v čuchových cibuľkách a gyrus dentatus identifikované neuróny pochádzajúce z GFAP-pozitívnych prekurzorov, čo je v rozpore s tradičnými predstavami o progenitorovej úlohe radiálnej glie, ktorá v dospelosti v gyrus dentatus neexprimuje GFAP. Je možné, že v CNS existujú dve populácie kmeňových buniek.

Otázka lokalizácie kmeňových buniek v subventrikulárnej zóne tiež zostáva nejasná. Podľa niektorých autorov ependymálne bunky v kultúre tvoria sférické klony, ktoré nie sú skutočnými neurosférami (ako klony subependymálnych buniek), pretože sú schopné diferenciácie iba na astrocyty. Na druhej strane, po fluorescenčnom alebo vírusovom značení ependymálnych buniek sa marker deteguje v bunkách subependymálnej vrstvy a čuchových cibuliek. Takto značené bunky in vitro tvoria neurosféry a diferencujú sa na neuróny, astrocyty a oligodendrocyty. Okrem toho sa ukázalo, že približne 5 % buniek v ependyme exprimuje kmeňové markery - nestín, Notch-1 a Mussashi-1. Predpokladá sa, že mechanizmus asymetrickej mitózy je spojený s nerovnomerným rozložením membránového receptora Notch-1, v dôsledku čoho tento zostáva na membráne dcérskej bunky lokalizovanej v ependymálnej zóne, zatiaľ čo materská bunka migrujúca do subependymálnej vrstvy je o tento receptor zbavená. Z tohto hľadiska možno subependymálnu zónu považovať za zberač progenitorových prekurzorov neurónov a glií vytvorených z kmeňových buniek ependymálnej vrstvy. Podľa iných autorov sa v kaudálnych častiach subventrikulárnej zóny tvoria iba gliové bunky a zdrojom neurogenézy sú bunky rostrálne-laterálnej časti. V treťom variante majú predné a zadné časti subventrikulárnej zóny laterálnych komôr ekvivalentný neurogénny potenciál.

Štvrtý variant organizácie kmeňovej rezervy v centrálnom nervovom systéme sa javí ako výhodnejší, podľa ktorého sa v subventrikulárnej zóne rozlišujú tri hlavné typy neurálnych progenitorových buniek - A, B a C. A-bunky exprimujú skoré neuronálne markery (PSA-NCAM, TuJl) a sú obklopené B-bunkami, ktoré sú identifikované ako astrocyty expresiou antigénov. C-bunky, ktoré nemajú antigénne vlastnosti neurónov alebo glie, majú vysokú proliferačnú aktivitu. Autor presvedčivo dokázal, že B-bunky sú prekurzormi A-buniek a de novo neurónov čuchových cibúľ. Počas migrácie sú A-bunky obklopené vláknami neurálnych progenitorových buniek, čo sa výrazne líši od migračného mechanizmu postmitotických neuroblastov pozdĺž radiálnej glie v embryonálnom mozgu. Migrácia končí v čuchových cibúľoch mitotickým delením A aj B buniek, ktorých deriváty sú začlenené do vrstiev granulárnych buniek a do glomerulárnej vrstvy čuchovej zóny mozgu.

Vyvíjajúci sa embryonálny mozog nemá diferencované ependymálne bunky a steny komôr obsahujú proliferujúce kmeňové bunky germinálnej a subventrikulárnej zóny komôr, kde migrujú primárne neuro- a glioblasty. Na základe toho sa niektorí autori domnievajú, že subependymálna oblasť zrelého mozgu obsahuje redukované embryonálne germinálne nervové tkanivo pozostávajúce z astrocytov, neuroblastov a neidentifikovaných buniek. Pravé nervové kmeňové bunky tvoria menej ako 1 % buniek v germinálnej zóne laterálnej steny komôr. Čiastočne z tohto dôvodu a tiež v súvislosti s údajmi, že astrocyty subependymálnej zóny sú prekurzormi nervových kmeňových buniek, nie je vylúčená možnosť transdiferenciácie astrocytových gliových elementov so získaním neuronálnych fenotypových charakteristík.

Hlavnou prekážkou konečného riešenia problému lokalizácie nervových kmeňových buniek in vivo je nedostatok špecifických markerov pre tieto bunky. Z praktického hľadiska sú však veľmi zaujímavé správy o izolácii nervových kmeňových buniek z oblastí CNS, ktoré neobsahujú subependymálne zóny - tretej a štvrtej komory predného mozgu, miechového kanála hrudnej a bedrovej oblasti miechy. Obzvlášť dôležitá je skutočnosť, že poranenie miechy zvyšuje proliferáciu ependymálnych kmeňových buniek centrálneho kanála s tvorbou progenitorových buniek migrujúcich a diferencujúcich sa na astrocyty gliomezodermálnej jazvy. Okrem toho sa v neporanenej mieche dospelých potkanov našli aj prekurzorové bunky astro- a oligodendrocytov.

Údaje z literatúry teda presvedčivo dokazujú prítomnosť regionálnej kmeňovej rezervy v CNS dospelých cicavcov vrátane človeka, ktorej regeneračno-plastická kapacita je, žiaľ, schopná zabezpečiť iba procesy fyziologickej regenerácie s tvorbou nových neurónových sietí, ale nespĺňa potreby reparatívnej regenerácie. To predstavuje úlohu hľadania možností na zvýšenie kmeňových zdrojov CNS exogénnymi prostriedkami, čo je neriešiteľné bez jasného pochopenia mechanizmov formovania CNS v embryonálnom období.

Dnes vieme, že počas embryonálneho vývoja sú kmeňové bunky neurálnej trubice zdrojom troch typov buniek - neurónov, astrocytov a oligodendrocytov, t. j. neuróny a neuroglie pochádzajú z jednej prekurzorovej bunky. Diferenciácia ektodermu do zhlukov neurálnych progenitorových buniek začína pod vplyvom produktov proneurálnych génov rodiny bHLH a je blokovaná expresiou derivátov receptorových transmembránových proteínov génov rodiny Notch, ktoré obmedzujú determináciu a skorú diferenciáciu neurálnych prekurzorových buniek. Ligandmi receptorov Notch sú zase transmembránové delta proteíny susedných buniek, vďaka ktorých extracelulárnej doméne dochádza k priamym medzibunkovým kontaktom s indukčnou interakciou medzi kmeňovými bunkami.

Ďalšia implementácia programu embryonálnej neurogenézy nie je o nič menej zložitá a zdá sa, že by mala byť druhovo špecifická. Výsledky štúdií neuroxenotransplantácie však naznačujú, že kmeňové bunky majú výrazný evolučný konzervativizmus, vďaka ktorému sú ľudské nervové kmeňové bunky schopné migrovať a vyvíjať sa po transplantácii do mozgu potkana.

Je známe, že CNS cicavcov má extrémne nízku kapacitu reparatívnej regenerácie, ktorá sa vyznačuje absenciou akýchkoľvek známok vzniku nových bunkových elementov v zrelom mozgu, ktoré by nahradili neuróny odumreté v dôsledku poranenia. V prípade transplantácie neuroblastov sa však tieto nielen uchytia, proliferujú a diferencujú, ale sú tiež schopné integrovať sa do mozgových štruktúr a funkčne nahradiť stratené neuróny. Pri transplantácii viazaných neuronálnych progenitorových buniek bol terapeutický účinok výrazne slabší. Ukázalo sa, že takéto bunky majú nízku kapacitu migrácie. Okrem toho neuronálne progenitorové bunky nereprodukujú architektúru neurónových sietí a nie sú funkčne integrované do mozgu príjemcu. V tejto súvislosti sa aktívne skúmajú otázky reparatívno-plastickej regenerácie počas transplantácie nepreformovaných multipotentných nervových kmeňových buniek.

V štúdii M. Aleksandrovej a kol. (2001) boli v prvej verzii experimentov príjemcami pohlavne zrelé samice potkanov a darcami 15-dňové embryá. Z príjemcov bola odobratá časť okcipitálnej kôry mozgu a do dutiny bolo transplantované mechanicky suspendované tkanivo predpokladanej embryonálnej kôry obsahujúce multipotentné kmeňové bunky ventrikulárnej a subventrikulárnej oblasti. V druhej verzii experimentov boli nervové kmeňové bunky 9-týždňového ľudského embrya transplantované do mozgu pohlavne zrelých potkanov. Autori izolovali kúsky tkaniva z periventrikulárnej oblasti embryonálneho mozgu, umiestnili ich do živného média F-12 a opakovaným pipetovaním získali bunkovú suspenziu a potom ich kultivovali v špeciálnom médiu NPBM s prídavkom rastových faktorov - FGF, EGF a NGF. Bunky boli pestované v suspenznej kultúre, kým sa nevytvorili neurosféry, ktoré boli dispergované a opäť zasadené do kultúry. Po 4 pasážach s celkovou kultivačnou dobou 12-16 dní boli bunky použité na transplantáciu. Príjemcami boli desaťdňové mláďatá potkanov a pohlavne dospelé dvojmesačné potkany Wistar, ktorým boli do laterálnej mozgovej komory bez imunosupresie injekčne podané 4 μl suspenzie ľudských nervových kmeňových buniek. Výsledky práce ukázali, že disociované bunky ventrikulárnej a subventrikulárnej zóny embryonálneho útvaru mozgovej kôry potkanov pokračovali vo svojom vývoji počas alotransplantácie do zrelého mozgu, t. j. faktory mikroprostredia diferencovaného mozgu príjemcu neblokovali rast a diferenciáciu nervových kmeňových buniek embrya. V skorých štádiách po transplantácii multipotentné bunky pokračovali v mitotickom delení a aktívne migrovali z transplantačnej oblasti do mozgového tkaniva príjemcu. Transplantované embryonálne bunky s obrovským migračným potenciálom sa nachádzali takmer vo všetkých vrstvách mozgovej kôry príjemcu pozdĺž transplantačnej dráhy a v bielej hmote. Dĺžka migračného traktu nervových buniek bola vždy výrazne kratšia (až do 680 μm) ako dĺžka migračného traktu gliových elementov (až do 3 mm). Krvné cievy a vláknité štruktúry mozgu slúžili ako štrukturálne vektory pre migráciu astrocytov, čo bolo zaznamenané aj v iných štúdiách.

Predtým sa predpokladalo, že akumulácia značených astrocytov v oblasti poškodenia mozgovej kôry príjemcu môže súvisieť s tvorbou gliovej bariéry medzi tkanivami transplantátu a príjemcu. Štúdia štruktúry kompaktne umiestnených bunkových transplantátov však ukázala, že ich cytoarchitektúra sa vyznačuje chaosom, bez vrstveného rozloženia transplantovaných buniek. Stupeň usporiadanosti transplantovaných neurónov sa priblížil k stupňu usporiadanosti normálnych buniek mozgovej kôry iba v neprítomnosti gliovej bariéry medzi tkanivami darcu a príjemcu. Inak bola štruktúra transplantovaných buniek atypická a samotné neuróny boli náchylné na hypertrofiu. Pomocou neuroimunochemickej typizácie transplantovaných buniek sa v transplantátoch našli inhibičné GABA-ergné neuróny a zistila sa expresia proteínov PARV, CALB a NPY. V dôsledku toho si zrelý mozog zachováva faktory mikroprostredia schopné podporovať proliferáciu, migráciu a špecifickú diferenciáciu nervových multipotentných buniek.

V kultúre ľudských kmeňových buniek izolovaných z periventrikulárnej oblasti mozgu 9-týždňových embryí M. Aleksandrova a kol. (2001) zistili vo štvrtej pasáži veľké množstvo nestín-pozitívnych multipotentných buniek, z ktorých niektoré už prešli in vitro diferenciáciou a vyvíjali sa podľa neuronálneho typu, čo zodpovedalo výsledkom štúdií iných autorov. Po transplantácii do mozgu dospelých potkanov sa kultivované ľudské kmeňové bunky mitoticky delili a migrovali do tkaniva xenogénneho mozgu príjemcu. V bunkových transplantátoch autori pozorovali dve populácie buniek - malé a väčšie. Tie migrovali v parenchýme aj pozdĺž vláknitých štruktúr mozgu príjemcu na nevýznamné vzdialenosti - do 300 μm. Najväčší rozsah migračnej dráhy (do 3 mm) bol charakteristický pre malé bunky, z ktorých niektoré sa diferencovali na astrocyty, čo bolo stanovené pomocou monoklonálnych protilátok proti GFAP. Oba typy buniek sa našli v stene laterálnej komory, čo naznačuje, že transplantované bunky vstúpili do rostrálneho migračného traktu. Astrocytické deriváty nervových kmeňových buniek z ľudí aj potkanov migrovali prevažne cez krvné kapiláry a vláknité štruktúry mozgu príjemcu, čo sa zhoduje s údajmi iných autorov.

Analýza diferenciácie ľudských kmeňových buniek in vivo s použitím monoklonálnych protilátok proti GFAP, CALB a VIM odhalila tvorbu astrocytov aj neurónov. Na rozdiel od buniek v transplantátoch potkanov bolo mnoho ľudských kmeňových buniek vimentín-pozitívnych. V dôsledku toho niektoré z ľudských multipotentných buniek neprešli diferenciáciou. Tí istí autori následne preukázali, že ľudské nervové kmeňové bunky transplantované bez imunosupresie prežívajú v mozgu potkana 20 dní po transplantácii bez známok imunitnej agresie zo strany gliových elementov zrelého mozgu.

Bolo zistené, že dokonca aj nervové kmeňové bunky Drosophily sa uchytia a diferencujú v mozgu taxónu tak vzdialeného od hmyzu, ako je potkan. Správnosť experimentu autorov je nepochybná: transgénne línie Drosophily obsahovali gény pre ľudské neurotrofické faktory NGF, GDNF, BDNF, vložené do vektora CaSper pod promótorom tepelného šoku Drosophily, takže telesná teplota cicavcov automaticky vyvolala ich expresiu. Autori identifikovali bunky Drosophily pomocou produktu bakteriálneho génu galaktozidázy pomocou histochemického farbenia X-Gal. Okrem toho sa ukázalo, že nervové kmeňové bunky Drosophily špecificky reagujú na neurotrofické faktory kódované ľudskými génmi: pri xenotransplantácii buniek transgénnej línie Drosophily obsahujúcej gén gdnf sa syntéza tyrozínhydroxylázy v jej diferencujúcich sa nervových kmeňových bunkách prudko zvýšila a bunky s génom ngf aktívne produkovali acetylcholínesterázu. Xenotransplantát indukoval podobné génovo závislé reakcie v alotransplantáte embryonálneho nervového tkaniva transplantovaného spolu s ním.

Znamená to, že špecifická diferenciácia nervových kmeňových buniek je indukovaná druhovo nešpecifickými neurotrofickými faktormi? Podľa výsledkov autorov mali neurotrofické faktory produkujúce xenografty špecifický vplyv na osud aloštepov, ktoré sa v tomto prípade vyvíjali intenzívnejšie a boli 2 až 3-krát väčšie ako aloštepy zavedené do mozgu bez pridania xenograftov. V dôsledku toho majú xenograftové bunky obsahujúce gény neurotrofínov, najmä gén kódujúci neurotrofický faktor odvodený z ľudských gliových buniek (GDNF), druhovo nešpecifický účinok na vývoj aloštepu podobný účinku zodpovedajúceho neurotrofínu. Je známe, že GDNF zvyšuje prežitie dopaminergných neurónov v embryonálnom strednom mozgu potkana a zvyšuje metabolizmus dopamínu týmito bunkami a indukuje diferenciáciu buniek pozitívnych na tyrozínhydroxylázu, čím zvyšuje rast axónov a zväčšuje veľkosť tela neuronálnej bunky. Podobné účinky sa pozorujú aj v kultivovaných dopaminergných neurónoch stredného mozgu potkana.

Po xenotransplantácii do mozgu dospelých potkanov sa pozoruje aktívna migrácia ľudských nervových kmeňových buniek. Je známe, že proces migrácie a diferenciácie nervových kmeňových buniek je riadený súborom špeciálnych génov. Iniciačný migračný signál prekurzorovej bunke na začatie diferenciácie je daný proteínovým produktom protoonkogénu c-ret spolu s GDNF. Ďalší signál pochádza z génu mash-1, ktorý riadi výber dráhy vývoja bunky. Okrem toho špecifická reakcia diferencujúcich sa buniek závisí aj od a-receptora ciliárneho neurotrofického faktora. Vzhľadom na úplne odlišnú genetickú konštitúciu xenogénnych ľudských nervových kmeňových buniek a mozgových buniek recipientného potkana je teda potrebné uznať nielen druhovú nešpecificitu neurotrofických faktorov, ale aj najvyšší evolučný konzervativizmus génov zodpovedných za špecifickú diferenciáciu elementov nervových kmeňov.

Budúcnosť ukáže, či bude xenotransplantácia embryonálneho neuromateriálu možná v neurochirurgickej praxi liečby neurodegeneratívnych patologických procesov spôsobených narušením syntézy myelínu oligodendrocytmi. Medzitým sú najintenzívnejšie riešenými otázkami neurotransplantácie tie, ktoré súvisia so získavaním alogénnych nervových kmeňových buniek z embryonálneho alebo zrelého mozgu v kultúre s ich následnou cielenou diferenciáciou na neuroblasty alebo špecializované neuróny.

Transplantácia nervových kmeňových buniek

Na stimuláciu proliferácie a diferenciácie nervových kmeňových buniek dospelého organizmu je možné transplantovať embryonálne nervové tkanivo. Je možné, že kmeňové bunky embryonálneho nervového tkaniva prinesené s alotransplantátom môžu samy podstúpiť proliferáciu a diferenciáciu. Je známe, že po poranení miechy dochádza k regenerácii nervových vodičov predĺžením poškodených axónov a kolaterálnym pučaním axónov nepoškodených výbežkov motorických neurónov. Hlavnými faktormi, ktoré bránia regenerácii miechy, sú tvorba jazvy spojivového tkaniva v oblasti poškodenia, dystrofické a degeneratívne zmeny v centrálnych neurónoch, deficit NGF a prítomnosť produktov rozpadu myelínu v oblasti poškodenia. Bolo preukázané, že transplantácia rôznych typov buniek do poškodenej miechy - fragmentov sedacieho nervu dospelých zvierat, embryonálnej okcipitálnej kôry, hipokampu, miechy, Schwannových buniek, astrocytov, mikroglií, makrofágov, fibroblastov - podporuje regeneráciu poškodených axónov pučaním a umožňuje novovytvoreným axónom prerastať cez zónu poranenia miechy. Experimentálne sa dokázalo, že transplantácia embryonálneho nervového tkaniva do oblasti poranenia miechy pôsobením neurotrofických faktorov urýchľuje rast poškodených axónov, zabraňuje tvorbe gliovej jazvy a rozvoju dystrofických a degeneratívnych procesov v centrálnych neurónoch, zatiaľ čo bunky transplantovaného embryonálneho nervového tkaniva prežívajú v mieche, integrujú sa so susednými tkanivami a podporujú rast axónov cez oblasť poranenia s tvorbou dendritických synapsií na spinálnych neurónoch.

Táto oblasť regeneratívno-plastickej medicíny zaznamenala na Ukrajine najväčší rozvoj vďaka práci vedeckého tímu pod vedením V. I. Tsymbalyuka. V prvom rade ide o experimentálne štúdie účinnosti transplantácie embryonálneho nervového tkaniva pri poraneniach miechy. Počas autotransplantácie periférneho nervu autori pozorovali najvýraznejšie deštruktívne zmeny v distálnej zóne švu, kde sa 30. deň po operácii spojili s reparačnými procesmi. Počas alotransplantácie bol morfofunkčný stav implantovaného nervu na 30. deň charakterizovaný výraznou deštrukciou s tukovou degeneráciou a amyloidózou na pozadí fokálnej zápalovej infiltrácie lymfoidných buniek s prevahou atrofie Schwannových buniek. Transplantácia embryonálneho nervového tkaniva prispela k obnoveniu vodivosti miechy vo väčšej miere, najmä u zvierat, ktoré podstúpili operáciu počas prvých 24 hodín po poranení: na pozadí zníženia intenzity zápalových a deštruktívnych procesov, hypertrofie a hyperplázie proteín syntetizujúcich a energeticky produkujúcich ultraštrukturálnych prvkov spinálnych neurónov sa pozorovala hypertrofia a hyperplázia oligodendrocytov, amplitúda svalového akčného potenciálu sa obnovila o 50 % a rýchlosť vedenia impulzu o 90 %. Pri hodnotení účinnosti transplantácie embryonálneho nervového tkaniva v závislosti od transplantačnej zóny sa zistilo, že najlepšie výsledky sa pozorovali pri priamom zavedení štepu do zóny poranenia miechy. Pri úplnej transekcii miechy bola transplantácia embryonálneho nervového tkaniva neúčinná. Dynamické štúdie ukázali, že optimálny čas na vykonanie transplantácie embryonálneho nervového tkaniva je prvých 24 hodín po poranení miechy, zatiaľ čo vykonanie operácie počas obdobia výrazných sekundárnych ischemicko-zápalových zmien, ktoré sa vyskytujú 2. až 9. deň po poranení, by sa malo považovať za nevhodné.

Je známe, že ťažké traumatické poranenie mozgu vyvoláva silnú a dlhotrvajúcu aktiváciu lipidovej peroxidácie v počiatočných a stredných štádiách posttraumatického obdobia, a to ako v poškodenom mozgovom tkanive, tak aj v tele ako celku, a tiež narúša procesy energetického metabolizmu v poranenom mozgu. Za týchto podmienok transplantácia embryonálneho nervového tkaniva do oblasti traumatického poranenia podporuje stabilizáciu procesov lipidovej peroxidácie a zvyšuje potenciál antioxidačného systému mozgu a tela ako celku, posilňuje jeho antiradikálovú ochranu v 35. – 60. deň posttraumatického obdobia. V rovnakom období po transplantácii embryonálneho nervového tkaniva sa normalizuje energetický metabolizmus a procesy oxidačnej fosforylácie v mozgu. Okrem toho sa ukázalo, že v prvý deň po experimentálnom traumatickom poranení mozgu sa impedancia tkaniva poranenej hemisféry znižuje o 30 – 37 %, kontralaterálnej hemisféry o 20 %, čo naznačuje rozvoj generalizovaného mozgového edému. U zvierat, ktoré podstúpili transplantáciu embryonálneho nervového tkaniva, došlo k involúcii edému výrazne rýchlejšie - už na siedmy deň dosiahla priemerná hodnota impedancie tkanív poranenej hemisféry 97,8 % kontrolnej úrovne. Navyše, úplné obnovenie hodnôt impedancie na 30. deň bolo zaznamenané iba u zvierat, ktoré podstúpili transplantáciu embryonálneho nervového tkaniva.

Odumieranie niektorých neurónov v mozgu po ťažkom kraniocerebrálnom poranení je jednou z hlavných príčin posttraumatických komplikácií. Neuróny integrujúceho sa dopaminergného a noradrenergného systému stredného mozgu a predĺženej miechy sú obzvlášť citlivé na poranenie. Pokles hladiny dopamínu v striopallidálnom komplexe a mozgovej kôre významne zvyšuje riziko vzniku motorických a duševných porúch, epileptiformných stavov a zníženie produkcie dopamínu v hypotalame môže byť príčinou mnohých vegetatívnych a somatických porúch pozorovaných v neskorom posttraumatickom období. Výsledky štúdií vykonaných pri experimentálnom kraniocerebrálnom poranení naznačujú, že transplantácia embryonálneho nervového tkaniva pomáha obnoviť hladiny dopamínu v poranenej mozgovej hemisfére, dopamínu a norepinefrínu v hypotalame a zvýšiť hladiny norepinefrínu a dopamínu v strednom mozgu a predĺženej mieche. Okrem toho, v dôsledku transplantácie embryonálneho nervového tkaniva do poranenej hemisféry mozgu experimentálnych zvierat sa normalizuje percentuálny pomer fosfolipidov a zvyšuje sa obsah mastných kyselín (C16:0, C17:0, C17:1, C18:0, C18:1 + C18:2, C20:3 + C20:4, C20:5).

Tieto údaje potvrdzujú stimuláciu regeneračno-plastických procesov transplantovaným embryonálnym nervovým tkanivom a naznačujú reparatívno-trofický účinok transplantátu na mozog príjemcu ako celok.

Klinické skúsenosti pracovníkov Neurochirurgického ústavu A. P. Romodanova Akadémie lekárskych vied Ukrajiny s transplantáciou embryonálneho nervového tkaniva pri detskej mozgovej obrne, čo je mimoriadne zložitá patológia s ťažkou motorickou dysfunkciou, si zaslúžia osobitnú pozornosť. Klinické formy detskej mozgovej obrny závisia od úrovne poškodenia integrálnych štruktúr zodpovedných za reguláciu svalového tonusu a tvorbu motorických stereotypov. V súčasnosti existuje dostatok dôkazov na podporu skutočnosti, že patologické zmeny v striopalidálne-talamokortikálnom systéme motorickej kontroly zohrávajú dôležitú úlohu pri poruchách motorických funkcií a svalového tonusu. Striopalidálne spojenie tohto systému vykonáva kontrolnú funkciu prostredníctvom nigrostriatálnej produkcie dopamínu. Priama cesta pre implementáciu talamokortikálnej kontroly začína od neurónov putamenu, je sprostredkovaná kyselinou gama-aminomaslovou (GABA) a substanciou P a je premietaná priamo do motorickej zóny vnútorného segmentu globus pallidus a substantia nigra. Nepriama dráha, ktorej účinok sa realizuje za účasti GABA a enkefalínu, pochádza z neurónov putamenu a ovplyvňuje jadrá bazálnych ganglií prostredníctvom sekvencie spojení vrátane vonkajšieho segmentu globus pallidus a subtalamického jadra. Poruchy vodivosti priamej dráhy spôsobujú hypokinézu, zatiaľ čo zníženie vodivosti štruktúr nepriamej dráhy vedie k hyperkinéze so zodpovedajúcimi zmenami svalového tonusu. Integrita GABAergných vodivých dráh na rôznych úrovniach systému motorickej kontroly a integrácia dopaminergných spojení na úrovni putamenu sú nevyhnutné pre reguláciu talamokortikálnych interakcií. Najčastejším prejavom motorickej patológie pri rôznych formách detskej mozgovej obrny je porušenie svalového tonusu a úzko súvisiaca zmena reflexnej svalovej aktivity.

Transplantácia embryonálneho nervového tkaniva pri detskej mozgovej obrne si vyžaduje dôkladnú analýzu povahy poškodenia mozgových štruktúr. Na základe stanovenia hladín dopamínu a GABA v subarachnoidálnom mozgovomiechovom moku autori podrobne opísali úroveň narušenia integrácie funkčných mozgových štruktúr, čo umožnilo objektivizovať výsledky chirurgického zákroku a korigovať opakované neurotransplantácie. Embryonálne nervové tkanivo (materiál z potratu 9-týždňového embrya) bolo transplantované do parenchýmu kôry precentrálnych závitov mozgových hemisfér v závislosti od závažnosti atrofických zmien. V pooperačnom období neboli pozorované žiadne komplikácie ani zhoršenie stavu pacientov. Pozitívna dynamika bola zaznamenaná u 63 % pacientov so spastickou formou, u 82 % detí s atonicko-estetickou formou a iba u 24 % pacientov so zmiešanou formou ochorenia. Bol zistený negatívny vplyv vysokej úrovne neurosenzibilizácie s prítomnosťou autoprotilátok proti neurospecifickým proteínom na výsledky operácie. Transplantácia embryonálneho nervového tkaniva sa ukázala ako neúčinná u pacientov vo veku 8 – 10 rokov a starších, ako aj v prípadoch závažného hyperkinetického syndrómu a epilepsie. Klinicky sa účinnosť transplantácie embryonálneho nervového tkaniva u pacientov so spastickou formou detskej mozgovej obrny prejavila tvorbou nových statomotorických zručností a vôľových pohybov s korekciou patologického motorického stereotypu a znížením stupňa spasticity, patologických postojov a postojov. Autori sa domnievajú, že pozitívny účinok transplantácie embryonálneho nervového tkaniva je výsledkom normalizačného účinku na funkčnú aktivitu supraspinálnych štruktúr zapojených do regulácie posturálneho tonusu a vôľových pohybov. Zároveň pozitívne klinické účinky transplantácie embryonálneho nervového tkaniva sprevádza zníženie obsahu neurotransmiterov v subarachnoidálnom mozgovomiechovom moku, čo naznačuje obnovenie integrálnych interakcií postihnutých mozgových štruktúr.

Existuje ďalšia závažná forma neurologickej patológie - apalický syndróm, ktorého problém liečby, žiaľ, nie je ani zďaleka vyriešený. Apalický syndróm je polyetiologický subakútny alebo chronický stav, ktorý vzniká v dôsledku závažných organických lézií centrálneho nervového systému (najmä mozgovej kôry) a je charakterizovaný rozvojom panapraxie a panagnózie s relatívne zachovanou funkciou segmentálno-kmeňových častí a formácií limbicko-retikulárneho komplexu mozgu. Následné štúdie (od 1 roka do 3 rokov) ukázali, že apalický syndróm nie je konečnou diagnózou pretrvávajúceho poškodenia nervového systému u detí, ale transformuje sa buď na organickú demenciu, alebo na chronický vegetatívny stav. Na oddelení reštauračnej neurochirurgie Neurochirurgického ústavu A. P. Romodanova Akadémie lekárskych vied Ukrajiny podstúpilo 21 pacientov s následkami apalického syndrómu transplantáciu embryonálneho nervového tkaniva. V celkovej anestézii sa pomocou korunkového vrtáka vytvoril otvor v oblasti najvýraznejších atrofických zmien zistených počítačovou tomografiou alebo magnetickou rezonanciou a v prípade difúznej atrofie sivej alebo bielej hmoty sa transplantát zaviedol do precentrálneho a centrálneho gyru mozgu. Po otvorení dura mater sa pomocou špeciálneho zariadenia intrakortikálne implantovali kúsky tkaniva zo senzomotorickej kôry 8-9-týždňových embryí. Počet implantovaných vzoriek tkaniva sa pohyboval od 4 do 10, čo bolo určené veľkosťou otvoru a veľkosťou lokálnych zmien v mozgovej hmote. Na rozdiel od iných typov patológie sa pri apalickom syndróme autori snažili implantovať čo najviac embryonálneho tkaniva do najdostupnejších oblastí mozgu. Dura mater sa zošila a vykonala sa plastická operácia defektu lebky. Počas operácie sa u všetkých pacientov vyskytli významné zmeny v mozgovej kôre (atrofia, absencia závitov, zmena farby a pulzácie mozgovej hmoty) aj v mozgových blánach (zhrubnutie tvrdej pleny mozgovej, významné zhrubnutie arachnoideálnej membrány s prítomnosťou vlastných ciev, srastanie membrán s podkladovou mozgovou hmotou). Tieto zmeny boli výraznejšie u pacientov s anamnézou zápalových lézií mozgu. U pacientov, ktorí prekonali hypoxiu CNS, prevládali difúzne atrofické zmeny v mozgovej hmote, najmä v kôre, so zväčšením subarachnoidálneho priestoru, bez významných zmien v mozgových blánach. Polovica pacientov mala zvýšené krvácanie do mäkkých tkanív, kostí a mozgovej hmoty. Po operáciách sa v priebehu šiestich mesiacov až troch rokov stav zlepšil u 16 pacientov a u piatich pacientov zostal nezmenený. Pozitívna dynamika sa pozorovala v motorickej aj mentálnej sfére. Svalový tonus sa znížil u desiatich pacientov, u 11 pacientov sa zvýšila motorická aktivita (znížila sa paréza,zlepšila sa koordinácia pohybov), u piatich detí sa výrazne zvýšila manipulačná schopnosť horných končatín. U štyroch pacientov sa znížila frekvencia a závažnosť epileptických záchvatov a u jedného dieťaťa sa počas celého sledovaného obdobia po operácii nevyskytli žiadne záchvaty. U dvoch detí sa znížila agresia, u dvoch pacientov s ťažkými bulbárnymi poruchami sa zlepšil akt prehĺtania, dve deti boli schopné samostatne žuť už 2 týždne po operácii. Zaznamenal sa pokles závažnosti duševných porúch, deväť detí sa po operácii upokojilo, u siedmich pacientov sa zlepšil spánok a pozornosť. Traja pacienti s následkami apalického syndrómu začali rozpoznávať svojich rodičov, jeden - riadiť sa pokynmi, dvaja - vyslovovať slová, u troch sa znížil stupeň dyzartrie. Autori poznamenávajú, že badateľné zlepšenie stavu pacientov začína 2 mesiace po operácii, maximum dosahuje do 5-6 mesiacov, potom sa tempo zlepšovania spomaľuje a do konca roka sa proces stabilizuje u 50 % pacientov. Pozitívny účinok neurotransplantácie slúžil ako základ pre opakovanú operáciu u šiestich pacientov s následkami apalického syndrómu, ale na druhej hemisfére mozgu. Technika a metódy druhej transplantácie boli identické s metódami prvej operácie, ale klinický účinok druhej operácie bol nižší, hoci po prvom ani druhom chirurgickom zákroku nevznikli žiadne závažné komplikácie. Podľa autorov je mechanizmus terapeutického účinku neurotransplantácie spojený s neurotrofickým účinkom transplantovaného embryonálneho nervového tkaniva, ktoré obsahuje veľké množstvo rastových, hormonálnych a iných biologicky aktívnych látok, ktoré stimulujú reparáciu poškodených neurónov a plastickú reorganizáciu mozgového tkaniva príjemcu. Možný je aj aktivačný účinok na aktivitu nervových buniek, ktoré boli predtým morfologicky zachované, ale v dôsledku ochorenia stratili svoju funkčnú aktivitu. Práve rýchly neurotrofický účinok môže vysvetliť zlepšenie bulbárnych funkcií u niektorých detí už na konci prvého alebo druhého týždňa po operácii. Predpokladá sa, že okrem toho sa do tretieho alebo štvrtého mesiaca vytvoria morfofunkčné spojenia medzi transplantátom a mozgom hostiteľa, prostredníctvom ktorých neurotransplantát nahrádza funkcie odumretých mozgových buniek, čo je substrát pre zlepšenie motorických aj mentálnych funkcií pacientov. Dve deti boli schopné samostatne žuť už 2 týždne po operácii. Zaznamenal sa pokles závažnosti duševných porúch, deväť detí sa po operácii upokojilo, u siedmich pacientov sa zlepšil spánok a pozornosť. Traja pacienti s následkami apalického syndrómu začali rozpoznávať svojich rodičov, jeden - riadiť sa pokynmi, dvaja - vyslovovať slová.U troch sa stupeň dyzartrie znížil. Autori poznamenávajú, že znateľné zlepšenie stavu pacientov začína 2 mesiace po operácii, dosahuje maximum do 5-6 mesiacov, potom sa tempo zlepšovania spomaľuje a do konca roka sa proces stabilizuje u 50 % pacientov. Pozitívny účinok neurotransplantácie slúžil ako základ pre opakovanú operáciu u šiestich pacientov s následkami apalického syndrómu, ale na druhej hemisfére mozgu. Technika a metóda druhej transplantácie boli identické s technikou prvej operácie, ale klinický účinok druhej operácie bol nižší, hoci po prvom ani druhom chirurgickom zákroku nedošlo k žiadnym závažným komplikáciám. Podľa autorov je mechanizmus terapeutického účinku neurotransplantácie spojený s neurotrofickým účinkom transplantovaného embryonálneho nervového tkaniva, ktoré obsahuje veľké množstvo rastových, hormonálnych a iných biologicky aktívnych látok, ktoré stimulujú reparáciu poškodených neurónov a plastickú reorganizáciu mozgového tkaniva príjemcu. Možný je aj aktivačný účinok na aktivitu nervových buniek, ktoré boli predtým morfologicky zachované, ale v dôsledku ochorenia stratili svoju funkčnú aktivitu. Práve rýchly neurotrofický účinok môže vysvetliť zlepšenie bulbárnych funkcií u niektorých detí už na konci prvého alebo druhého týždňa po operácii. Predpokladá sa, že spolu s tým sa do tretieho alebo štvrtého mesiaca vytvárajú morfofunkčné spojenia medzi transplantátom a mozgom hostiteľa, prostredníctvom ktorých neurotransplantát nahrádza funkcie odumretých mozgových buniek, čo je substrát pre zlepšenie motorických aj mentálnych funkcií pacientov. Dve deti boli schopné samostatne žuť už 2 týždne po operácii. Zaznamenal sa pokles závažnosti duševných porúch, deväť detí sa po operácii upokojilo, u siedmich pacientov sa zlepšil spánok a pozornosť. Traja pacienti s následkami apalického syndrómu začali rozpoznávať svojich rodičov, jeden - riadiť sa pokynmi, dvaja - vyslovovať slová, u troch sa znížil stupeň dyzartrie. Autori poznamenávajú, že znateľné zlepšenie stavu pacientov začína 2 mesiace po operácii, maximum dosahuje do 5-6 mesiacov, potom sa tempo zlepšovania spomaľuje a do konca roka sa proces stabilizuje u 50 % pacientov. Pozitívny efekt neurotransplantácie slúžil ako základ pre opakovanú operáciu u šiestich pacientov s následkami apalického syndrómu, ale na druhej hemisfére mozgu. Technika a metóda druhej transplantácie boli identické s prvou operáciou, ale klinický efekt druhej operácie bol nižší, hoci po prvom ani druhom chirurgickom zákroku nedošlo k žiadnym závažným komplikáciám. Podľa autorov,Mechanizmus terapeutického účinku neurotransplantácie je spojený s neurotrofickým účinkom transplantovaného embryonálneho nervového tkaniva, ktoré obsahuje veľké množstvo rastových, hormonálnych a iných biologicky aktívnych látok stimulujúcich reparáciu poškodených neurónov a plastickú reorganizáciu mozgového tkaniva príjemcu. Možný je aj aktivačný účinok na aktivitu nervových buniek, ktoré boli predtým morfologicky zachované, ale v dôsledku ochorenia stratili svoju funkčnú aktivitu. Práve rýchly neurotrofický účinok môže vysvetliť zlepšenie bulbárnych funkcií u niektorých detí už na konci prvého alebo druhého týždňa po operácii. Predpokladá sa, že spolu s tým sa do tretieho alebo štvrtého mesiaca vytvárajú morfofunkčné spojenia medzi transplantátom a mozgom hostiteľa, prostredníctvom ktorých neurotransplantát nahrádza funkcie odumretých mozgových buniek, čo je substrát pre zlepšenie motorických aj mentálnych funkcií pacientov, hoci po prvom ani druhom chirurgickom zákroku nevznikli žiadne závažné komplikácie. Podľa autorov je mechanizmus terapeutického účinku neurotransplantácie spojený s neurotrofickým účinkom transplantovaného embryonálneho nervového tkaniva, ktoré obsahuje veľké množstvo rastových, hormonálnych a iných biologicky aktívnych látok stimulujúcich opravu poškodených neurónov a plastickú reorganizáciu mozgového tkaniva príjemcu. Možný je aj aktivačný účinok na aktivitu nervových buniek, ktoré boli predtým morfologicky zachované, ale v dôsledku ochorenia stratili svoju funkčnú aktivitu. Práve rýchly neurotrofický účinok môže vysvetliť zlepšenie bulbárnych funkcií u niektorých detí už na konci prvého alebo druhého týždňa po operácii. Predpokladá sa, že spolu s tým sa do tretieho alebo štvrtého mesiaca vytvárajú morfofunkčné spojenia medzi transplantátom a mozgom hostiteľa, prostredníctvom ktorých neurotransplantát nahrádza funkcie odumretých mozgových buniek, čo je substrát pre zlepšenie motorických aj mentálnych funkcií pacientov, hoci po prvom ani druhom chirurgickom zákroku nevznikli žiadne závažné komplikácie. Podľa autorov je mechanizmus terapeutického účinku neurotransplantácie spojený s neurotrofickým účinkom transplantovaného embryonálneho nervového tkaniva, ktoré obsahuje veľké množstvo rastových, hormonálnych a iných biologicky aktívnych látok stimulujúcich reparáciu poškodených neurónov a plastickú reorganizáciu mozgového tkaniva príjemcu. Možný je aj aktivačný účinok na aktivitu nervových buniek, ktoré boli predtým morfologicky zachované, ale v dôsledku ochorenia stratili svoju funkčnú aktivitu.Práve rýchly neurotrofický účinok môže vysvetliť zlepšenie bulbárnych funkcií u niektorých detí už na konci prvého alebo druhého týždňa po operácii. Predpokladá sa, že spolu s tým sa do tretieho alebo štvrtého mesiaca vytvárajú morfofunkčné prepojenia medzi transplantátom a mozgom hostiteľa, prostredníctvom ktorých neurotransplantát nahrádza funkcie odumretých mozgových buniek, čo je substrát pre zlepšenie motorických aj mentálnych funkcií pacientov.

Experimentálne bol študovaný vplyv transplantácie embryonálneho nervového tkaniva na reorganizáciu interneuronálnych prepojení. Autori skúmali vzorce obnovy intermodulárnych axonálnych spojení v oblasti mechanického poškodenia mozgovej kôry u bielych potkanov s transplantáciou a bez transplantácie embryonálneho nervového tkaniva pomocou fluorescenčnej lipofilnej značky DIL (1,1-dioktadecyl-3,3,33'-tetrametylindokarbokyanín perchlorát) a konfokálneho laserového skenovania. Zistilo sa, že zavedenie embryonálneho nervového tkaniva do poškodenej oblasti zabezpečuje rast axónov, ktoré sa po prechode transplantátom spoja so susedným mozgovým tkanivom, zatiaľ čo bez transplantácie embryonálneho nervového tkaniva je poškodená oblasť neprekonateľnou prekážkou pre rastúce axóny. V tejto práci bola vykonaná transplantácia embryonálneho (15. – 17. deň tehotenstva) neokortexu. Výsledky, ktoré autori získali, sú ďalším dôkazom v prospech aktívneho vplyvu transplantácie embryonálneho nervového tkaniva na posttraumatickú reorganizáciu interneuronálnych vzťahov susedných štrukturálnych a funkčných modulov mozgovej kôry. Transplantácia embryonálneho nervového tkaniva zabezpečuje čiastočnú obnovu spojení medzi poškodenými oblasťami mozgovej kôry vytvorením priaznivých podmienok pre rast axónov v zóne pôsobenia neurotrofických faktorov transplantátu. Existencia takéhoto účinku bola experimentálne dokázaná a v literatúre sa diskutuje ako dôkaz vysokých plastických schopností poškodeného mozgu pohlavne dospelých zvierat. V tomto ohľade sa transplantácia buniek v súčasnosti považuje za optimálnu terapeutickú stratégiu na obnovenie funkcie poškodeného ľudského CNS.

Údaje získané autormi o účinnosti použitia embryonálneho nervového tkaniva mozgu ako exogénneho transplantačného média pre rast axónov potvrdzujú perspektívy cieleného vytvárania komunikačných spojení medzi intaktnými susednými oblasťami mozgu. Práca zameraná na štúdium vplyvu transplantácie nervového tkaniva na dynamiku funkčných parametrov centrálneho nervového systému sa javí ako relevantná. Úlohou práce bolo preskúmať vplyv transplantácie embryonálneho locus coeruleus (LC) na morfofunkčné indexy neurónov LC a pohybovú aktivitu príjemcov. Príjemcami boli samice potkanov Wistar a darcami boli 18-dňové embryá potkanov rovnakej línie. Transplantácia embryonálneho LC sa uskutočnila do dutiny tretej mozgovej komory. Histologicky sa uchytenie štepu zistilo u 75 % príjemcov. V prípadoch uchytenia štepu priliehal k stene komory, vypĺňal 1/5-2/5 jej lúmenu a bol životaschopný. 1 a 6 mesiacov po operácii transplantované nervové tkanivo podľa svojich morfologických charakteristík predstavovalo štruktúry, ktoré by vznikli počas ich normálneho ontogenetického vývoja, t. j. štruktúry LC. Údaje získané autormi naznačujú, že u zvierat, ktorým bol transplantovaný embryonálny útvar LC, sa mení dynamická aktivita a zvyšuje sa aktivita matrice chromatínu jadier buniek LC. V dôsledku toho sa zintenzívňuje aktivita neurónov vlastných LC, ale aj transplantovaný transplantát je funkčne aktívny. Je známe, že tzv. lokomotorická oblasť stredného mozgu sa prakticky zhoduje s lokalizáciou LC. Autori sa domnievajú, že základom zmeny motorickej aktivity recipientných potkanov je aktivácia buniek LC, vlastných aj transplantovaných, s uvoľňovaním veľkého množstva norepinefrínu, a to aj v segmentoch miechy. Predpokladá sa teda, že zvýšenie motorickej aktivity za podmienok transplantácie LC do intaktného mozgu zvierat je spôsobené prítomnosťou funkčne aktívneho transplantátu integrovaného s mozgom príjemcu a prispievajúceho k aktivácii lokomotorickej aktivity u potkanov.

Okrem toho sa ukázalo, že transplantované neuroepiteliálne bunky embryonálnych rudimentov neokortexu a miechy prežívajú a diferencujú sa na neuroblasty, mladé a zrelé neuróny v priebehu 1-2 mesiacov po ich transplantácii do poškodeného sedacieho nervu dospelých potkanov. Pri štúdiu dynamiky vývoja NADPH-pozitívnych neurónov embryonálnych rudimentov neokortexu a miechy potkanov v heterotopických alotransplantátoch (15-dňové embryo potkana) sa na pozdĺžnych rezoch cez sedacie nervy recipientných potkanov zistilo uchytenie 70 až 80 % neurotransplantátov, čo záviselo od doby pozorovania. V štepoch sa týždeň po operácii začali tvoriť uni- a bipolárne neuroblasty so zaoblenými ľahkými jadrami a jedným alebo dvoma jadierkami, čo bolo sprevádzané tvorbou zhlukov. Autorom sa medzi neuroblastami nepodarilo zistiť bunky obsahujúce NADPH diaforázu (NADPH-d). Po 7 dňoch boli NADPH-pozitívne iba bunkové prvky krvných ciev - kapilárne endotelové bunky v hrúbke transplantátu, ako aj endotelové bunky a bunky hladkého svalstva ciev sedacieho nervu príjemcu. Keďže v bunkách hladkého svalstva ciev dochádza k indukcii NO syntázy (NOS) pod vplyvom IL-1, autori spájajú výskyt NADPH-pozitívnych buniek hladkého svalstva v cievach sedacieho nervu s prítomnosťou IL-1 syntetizovaného v poškodených nervových kmeňoch. Je známe, že neurogenéza v podmienkach transplantácie embryonálnych mozgových zárodkov prebieha synchrónne s vývojom neurónov in situ. Výsledky morfologických štúdií naznačujú, že diferenciácia niektorých nervových prvkov transplantátov sedem dní po transplantácii zodpovedá diferenciácii buniek v podobných častiach mozgu novonarodených potkanov. Za podmienok heterotopickej transplantácie do periférneho nervu teda transplantované embryonálne nervové bunky vykazujú schopnosť syntetizovať NADPH-d. V tomto prípade sa v transplantátoch miechy nachádza viac neurónov obsahujúcich NADPH-d ako v transplantátoch neokortexu, ale syntéza oxidu dusnatého začína v transplantovaných neurónoch neskôr ako počas vývoja in situ. V CNS stavovcov sa NOS-pozitívne bunky objavujú už v prenatálnom období. Predpokladá sa, že NO podporuje tvorbu synaptických spojení vo vyvíjajúcom sa mozgu a prítomnosť NOS-pozitívnych nervových aferentných vlákien, ktoré zabezpečujú syntézu NO v cerebelárnych neuroblastoch, stimuluje migráciu a diferenciáciu neurónov, vďaka čomu sa vytvára normálna cytoarchitektúra mozgu. V tekte bola stanovená dôležitá úloha NO v synapsogenéze - NOS-pozitívne sa ukázali byť iba tie neuróny, ktoré mali synaptické spojenia s bunkami sietnice.

Je známe, že oxid dusnatý je jedným z regulátorov mozgovej aktivity, kde sa tvorí z arginínu pod vplyvom NO syntázy, ktorá má diaforázovú aktivitu. V centrálnom nervovom systéme sa NO syntetizuje v endotelových bunkách ciev, mikrogliách, astrocytoch a neurónoch rôznych častí mozgu. Po traumatickom poranení mozgu, ako aj počas hypoxie a ischémie, sa pozoruje zvýšenie počtu neurónov obsahujúcich NO, ktorý je jedným z regulátorov prietoku krvi mozgom. Vzhľadom na schopnosť NO indukovať synapsogenézu je obzvlášť zaujímavé štúdium tvorby buniek obsahujúcich NO v podmienkach neurotransplantácie na pozadí traumatického poškodenia nervového tkaniva príjemcu.

Nemenej dôležité je štúdium vplyvu neurotransplantácie na podmienený reflexný stereotyp správania. V experimentoch zameraných na štúdium vplyvu intracerebrálnej a vzdialenej (medzi CII a CIII) transplantácie embryonálneho tkaniva locus coeruleus (17. – 19. deň tehotenstva) na pamäťové procesy a obsah katecholamínov u potkanov s deštrukciou frontotemporálneho neokortexu sa ukázalo, že elektrolytické poškodenie frontotemporálneho kortexu mozgu narúša stereotyp podmieneného reflexu emocionálnej reakcie vyhýbania sa (pamäť), oslabuje fyziologickú aktivitu, znižuje obsah norepinefrínu v zóne koagulovaného neokortexu, ale zvyšuje jeho hladinu v hypotalame, kde sa pozoruje pokles koncentrácie adrenalínu, hoci jeho množstvo v krvi a nadobličkách sa zvyšuje.

V dôsledku intracerebrálnej transplantácie embryonálneho tkaniva locus coeruleus sa u 81,4 % zvierat obnoví stereotyp podmieneného reflexu emocionálnej vyhýbacej reakcie, narušený elektrolytickým poškodením frontotemporálnych oblastí mozgovej kôry, normalizuje sa obsah adrenalínu v retikulárnej formácii stredného mozgu, hypotalame a neokortexe a jeho hladina v hipokampe sa dokonca zvyšuje, čo je spojené so znížením koncentrácie adrenalínu v krvi.

Diaľková transplantácia embryonálneho tkaniva locus coeruleus nielenže obnovuje narušený stereotyp podmieneného reflexu emocionálnej vyhýbacej reakcie u potkanov s elektrolytickým poškodením frontotemporálnej kôry, ale tiež zvyšuje obsah norepinefrínu a adrenalínu, najmä v hypotalame, krvi, nadobličkách a srdci. Predpokladá sa, že je to spôsobené vaskularizáciou transplantátu, prenikaním neurotransmiterov do krvného obehu, ich prechodom cez hematoencefalickú bariéru a aktiváciou mechanizmov spätného vychytávania adrenalínu a norepinefrínu typmi vychytávania 1, 2, 3. Autori sa domnievajú, že dlhodobú stabilizáciu hladiny norepinefrínu za podmienok uchytenia a fungovania transplantátu možno považovať za jav jeho progresívneho uvoľňovania v minimálnych dávkach neurónmi locus coeruleus.

Pozitívne klinické účinky transplantácie embryonálneho nervového tkaniva môžu byť tiež spôsobené jeho schopnosťou ovplyvňovať procesy vaskulárnej neoplazmy, na regulácii ktorých sa priamo podieľajú rastové faktory a cytokíny. Vaskulogenézu aktivujú angiogénne rastové faktory - vaskulárny endotelový rastový faktor (VEGF), FGF, PDGF a TGF, ktoré sa syntetizujú počas ischémie, ktorá pôsobí ako iniciačný moment angiogenézy. Bolo dokázané, že k vyčerpaniu vaskulárneho rastového potenciálu dochádza počas procesu starnutia tela, čo hrá významnú úlohu v patogenéze ochorení, ako je ischemická choroba srdca a obliterujúca ateroskleróza dolných končatín. Ischémia tkaniva sa vyvíja aj pri mnohých ďalších ochoreniach. Zavedenie angiogénnych faktorov do ischemických zón (terapeutická angiogenéza) stimuluje rast krvných ciev v ischemických tkanivách a zlepšuje mikrocirkuláciu v dôsledku rozvoja kolaterálneho obehu, čo následne zvyšuje funkčnú aktivitu postihnutého orgánu.

VEGF a FGF sa považujú za najsľubnejšie pre klinické použitie. Výsledky prvých randomizovaných štúdií boli povzbudivé, najmä ak boli správne zvolené optimálne dávky a spôsoby podávania angiogénnych faktorov. V tejto súvislosti sa vykonalo experimentálne hodnotenie angiogénnej aktivity extraktu izolovaného z ľudského embryonálneho mozgového tkaniva. V práci sa použil materiál z potratu získaný v dvadsiatom týždni tehotenstva a spracovaný podľa metódy I. Macioga a kol. (1979) v modifikácii IC ANRF. Tento liek je analógom „doplnku pre rast endoteliálnych buniek“ („Sigma“) a je to prirodzená zmes ľudských angiogénnych faktorov, ktorá zahŕňa VEGF a FGF. Experimenty sa uskutočnili na potkanoch s modelmi ischémie tkaniva zadných končatín a myokardu. Na základe štúdie aktivity alkalickej fosfatázy u experimentálnych zvierat, ktorým bol podávaný extrakt z embryonálneho nervového tkaniva, sa zistilo zvýšenie počtu kapilár na jednotku plochy myokardu - v pozdĺžnych aj priečnych rezoch srdca. Angiogénna aktivita prípravku sa prejavila priamym podaním do ischemickej zóny, ako aj v prípade systémového (intramuskulárneho) podania, čo viedlo k zníženiu priemernej plochy jazvy po infarkte.

Pri akomkoľvek variante transplantácie embryonálneho nervového tkaniva je mimoriadne dôležité správne zvoliť gestačný vek transplantovaného embryonálneho materiálu. Porovnávacia analýza účinnosti bunkových preparátov z embryonálneho ventrálneho mezencefalonu 8-, 14- a 16-17-dňových embryí potkanov tri mesiace po intrastriatálnej neurotransplantácii dospelým potkanom s parkinsonizmom v automatizovanom teste motorickej asymetrie indukovanej apomorfínom odhalila významne vyššiu účinnosť bunkových preparátov CNS z 8-dňových embryí a najnižšiu účinnosť zo 16-17-dňového embryonálneho nervového tkaniva. Získané údaje korelovali s výsledkami histomorfologickej analýzy, najmä s veľkosťou transplantátov, závažnosťou gliovej reakcie a počtom dopaminergných neurónov v nich.

Rozdiely v terapeutickom účinku embryonálnych buniek nervového tkaniva môžu súvisieť tak so stupňom nezrelosti a angažovanosti samotných buniek, ako aj s ich rôznymi reakciami na rastové faktory uvoľňované v oblasti indukovaného poškodenia dopaminergných neurónov. Najmä účinok EGF a FGF2 na vývoj telencefalických nervových kmeňových buniek in vivo sa prejavuje v rôznych štádiách embryogenézy. Neuroepiteliálne bunky 8,5-dňových myších embryí, keď sa kultivujú in vitro v bezsérovom médiu, proliferujú v prítomnosti FGF2, ale nie EGF, na ktorý reagujú iba populácie kmeňových buniek izolovaných z mozgu embryí v neskorších štádiách vývoja. Zároveň nervové kmeňové bunky proliferujú v reakcii na každý z týchto mitogénov a aditívne zvyšujú rast v prípade pridania EGF a FGF2 do kultúry s nízkou hustotou výsevu buniek. EGF-reaktívne nervové kmeňové bunky zo zárodočných zón 14,5-dňových embryí myší sa považujú za lineárnych potomkov FGF-reaktívnych nervových kmeňových buniek, ktoré sa prvýkrát objavia po 8,5 dňoch tehotenstva. Potenciálny fenotyp nervových kmeňových a progenitorových buniek závisí od komplexného vplyvu ich mikroprostredia. Imunofenotypizácia nervových buniek z periventrikulárnej a hipokampálnej zóny 8-12- a 17-20-týždňových ľudských embryí prietokovou cytofluorometriou odhalila významnú variabilitu spojenú s gestačným vekom aj s individuálnymi konštitučnými vlastnosťami darcovského biomateriálu. Keď sa tieto nervové progenitorové bunky kultivujú v selektívnom bezsérovom médiu s EGF, FGF2 a NGF, neurosféry sa tvoria rýchlosťou, ktorá významne závisí od gestačného veku. Bunky z rôznych častí mozgu 5-13 týždňov starých ľudských embryí, pri krátkej kultivácii s FGF2 v monovrstvovej kultúre na laminínovom substráte v prítomnosti stopových množstiev rastových faktorov, si udržiavajú proliferáciu počas 6 týždňov s vysokým percentom nestín-pozitívnych buniek na pozadí spontánnej tvorby buniek s markermi všetkých troch línií neurálnej diferenciácie. Bunky izolované z mezencefalonu ľudského embrya v období gestácie presahujúcom 13 týždňov proliferujú pod vplyvom EGF a tiež tvoria neurosféry. Synergický účinok sa dosiahol použitím kombinácie EGF a FGF2. Najintenzívnejšia proliferácia nervových kmeňových buniek s tvorbou neurosfér sa pozoruje pri kultivácii tkaniva mozgovej kôry 6-8 týždňov starých ľudských embryí v prítomnosti EGF2, IGF1 a 5% konského séra na substráte s fibronektínom.

Treba poznamenať, že otázky týkajúce sa gestačného veku a sekcie embryonálneho CNS, ktorej tkanivo je výhodnejšie použiť na účely neurotransplantácie, zostávajú otvorené. Odpovede na ne by sa mali hľadať v neurogenéze vyvíjajúceho sa mozgu, ktorá pokračuje počas celého prenatálneho obdobia - v čase, keď epitel neurálnej trubice tvorí viacvrstvovú štruktúru. Predpokladá sa, že zdrojom kmeňových buniek a nových neurónov je radiálna glia, pozostávajúca z predĺžených buniek s dlhými výbežkami radiálne smerujúcimi vzhľadom na stenu mozgových vezikúl a kontaktujúcimi vnútorný povrch komôr a vonkajší piálny povrch mozgovej steny. Predtým bola radiálna glia obdarená iba funkciou neuronálneho traktu, pozdĺž ktorého migrujú neuroblasty z ventrálnej oblasti do povrchových sekcií, a bola jej tiež pridelená kostrová úloha v procese formovania správnej laminárnej organizácie kôry. Dnes sa zistilo, že s postupujúcim vývojom sa radiálna glia transdiferencuje na astrocyty. Významná časť z neho u cicavcov sa redukuje bezprostredne po narodení, avšak u tých živočíšnych druhov, u ktorých sa radiálna glia zachovala až do dospelosti, sa neurogenéza aktívne vyskytuje v postnatálnom období.

V kultúre radiálne gliové bunky z embryonálneho neokortexu hlodavcov tvorili neuróny a gliové bunky, pričom neuróny sa prevažne tvorili v 14. až 16. dni gestačného veku embryonálneho vývoja (obdobie maximálnej intenzity neurogenézy v mozgovej kôre myší a potkanov). Na 18. deň embryogenézy sa diferenciácia posunula smerom k tvorbe astrocytov s významným poklesom počtu novovytvorených neurónov. In situ značenie radiálnych gliových buniek pomocou GFP umožnilo detegovať asymetrické delenie značených buniek v dutine mozgových vezikúl 15. až 16. dňa starých embryí potkanov s výskytom dcérskych buniek s imunologickými a elektrofyziologickými charakteristikami neuroblastov. Je pozoruhodné, že podľa výsledkov dynamických pozorovaní vznikajúce neuroblasty využívajú materskú bunku radiálnych gliových buniek na migráciu na piálny povrch.

Endogénnym markerom radiálnej glie je intermediárny filamentový proteín nestín. Pomocou metódy fluorescenčného prietokového triedenia buniek označených retrovírusom asociovaným s GFP a exprimovaných pod kontrolou nestínu sa ukázalo, že kmeňové bunky gyrus dentate a hilus ľudského hipokampu (materiál bol získaný počas operácií epilepsie) exprimujú nestín. Preto patria do radiálnej glie, ktorá je u ľudí, rovnako ako u iných cicavcov, zachovaná iba v gyrus dentate.

Zároveň účinnosť transplantácie buniek nie je určená len vysokou životaschopnosťou darcovských buniek, ich diferenciačným potenciálom a schopnosťou nahradiť defektné bunky, ale predovšetkým ich cielenou migráciou. Plná funkčná integrácia transplantovaných buniek závisí od ich migračnej schopnosti - bez narušenia cytoarchitektúry mozgu príjemcu. Keďže radiálna glia v postnatálnom období prechádza takmer úplnou redukciou, bolo potrebné zistiť, ako sa darcovské bunky môžu presunúť z transplantačnej zóny do miesta poškodenia mozgu u dospelých príjemcov. Existujú dva varianty migrácie buniek do CNS, ktoré nezávisia od radiálnej glie: fenomén tangenciálnej migrácie alebo pohyb neuroblastov počas vývoja mozgovej kôry kolmo na sieť radiálnej glie, ako aj migrácia „v rade“ alebo „pozdĺž reťazca“. Najmä migrácia nervových progenitorových buniek z rostrálnej subventrikulárnej zóny do čuchovej bulbu prebieha ako postupnosť tesne susediacich buniek obklopených gliovými bunkami. Predpokladá sa, že tieto bunky používajú partnerské bunky ako migračný substrát a hlavným regulátorom takýchto medzibunkových interakcií je PSA-NCAM (polysialylovaná adhézna molekula nervových buniek). Preto neuronálna migrácia nemusí nevyhnutne vyžadovať účasť radiálnej glie alebo už existujúcich axonálnych spojení. Extraradiálna forma pohybu buniek v „reťazci“ pozdĺž rostrálneho migračného traktu sa zachováva počas celého života, čo naznačuje reálnu možnosť cieleného dodávania transplantovaných nervových progenitorových buniek do zrelého nervového systému.

Existuje hypotéza o prítomnosti línie kmeňových buniek v ontogenéze mozgu, podľa ktorej je v raných štádiách vývoja mozgu kmeňová bunka neuroepiteliálna bunka, ktorá sa po dozrievaní transdiferenciuje na radiálnu gliu. V dospelosti úlohu kmeňových buniek plnia bunky, ktoré majú vlastnosti astrocytov. Napriek množstvu kontroverzných bodov (rozpory týkajúce sa kmeňových buniek hipokampu, ako aj hlbokých častí mozgu, ktoré nemajú vrstevnatú kôru a vyvíjajú sa z talamických tuberkul, kde radiálna glia chýba), jasná a jednoduchá koncepcia konzistentnej zmeny fenotypu kmeňových buniek počas ontogenézy vyzerá veľmi atraktívne.

Vplyv faktorov mikroprostredia na determináciu a následnú diferenciáciu nervovo diferencovaných buniek bol jasne preukázaný transplantáciou zrelých kmeňových buniek miechy potkanov do rôznych oblastí zrelého nervového systému. Keď boli kmeňové bunky transplantované do gyrus dentatus alebo do oblasti neuronálnej migrácie v čuchových cibuľkách, pozorovala sa aktívna migrácia transplantovaných buniek s tvorbou početných neurónov. Transplantácia kmeňových buniek do miechy a oblasti Ammonovho rohu viedla k tvorbe astrocytov a oligodendrocytov, zatiaľ čo transplantácia do gyrus dentatus viedla k tvorbe nielen gliových buniek, ale aj neurónov.

U dospelého potkana môže počet deliacich sa buniek v gyrus dentatus dosiahnuť niekoľko tisíc za deň - menej ako 1 % z celkového počtu granulárnych buniek. Neuróny tvoria 50 – 90 % buniek, astocyty a ďalšie gliové elementy - približne 15 %. Zvyšné bunky nemajú antigénne vlastnosti neurónov a glie, ale obsahujú antigény endotelových buniek, čo naznačuje úzky vzťah medzi neurogenézou a angiogenézou v gyrus dentatus. Zástancovia možnosti diferenciácie endotelových buniek na neuronálne prekurzorové bunky sa odvolávajú na schopnosť endotelových buniek in vitro syntetizovať BDNF.

Rýchlosť samozostavovania nervových obvodov je pôsobivá: počas diferenciácie prekurzorové bunky granulárnych buniek migrujú do gyrus dentatus a vytvárajú výbežky rastúce smerom k SAZ zóne Ammonovho rohu a vytvárajú synapsie s pyramídovými glutamatergickými a interkalárnymi inhibičnými neurónmi. Novovytvorené granulárne bunky sa integrujú do existujúcich nervových obvodov do 2 týždňov a prvé synapsie sa objavujú už 4-6 dní po vzniku nových buniek. Častým podávaním BrdU alebo 3H-tymidínu (jedna z metód na identifikáciu dospelých kmeňových buniek) dospelým zvieratám sa v Ammonovom rohu našlo veľké množstvo značených neurónov a astrocytov, čo naznačuje možnosť tvorby nových neurónov nielen v gyrus dentatus, ale aj v iných častiach hipokampu. Záujem o procesy delenia, diferenciácie a bunkovej smrti v gyrus dentatus hipokampu zrelého mozgu je spôsobený aj tým, že neuróny, ktoré sa tu tvoria, sú lokalizované v jednej z kľúčových oblastí hipokampu, zodpovednej za procesy učenia a pamäte.

Dnes sa teda zistilo, že nervové progenitorové bunky pochádzajú z buniek subependymálnej zóny laterálnej komory dospelých hlodavcov. Migrujú pozdĺž rostrálneho migračného traktu tvoreného pozdĺžne orientovanými astrogliálnymi bunkami do čuchového bulbu, kde sú uložené vo vrstve granulárnych buniek a diferencujú sa na neuróny tejto štruktúry. Migrácia progenitorových nervových buniek bola zistená v rostrálnom migračnom trakte dospelých opíc, čo naznačuje možnosť tvorby nových neurónov v čuchovom bulbu primátov. Nervové kmeňové bunky boli izolované z čuchového bulbu dospelého človeka a prenesené do línií, ktorých klonované bunky sa diferencujú na neuróny, astrocyty a oligodendrocyty. Kmeňové bunky boli nájdené v hipokampe zrelého mozgu potkanov, myší, opíc a ľudí. Nervové kmeňové bunky subgranulárnej zóny dentátovej fascie sú zdrojom progenitorových buniek migrujúcich do mediálnych a laterálnych končatín hipokampu, kde sa diferencujú na zrelé granulárne bunky a gliové elementy. Axóny de novo vytvorených neurónov dentátovej fascie sú sledované až do poľa CA3, čo naznačuje účasť novovytvorených neurónov na realizácii hipokampálnych funkcií. V asociačných oblastiach neokortexu dospelých opíc boli nájdené neuronálne progenitorové bunky migrujúce zo subventrikulárnej zóny. Vo vrstve VI neokortexu mozgu myši sú nové pyramídové neuróny detegované 2 až 28 týždňov po indukovanom poškodení a smrti natívnych neurónov tejto vrstvy v dôsledku migrácie predtým dormantných progenitorových buniek subventrikulárnej zóny. Realitu postnatálnej neurogenézy v ľudskom mozgu nakoniec dokazuje dvojnásobný nárast počtu kortikálnych neurónov, ktorý pokračuje počas prvých 6 rokov po narodení.

Pre praktickú bunkovú transplantológiu má nemalý význam otázka regulácie procesov reprodukcie a diferenciácie nervových kmeňových a progenitorových buniek. Najdôležitejšími faktormi potláčajúcimi proliferáciu nervových progenitorových buniek sú glukokortikoidy, ktoré prudko znižujú počet delení, zatiaľ čo odstránenie nadobličiek naopak výrazne zvyšuje počet mitóz (Gould, 1996). Je pozoruhodné, že morfogenéza gyrus dentatus u hlodavcov je najintenzívnejšia počas prvých dvoch týždňov postnatálneho vývoja v období absencie reakcie na stres na pozadí prudkého poklesu produkcie a sekrécie steroidných hormónov kôry nadobličiek. Kortikosteroidy inhibujú migráciu granulárnych buniek - nové neuróny nie sú uložené v granulárnej vrstve gyrus dentatus, ale zostávajú v hiluse. Predpokladá sa, že súčasne sú narušené procesy tvorby synaptických spojení. Ochrana buniek pred takouto „steroidnou agresiou“ sa vykonáva minimálnou expresiou mineralokortikoidných a glukokortikoidných receptorov na proliferujúcich granulárnych bunkách nielen počas vývoja gyrus dentatus, ale aj u dospelých zvierat. Zo všetkých neurónov mozgu sa však práve neuróny hipokampu vyznačujú najvyšším obsahom glukokortikoidných receptorov, čo spôsobuje stresový účinok na hipokampus. Psychoemocionálny stres a stresové situácie inhibujú neurogenézu a chronický stres prudko znižuje schopnosť zvierat získavať nové zručnosti a učiť sa. Výraznejší negatívny vplyv chronického stresu na neurogenézu je celkom pochopiteľný, ak vezmeme do úvahy prevažne spiaci stav nervových kmeňových buniek. Pri imobilizácii gravidných potkanov (pre hlodavce - extrémne silný stresový faktor) sa zistilo, že prenatálny stres tiež spôsobuje pokles počtu buniek v gyrus dentatus a významne inhibuje neurogenézu. Je známe, že glukokortikoidy sa podieľajú na patogenéze depresívnych stavov, ktorých morfologickým ekvivalentom je inhibícia neurogenézy, patologická reorganizácia neurónov a interneuronálnych spojení a smrť nervových buniek. Na druhej strane, antidepresívne chemoterapeutické látky aktivujú tvorbu neurónov de novo, čo potvrdzuje súvislosť medzi procesmi tvorby nových neurónov v hipokampe a rozvojom depresie. Estrogény majú významný vplyv na neurogenézu, ktorej účinky sú opačné ako účinok glukokortikosteroidov a spočívajú v podpore proliferácie a životaschopnosti nervových progenitorových buniek. Treba poznamenať, že estrogény významne zvyšujú schopnosť učenia sa zvierat. Niektorí autori spájajú cyklické zmeny v počte granulárnych buniek a ich nadmerný počet u samíc s vplyvom estrogénov.

Je známe, že neurogenézu riadia EGF, FGF a BDNF, avšak mechanizmy účinku vonkajších signálov z mitogénov a rastových faktorov na kmeňové bunky neboli dostatočne preskúmané. Bolo zistené, že PDGF in vitro udržiava neuronálny smer diferenciácie progenitorových buniek a ciliárny neurotrofický faktor (CNTF), podobne ako trijódtyronín, stimuluje tvorbu prevažne gliových prvkov - astrocytov a oligodendrocytov. Hypofyzárny adenylátcyklázu aktivujúci proteín (PACAP) a vazoaktívny črevný peptid (VIP) aktivujú proliferáciu nervových progenitorových buniek, ale zároveň inhibujú procesy diferenciácie dcérskych buniek. Opioidy, najmä v prípade ich dlhodobej expozície, významne inhibujú neurogenézu. Opioidné receptory však neboli identifikované v kmeňových bunkách a nervových progenitorových bunkách gyrus dentatus (sú prítomné v diferencujúcich sa neurónoch embryonálneho obdobia), čo nám neumožňuje posúdiť priame účinky opioidov.

Potreby praktickej regeneratívno-plastickej medicíny prinútili výskumníkov venovať osobitnú pozornosť štúdiu pluri- a multipotencie kmeňových buniek. Implementácia týchto vlastností na úrovni regionálnych kmeňových buniek dospelého organizmu by v budúcnosti mohla zabezpečiť produkciu potrebného transplantačného materiálu. Vyššie bolo ukázané, že epigenetická stimulácia nervových kmeňových buniek umožňuje získať proliferujúce bunky už preformované podľa nervových fenotypov, čo obmedzuje ich počet. V prípade využitia totipotentných vlastností embryonálnej kmeňovej bunky dochádza k proliferácii až do získania dostatočného počtu buniek skôr ako k nervovej diferenciácii a rozmnožené bunky sa ľahko premenia na nervový fenotyp. Na získanie nervových kmeňových buniek sa ESC izolujú z vnútornej bunkovej hmoty blastocysty a kultivujú sa v povinnej prítomnosti LIF, čo zachováva ich totipotenciu a schopnosť neobmedzeného delenia. Následne sa indukuje nervová diferenciácia ESC pomocou kyseliny retínovej. Transplantácia výsledných nervových kmeňových buniek do striata poškodeného chinolínom a 6-hydroxydopamínom je sprevádzaná ich diferenciáciou na dopaminergné a serotonergné neuróny. Po injekcii do komôr embryonálneho mozgu potkana migrujú nervové progenitorové bunky odvodené z ESC do rôznych oblastí mozgu príjemcu, vrátane kôry, striata, septa, talamu, hypotalamu a mozočku. Bunky zostávajúce v dutine komôr tvoria epitelové štruktúry pripomínajúce nervovú trubicu, ako aj jednotlivé ostrovčeky nenervového tkaniva. V mozgovom parenchýme embrya príjemcu transplantované bunky produkujú tri hlavné typy buniek nervového systému. Niektoré z nich majú predĺžené apikálne dendrity, telá pyramídových buniek a bazálne axóny vyčnievajúce do corpus callosum. Astrocyty darcovského pôvodu predlžujú výbežky do blízkych kapilár a oligodendrocyty úzko kontaktujú myelínové mufy a podieľajú sa na tvorbe myelínu. Neurálne progenitorové bunky získané z ESC in vitro sú teda schopné riadenej migrácie a regionálnej diferenciácie primeranej signálom mikroprostredia, čím poskytujú mnohým oblastiam vyvíjajúceho sa mozgu neuróny a gliové bunky.

Niektorí autori zvažujú možnosť de- a transdiferenciácie regionálnych kmeňových buniek dospelého organizmu. Nepriame potvrdenie dediferenciácie buniek v kultúre s rozšírením ich potenciálu poskytujú údaje o uchytení myších nervových kmeňových buniek v červenej kostnej dreni s následným vývojom bunkových línií z nich, ktoré vedú k funkčne aktívnym bunkám periférnej krvi. Okrem toho transplantácia geneticky značených (LacZ) buniek neurosféry získaných zo zrelého alebo embryonálneho mozgu do mozgu ožiarených myší s potlačenou hematopoézou viedla nielen k tvorbe nervových derivátov z kmeňových buniek, ale spôsobila aj tvorbu krviniek, čo naznačuje pluripotenciu nervových kmeňových buniek, realizovanú mimo mozgu. Nervová kmeňová bunka je teda schopná diferencovať sa na krvinky pod vplyvom signálov z mikroprostredia kostnej drene s predchádzajúcou transformáciou na hematopoetickú kmeňovú bunku. Na druhej strane, pri transplantácii hematopoetických kmeňových buniek kostnej drene do mozgu bola preukázaná ich diferenciácia pod vplyvom mikroprostredia mozgového tkaniva na gliové a nervové bunky. V dôsledku toho nie je diferenciačný potenciál nervových a hematopoetických kmeňových buniek obmedzený tkanivovou špecifickosťou. Inými slovami, faktory lokálneho mikroprostredia, odlišné od faktorov charakteristických pre tkanivá mozgu a kostnej drene, sú schopné zmeniť smer diferenciácie týchto buniek. Ukázalo sa, že nervové kmeňové bunky zavedené do venózneho systému ožiarených myší vytvárajú populácie myeloidných, lymfoidných a nezrelých hematopoetických buniek v slezine a kostnej dreni. In vitro bol stanovený vplyv morfogenetických proteínov kostnej drene (BMP) na prežitie a diferenciáciu nervových kmeňových buniek, ktorý, rovnako ako v raných štádiách embryogenézy, určuje ich vývoj v nervovom alebo gliovom smere. V kultúrach nervových kmeňových buniek zo 16-dňových embryí potkanov BMP indukujú tvorbu neurónov a astroglií, zatiaľ čo v kultúrach kmeňových buniek odvodených z perinatálneho mozgu sa tvoria iba astrocyty. Okrem toho BMP potláčajú tvorbu oligodendrocytov, ktoré sa in vitro objavujú až po pridaní antagonistu BMP noggínu.

Transdiferenciačné procesy nie sú druhovo špecifické: hematopoetické kmeňové bunky ľudskej kostnej drene transplantované do striata dospelých potkanov migrujú do bielej hmoty vonkajšej kapsuly, ipsi- a kontralaterálneho neokortexu, kde tvoria bunkové elementy podobné astrocytom (Azizi a kol., 1998). Keď sú kmeňové bunky kostnej drene alotransplantované do laterálnej komory novonarodených myší, migráciu hematopoetických kmeňových buniek možno vysledovať až do štruktúr predného mozgu a mozočku. V striate a molekulárnej vrstve hipokampu sa migrované bunky transformujú na astrocyty a v čuchovom bulbe, vnútornej vrstve granulárnych buniek mozočku a retikulárnej formácii mozgového kmeňa tvoria bunky podobné neurónom s pozitívnou reakciou na neurofilamenty. Po intravenóznom podaní hematopoetických buniek dospelým myšiam boli v neokortexe, talame, mozgovom kmeni a mozočku detegované mikro- a astrocyty značené GFP.

Okrem toho, mezenchymálne kmeňové bunky kostnej drene, ktoré dávajú vznik všetkým typom buniek spojivového tkaniva, môžu za určitých podmienok tiež podliehať neurálnej transdiferenciácii (pripomeňme, že embryonálnym zdrojom mezenchýmu sú bunky neurálnej lišty). Bolo preukázané, že ľudské a myšie stromálne bunky kostnej drene kultivované in vitro v prítomnosti EGF alebo BDNF exprimujú marker neurálnych progenitorových buniek nestín a pridanie rôznych kombinácií rastových faktorov vedie k tvorbe buniek s markermi glie (GFAP) a neurónov (jadrový proteín, NeuN). Značené syngénne mezenchymálne kmeňové bunky transplantované do laterálnej komory mozgu novonarodených myší migrujú a lokalizujú sa v prednom mozgu a mozočku bez narušenia cytoarchitektúry mozgu príjemcu. Mezenchymálne kmeňové bunky kostnej drene sa diferencujú na zrelé astrocyty v striate a molekulárnej vrstve hipokampu a osídľujú čuchovú bulbu, granulárne vrstvy mozočku a retikulárnu formáciu, kde sa transformujú na neuróny. Mezenchymálne kmeňové bunky ľudskej kostnej drene sú schopné diferenciácie na makrogliu in vitro a integrácie do mozgových štruktúr potkanov po transplantácii. Priama transplantácia mezenchymálnych kmeňových buniek kostnej drene do hipokampu dospelých potkanov je tiež sprevádzaná ich migráciou do mozgového parenchýmu a neurogliálnou diferenciáciou.

Predpokladá sa, že transplantácia kmeňových buniek kostnej drene môže rozšíriť možnosti bunkovej terapie ochorení CNS charakterizovaných nadmernou patologickou smrťou neurónov. Treba však poznamenať, že nie všetci výskumníci uznávajú fakt vzájomnej transformácie nervových a hematopoetických kmeňových buniek, najmä in vivo, čo je opäť spôsobené nedostatkom spoľahlivého markera na posúdenie ich transdiferenciácie a ďalšieho vývoja.

Transplantácia kmeňových buniek otvára nové horizonty pre bunkovú génovú terapiu dedičnej neurologickej patológie. Genetická modifikácia nervových kmeňových buniek zahŕňa vloženie genetických regulačných konštruktov, ktorých produkty interagujú s proteínmi bunkového cyklu v režime automatickej regulácie. Transdukcia takýchto génov do embryonálnych progenitorových buniek sa používa na množenie nervových kmeňových buniek. Väčšina geneticky modifikovaných bunkových klonov sa správa ako stabilné bunkové línie, ktoré nevykazujú žiadne známky transformácie in vivo ani in vitro, ale majú výraznú schopnosť kontaktnej inhibície proliferácie. Po transplantácii sa množené transfekované bunky integrujú do tkaniva príjemcu bez narušenia cytoarchitektúry a bez toho, aby prešli nádorovou transformáciou. Darcovské nervové kmeňové bunky nedeformujú integračnú zónu a rovnako súťažia o priestor s hostiteľskými progenitorovými bunkami. Avšak na 2. až 3. deň sa intenzita delenia transfektovaných buniek prudko znižuje, čo zodpovedá kontaktnej inhibícii ich proliferácie in vitro. Embryá-príjemcovia transfektovaných nervových kmeňových buniek nemajú abnormality vo vývoji centrálneho nervového systému, všetky oblasti mozgu, ktoré sú v kontakte s transplantátom, sa vyvíjajú normálne. Po transplantácii klony nervových kmeňových buniek rýchlo migrujú z injekčnej zóny a často presahujú zodpovedajúce embryonálne zóny pozdĺž rostrálneho traktu, pričom sa adekvátne integrujú s inými oblasťami mozgu. Integrácia geneticky modifikovaných klonov a transfekovaných bunkových línií nervových kmeňových buniek do mozgu hostiteľského organizmu nie je charakteristická len pre embryonálne obdobie: tieto bunky sa implantujú do mnohých oblastí centrálneho nervového systému plodu, novorodenca, dospelého a dokonca aj starnúceho organizmu príjemcu a preukazujú schopnosť adekvátnej integrácie a diferenciácie. Najmä po transplantácii do ventrikulárnej dutiny mozgu transfekované bunky migrujú bez poškodenia hematoencefalickej bariéry a stávajú sa integrálnymi funkčnými bunkovými zložkami mozgového tkaniva. Darcovské neuróny vytvárajú vhodné synapsie a exprimujú špecifické iónové kanály. Pri zachovaní integrity hematoencefalickej bariéry astroglia, derivát transfektovaných nervových kmeňových buniek, rozširuje výbežky do mozgových ciev a oligodendrocyty odvodené od darcu exprimujú myelínový bázický proteín a myelinizujú neuronálne výbežky.

Okrem toho sa nervové kmeňové bunky transfekujú na použitie ako bunkové vektory. Takéto vektorové genetické konštrukty poskytujú stabilnú expresiu in vivo cudzích génov zapojených do vývoja nervového systému alebo sa používajú na korekciu existujúcich genetických defektov, pretože produkty týchto génov sú schopné kompenzovať rôzne biochemické abnormality centrálneho nervového systému. Vysoká migračná aktivita transfekovaných kmeňových buniek a adekvátna implantácia do zárodočných zón rôznych oblastí vyvíjajúceho sa mozgu nám umožňujú dúfať v úplnú obnovu dedičného deficitu bunkových enzýmov. Pri modelovaní syndrómu ataxia-teleangiektázia (mutantné myšie línie pg a pcd) Purkyňove bunky miznú z mozočka experimentálnych zvierat počas prvých týždňov postnatálneho vývoja. Ukázalo sa, že zavedenie nervových kmeňových buniek do mozgu takýchto zvierat je sprevádzané ich diferenciáciou na Purkyňove bunky a granulárne neuróny. U mutantov pcd sú poruchy koordinácie pohybu čiastočne korigované a intenzita tremoru je znížená. Podobné výsledky sa dosiahli transplantáciou klonovaných ľudských nervových kmeňových buniek do primátov, u ktorých bola degenerácia Purkyňových buniek indukovaná pomocou onkonázy. Po transplantácii sa darcovské nervové kmeňové bunky našli v granulárnych, molekulárnych a Purkyňových bunkových vrstvách cerebelárneho parenchýmu. Genetická modifikácia nervových progenitorových buniek preto môže zabezpečiť stabilnú a cielenú modifikáciu fenotypu, ktorá je odolná voči vonkajším vplyvom. Toto je obzvlášť dôležité pri patologických procesoch spojených s vývojom faktorov u príjemcu, ktoré bránia prežitiu a diferenciácii darcovských buniek (napr. počas imunitnej agresie).

Mukopolysacharidóza typu VII u ľudí je charakterizovaná neurodegeneráciou a progresívnou mentálnou retardáciou, ktorá je u myší modelovaná delečnou mutáciou v géne beta-glukuronidázy. Po transplantácii transfekovaných nervových kmeňových buniek vylučujúcich beta-glukuronidázu do mozgových komôr novorodených defektných recipientných myší sa darcovské bunky nachádzajú najprv v terminálnej zóne a potom sa šíria po celom mozgovom parenchýme, čím stabilne korigujú integritu lyzozómov v mozgu mutantných myší. V modeli Tay-Sachsovej choroby retrovírusom transdukované nervové kmeňové bunky, keď sú in utero podané myším plodom a transplantované novorodeným myšiam, poskytujú účinnú expresiu beta-podjednotky beta-hexozaminidázy u recipientov s mutáciou vedúcou k patologickej akumulácii beta2-gangliozidu.

Ďalším smerom regeneratívnej medicíny je stimulácia proliferačného a diferenciačného potenciálu vlastných nervových kmeňových buniek pacienta. Nervové kmeňové bunky najmä vylučujú NT-3 počas hemisekcie miechy a asfyxie mozgu u potkanov, exprimujú NGF a BDNF v septu a bazálnych gangliách, tyrozínhydroxylázy v striate, ako aj reelín v mozočku a myelínový bázický proteín v mozgu.

Otázkam stimulácie neurogenézy sa však zjavne nevenuje dostatočná pozornosť. Niekoľko štúdií naznačuje, že funkčné zaťaženie nervových centier zodpovedných za rozlišovanie pachov sa odráža vo tvorbe nových neurónov. U transgénnych myší s deficitom neuronálnych adhéznych molekúl sa zníženie intenzity neurogenézy a zníženie počtu neurónov migrujúcich do čuchových cibuliek kombinovalo so zhoršením schopnosti rozlišovať pachy, hoci prah vnímania pachov a krátkodobá čuchová pamäť neboli narušené. Funkčný stav buniek gyrus dentatus zohráva dôležitú úlohu v regulácii neurogenézy: oslabenie účinku glutamátu na granulárne bunky po deštrukcii entorhinálneho kortexu podporuje proliferáciu a diferenciáciu neurónov a stimulácia vlákien perforantnej dráhy (hlavný aferentný vstup do hipokampu) spôsobuje inhibíciu neurogenézy. Antagonisty NMDA receptorov aktivujú procesy tvorby nových neurónov, zatiaľ čo agonisty naopak znižujú intenzitu neurogenézy, čo sa v skutočnosti podobá účinku glukokortikosteroidov. V literatúre sa nachádzajú protichodné výsledky výskumu: informácie o experimentálne preukázanom inhibičnom účinku excitačného neurotransmiteru glutamátu na neurogenézu sú v rozpore s údajmi o stimulácii proliferácie progenitorových buniek a výskyte nových neurónov so zvýšením záchvatovej aktivity v hipokampe zvierat s experimentálnymi kaínovými a pilokarpínovými modelmi epilepsie. Zároveň v tradičnom modeli epilepsie spôsobenej viacnásobnou subprahovou stimuláciou určitej oblasti mozgu (kindling) a charakterizovanej menej výraznou smrťou neurónov sa intenzita neurogenézy zvyšuje iba v neskorej fáze kindlingu, keď sa v hipokampe pozoruje poškodenie a smrť neurónov. Ukázalo sa, že pri epilepsii záchvatová aktivita stimuluje neurogenézu s abnormálnou lokalizáciou nových granulárnych neurónov, z ktorých mnohé sa objavujú nielen v gyrus dentatus, ale aj v hilus. Takéto neuróny majú veľký význam pri vývoji klíčenia machových vlákien, pretože ich axóny tvoria normálne chýbajúce reverzné kolaterály, ktoré tvoria početné synapsie so susednými granulárnymi bunkami.

Použitie regionálnych nervových kmeňových buniek otvára nové perspektívy pre aplikáciu bunkovej transplantácie pri liečbe metabolických a genetických neurodegeneratívnych ochorení, demyelinizačných ochorení a posttraumatických porúch centrálneho nervového systému. Pred vykonaním náhradnej bunkovej transplantácie podľa jednej z metód sa vykonáva ex vivo výber a expanzia požadovaného typu nervových progenitorových buniek s cieľom ich následného zavedenia priamo do poškodenej oblasti mozgu. Terapeutický účinok je v tomto prípade spôsobený nahradením poškodených buniek alebo lokálnym uvoľňovaním rastových faktorov a cytokínov. Táto metóda regeneratívno-plastickej terapie vyžaduje transplantáciu dostatočne veľkého počtu buniek s vopred určenými funkčnými charakteristikami.

Za vhodné by sa mali považovať aj ďalšie štúdie molekulárnych charakteristík a regeneračno-plastického potenciálu zrelých mozgových kmeňových buniek, ako aj schopnosti regionálnych kmeňových buniek rôzneho tkanivového pôvodu transdiferencovať sa. V súčasnosti sa už uskutočnil skríning antigénov hematopoetických kmeňových buniek kostnej drene so stanovením markerovej kombinácie buniek schopných transdiferenciácie na progenitorové bunky nervových kmeňových buniek (CD 133+, 5E12+, CD34-, CD45-, CD24). Boli získané bunky, ktoré in vitro tvoria neurosféry a po transplantácii do mozgu novonarodených imunodeficientných myší tvoria neuróny. Pre bunkovú xenotransplantológiu sú zaujímavé výsledky štúdií o možnosti krížovej transplantácie kmeňových buniek u jedincov evolučne vzdialených taxónov. Výsledky implantácie nervových kmeňových buniek do oblasti mozgového nádoru zostávajú bez riadnej interpretácie: transplantované bunky aktívne migrujú v celom objeme nádoru bez toho, aby prekročili jeho hranice, a keď sú bunky zavedené do intaktnej časti mozgu, pozoruje sa ich aktívna migrácia smerom k nádoru. Otázka biologického významu takejto migrácie zostáva otvorená.

Treba poznamenať, že úspešná transplantácia nervových kmeňových buniek, ako aj iných nervových progenitorových buniek získaných z embryonálnych kmeňových buniek (ESC), je možná len pri použití vysoko purifikovaných nervových progenitorových buniek, pretože nediferencované embryonálne kmeňové bunky sa pri transplantácii dospelému imunokompetentnému príjemcovi nevyhnutne transformujú na teratómy a teratokarcinómy. Aj minimálne množstvo slabo diferencovaných buniek v suspenzii darcovských buniek prudko zvyšuje tumorigenicitu transplantátu a neprijateľne zvyšuje riziko vzniku nádoru alebo tvorby ne-nervového tkaniva. Získanie homogénnych populácií nervových progenitorových buniek je možné pri použití buniek, ktoré vznikajú v určitých štádiách normálnej embryogenézy, ako alternatívneho zdroja darcovského tkaniva. Ďalší prístup zahŕňa starostlivú elimináciu nežiaducich bunkových populácií prostredníctvom selekcie špecifickej pre danú líniu. Nebezpečné je aj použitie ESC na neurotransplantáciu po ich nedostatočnom vystavení rastovým faktorom in vitro. V tomto prípade nemožno vylúčiť zlyhanie programu nervovej diferenciácie s tvorbou štruktúr vlastných nervovej trubici.

Dnes je celkom zrejmé, že nervové kmeňové bunky vykazujú tropizmus k patologicky zmeneným oblastiam centrálneho nervového systému a majú výrazný regeneračno-plastický účinok. Mikroprostredie v mieste úmrtia buniek nervového tkaniva modeluje smer diferenciácie transplantovaných buniek, čím dopĺňa deficit špecifických nervových prvkov v zóne poškodenia CNS. Pri niektorých neurodegeneratívnych procesoch vznikajú neurogénne signály pre rekapituláciu neurogenézy a nervové kmeňové bunky zrelého mozgu sú schopné reagovať na tieto poučné informácie. Početné experimentálne údaje slúžia ako jasná ilustrácia terapeutického potenciálu nervových kmeňových buniek. Intracisternálne podanie klonu nervových kmeňových buniek zvieratám s ligáciou strednej mozgovej tepny (model ischemickej cievnej mozgovej príhody) pomáha zmenšiť plochu a objem deštruktívne zmenenej oblasti mozgu, najmä v prípade transplantácie nervových kmeňových buniek spolu s FGF2. Imunocytochemicky sa pozoruje migrácia darcovských buniek do ischemickej zóny s ich následnou integráciou s intaktnými mozgovými bunkami príjemcu. Transplantácia nezrelých buniek myšej neuroepiteliálnej línie MHP36 do mozgu potkanov s experimentálnou mozgovou príhodou zlepšuje senzomotorické funkcie a zavedenie týchto buniek do mozgových komôr posilňuje kognitívne funkcie. Transplantácia nervovo preformovaných hematopoetických buniek ľudskej kostnej drene potkanom eliminuje dysfunkciu mozgovej kôry spôsobenú ischemickým poškodením. V tomto prípade xenogénne nervové progenitorové bunky migrujú z miesta vpichu do zóny deštruktívnych zmien v mozgovom tkanive. Intrakraniálna transplantácia homológnych buniek kostnej drene pri traumatickom poškodení mozgovej kôry u potkanov vedie k čiastočnému obnoveniu motorických funkcií. Darcovské bunky sa uchytia, proliferujú, podliehajú nervovej diferenciácii na neuróny a astrocyty a migrujú smerom k lézii. Po injekcii do striata dospelých potkanov s experimentálnou mozgovou príhodou klonované ľudské nervové kmeňové bunky nahradia poškodené bunky CNS a čiastočne obnovia zhoršenú mozgovú funkciu.

Ľudské nervové kmeňové bunky sa izolujú prevažne z embryonálneho telencefalonu, ktorý sa vyvíja oveľa neskôr ako kaudálne umiestnené časti nervového kmeňa. Bola preukázaná možnosť izolácie nervových kmeňových buniek z miechy 43-137 dní starého ľudského plodu, pretože v prítomnosti EGF a FGF2 tieto bunky tvoria neurosféry a vykazujú multipotenciu v skorých pasážach, pričom sa diferencujú na neuróny a astrocyty. Dlhodobá kultivácia nervových progenitorových buniek (viac ako 1 rok) ich však zbavuje multipotencie - takéto bunky sú schopné diferencovať sa iba na astrocyty, t. j. stávajú sa unipotentnými. Regionálne nervové kmeňové bunky je možné získať v dôsledku parciálnej bulbektómie a po reprodukcii v kultúre v prítomnosti LIF transplantovať tomu istému pacientovi s neurodegeneratívnymi zmenami v iných častiach centrálneho nervového systému. V klinike bola prvýkrát vykonaná substitučná bunková terapia s použitím nervových kmeňových buniek na liečbu pacientov s mozgovou príhodou sprevádzanou poškodením bazálnych ganglií mozgu. V dôsledku transplantácie darcovských buniek sa zaznamenalo zlepšenie klinického stavu väčšiny pacientov.

Niektorí autori sa domnievajú, že schopnosť nervových kmeňových buniek uchytiť sa, migrovať a integrovať sa do rôznych oblastí nervového tkaniva v prípade poškodenia CNS otvára neobmedzené možnosti bunkovej terapie nielen lokálnych, ale aj rozsiahlych (mŕtvica alebo asfyxia), multifokálnych (skleróza multiplex) a dokonca aj globálnych (väčšina dedičných metabolických porúch alebo neurodegeneratívnych demencií) patologických procesov. Keď sa klonované myšie a ľudské nervové kmeňové bunky transplantujú do recipientných zvierat (myší a primátov) s degeneráciou dopaminergných neurónov v mezostriatálnom systéme indukovanou zavedením metylfenyltetrapyridínu (model Parkinsonovej choroby) 8 mesiacov pred transplantáciou, darcovské nervové kmeňové bunky sa integrujú do CNS príjemcu. O mesiac neskôr sú transplantované bunky lokalizované bilaterálne pozdĺž stredného mozgu. Niektoré z výsledných neurónov darcovského pôvodu exprimujú tyrozínhydrolázu bez známok imunitnej reakcie na transplantát. U potkanov, ktorým bol podávaný 6-hydroxydopamín (ďalší experimentálny model Parkinsonovej choroby), bola adaptácia transplantovaných buniek na mikroprostredie v mozgu hostiteľa určená podmienkami kultivácie nervových kmeňových buniek pred ich transplantáciou. Nervové kmeňové bunky, rýchlo proliferujúce in vitro pod vplyvom EGF, kompenzovali deficit dopaminergných neurónov v poškodenom striate účinnejšie ako bunky z 28-dňových kultúr. Autori sa domnievajú, že je to spôsobené stratou schopnosti vnímať zodpovedajúce diferenciačné signály počas procesu bunkového delenia nervových progenitorových buniek in vitro.

V niektorých štúdiách sa uskutočnili pokusy o zvýšenie účinnosti vplyvu na procesy reinervácie poškodeného striata transplantáciou embryonálnych buniek striata do tejto oblasti ako zdroja neurotrofických faktorov so súčasnou transplantáciou dopaminergných neurónov ventrálneho mezencefalonu. Ukázalo sa, že účinnosť neurotransplantácie do značnej miery závisí od spôsobu zavedenia embryonálneho nervového tkaniva. V dôsledku štúdií o transplantácii preparátov embryonálneho nervového tkaniva do ventrikulárneho systému mozgu (aby sa predišlo poraneniu parenchýmu striata) sa získali informácie o ich pozitívnom vplyve na motorickú poruchu pri Parkinsonizme.

V iných štúdiách však experimentálne pozorovania ukázali, že transplantácia preparátov embryonálneho nervového tkaniva ventrálneho mezencefalu obsahujúcich dopaminergné neuróny do mozgovej komory, ako aj transplantácia GABA-ergných embryonálnych nervových elementov do striata potkanov s hemiparkinsonizmom, nepodporuje obnovenie poškodených funkcií dopaminergného systému. Naopak, imunocytochemická analýza potvrdila údaje o nízkej miere prežitia dopaminergných neurónov ventrálneho mezencefalu transplantovaných do striata potkanov. Terapeutický účinok intraventrikulárnej transplantácie embryonálneho nervového tkaniva ventrálneho mezencefalu sa dosiahol iba za podmienky súčasnej implantácie preparátu embryonálnych striatálnych buniek do denervovaného striata. Autori sa domnievajú, že mechanizmus tohto účinku je spojený s pozitívnym trofickým účinkom GABA-ergných elementov embryonálneho striata na špecifickú dopaminergnú aktivitu intraventrikulárnych transplantátov ventrálneho mezencefalu. Výrazná gliová reakcia v transplantátoch bola sprevádzaná miernou regresiou parametrov apomorfínového testu. To zase korelovalo s obsahom GFAP v krvnom sére, čo priamo naznačovalo porušenie priepustnosti hematoencefalickej bariéry. Na základe týchto údajov autori dospeli k záveru, že hladina GFAP v krvnom sére môže byť použitá ako adekvátne kritérium na posúdenie funkčného stavu transplantátu a zvýšená priepustnosť hematoencefalickej bariéry pre neurospecifické antigény, ako je GFAP, je patogenetickým článkom vo vývoji zlyhania transplantátu v dôsledku autoimunitného poškodenia nervového tkaniva príjemcu.

Z pohľadu iných výskumníkov je uchytenie a integrácia nervových kmeňových buniek po transplantácii stabilná a celoživotná, pretože darcovské bunky sa u príjemcov nachádzajú najmenej dva roky po transplantácii a bez významného poklesu ich počtu. Pokusy vysvetliť to skutočnosťou, že v nediferencovanom stave nervové kmeňové bunky neexprimujú molekuly MHC triedy I a II na úrovni dostatočnej na vyvolanie imunitnej rejekčnej reakcie, možno považovať za pravdivé iba vo vzťahu k nízko diferencovaným nervovým prekurzorom. Nie všetky nervové kmeňové bunky v mozgu príjemcu sa však zachovávajú v nezrelom dormantnom stave. Väčšina z nich podlieha diferenciácii, počas ktorej sú molekuly MHC exprimované v plnom rozsahu.

Najmä nedostatočná účinnosť použitia intrastriatálnej transplantácie embryonálnych ventrálnych mezencefalických prípravkov obsahujúcich dopaminergné neuróny na liečbu experimentálneho parkinsonizmu je spojená s nízkou mierou prežitia transplantovaných dopaminergných neurónov (iba 5 – 20 %), ktorá je spôsobená reaktívnou gliózou sprevádzajúcou lokálnu traumu mozgového parenchýmu počas transplantácie. Je známe, že lokálna trauma mozgového parenchýmu a sprievodná glióza vedú k narušeniu integrity hematoencefalickej bariéry s uvoľňovaním antigénov nervového tkaniva, najmä OCAR a neurónovo-špecifického antigénu, do periférnej krvi. Prítomnosť týchto antigénov v krvi môže spôsobiť tvorbu špecifických cytotoxických protilátok proti nim a rozvoj autoimunitnej agresie.

V. Tsymbalyuk a spoluautori (2001) uvádzajú, že stále platí tradičný pohľad, podľa ktorého je centrálny nervový systém imunologicky privilegovanou zónou izolovanou od imunitného systému hematoencefalickou bariérou. Vo svojom prehľade literatúry autori citujú množstvo prác, ktoré naznačujú, že tento pohľad úplne nezodpovedá podstate imunitných procesov v mozgu cicavcov. Bolo zistené, že značené látky zavedené do mozgového parenchýmu sa môžu dostať do hlbokých krčných lymfatických uzlín a po intracerebrálnej injekcii antigénov sa v tele tvoria špecifické protilátky. Bunky krčných lymfatických uzlín reagujú na takéto antigény proliferáciou, ktorá začína 5. deň po injekcii. Tvorba špecifických protilátok bola zistená aj počas transplantácie kože do mozgového parenchýmu. Autori prehľadu uvádzajú niekoľko hypotetických dráh transportu antigénov z mozgu do lymfatického systému. Jednou z nich je prechod antigénov z perivaskulárnych priestorov do subarachnoidálneho priestoru. Predpokladá sa, že perivaskulárne priestory lokalizované pozdĺž veľkých ciev mozgu sú ekvivalentom lymfatického systému v mozgu. Druhá cesta vedie pozdĺž bielych vlákien - cez etmoidálnu kosť do lymfatických ciev nosovej sliznice. Okrem toho existuje rozsiahla sieť lymfatických ciev v tvrdej hmote. Nepriepustnosť hematoencefalickej bariéry pre lymfocyty je tiež dosť relatívna. Bolo dokázané, že aktivované lymfocyty sú schopné produkovať enzýmy, ktoré ovplyvňujú priepustnosť štruktúr mozgu „imunitného filtra“. Na úrovni postkapilárnych venúl prenikajú aktivované T-pomocné bunky cez intaktnú hematoencefalickú bariéru. Téza o absencii buniek v mozgu, ktoré reprezentujú antigény, neobstojí kritike. V súčasnosti je presvedčivo dokázaná možnosť reprezentácie antigénov v CNS najmenej tromi typmi buniek. Po prvé, ide o dendritické bunky pochádzajúce z kostnej drene, ktoré sú lokalizované v mozgu pozdĺž veľkých ciev a v bielej hmote. Po druhé, antigény sú schopné prezentovať endotelové bunky mozgových ciev a v spojení s antigénmi MHC podporujú klonálny rast T buniek špecifických pre tieto antigény. Po tretie, mikro- a astrogliálne bunky pôsobia ako antigén prezentujúce látky. Astrocyty sa podieľajú na tvorbe imunitnej odpovede v centrálnom nervovom systéme, získavajú vlastnosti imunitných efektorových buniek a exprimujú množstvo antigénov, cytokínov a imunomodulátorov. Pri inkubácii s γ-interferónom (γ-INF) astrogliálne bunky in vitro exprimujú antigény MHC triedy I a II a stimulované astrocyty sú schopné prezentácie antigénov a udržiavania klonálnej proliferácie lymfocytov.

Trauma mozgového tkaniva, pooperačný zápal, edém a fibrínové usadeniny sprevádzajúce transplantáciu embryonálneho nervového tkaniva vytvárajú podmienky pre zvýšenú permeabilitu hematoencefalickej bariéry so zhoršenou autotoleranciou, senzibilizáciou a aktiváciou CD3+CD4+ lymfocytov. Prezentáciu auto- a aloantigénov vykonávajú astrocyty a mikrogliálne bunky, ktoré reagujú na y-INF expresiou molekúl MHC, ICAM-1, LFA-I, LFA-3, kostimulačných molekúl B7-1 (CD80) a B7-2 (CD86), ako aj sekréciou IL-la, IL-ip a y-INF.

V dôsledku toho skutočnosť dlhšieho prežitia embryonálneho nervového tkaniva po intracerebrálnej transplantácii ako po jeho periférnom podaní možno len ťažko spájať s absenciou iniciácie transplantačnej imunity. Navyše, monocyty, aktivované lymfocyty (cytotoxické CD3+CD8+ a T-pomocné bunky) a cytokíny, ktoré produkujú, ako aj protilátky proti antigénom periférneho transplantátu embryonálneho nervového tkaniva zohrávajú hlavnú úlohu v procese jeho odmietnutia. Nízka úroveň expresie molekúl MHC v embryonálnom nervovom tkanive má určitý význam pri vytváraní podmienok pre dlhšiu odolnosť neurotransplantátov voči imunitným procesom T-buniek. Preto sa v experimente imunitný zápal po transplantácii embryonálneho nervového tkaniva do mozgu vyvíja pomalšie ako po štepení kože. Napriek tomu sa po 6 mesiacoch pozoruje úplná deštrukcia jednotlivých transplantátov nervového tkaniva. V tomto prípade sú T-lymfocyty obmedzené antigénmi MHC triedy II prevažne lokalizované v transplantačnej zóne (Nicholas a kol., 1988). Experimentálne sa zistilo, že počas xenologickej neurotransplantácie deplécia T-helperov (L3T4+), ale nie cytotoxických T-lymfocytov (Lyt-2), predlžuje prežitie nervového tkaniva potkanov v mozgu recipientných myší. Odmietnutie neurotransplantátu je sprevádzané jeho infiltráciou hostiteľskými makrofágmi a T-lymfocytmi. V dôsledku toho hostiteľské makrofágy a aktivované mikrogliálne bunky pôsobia in situ ako imunostimulačné bunky prezentujúce antigén a zvýšená expresia antigénov MHC triedy I darcu zvyšuje zabíjaciu aktivitu cytotoxických T-lymfocytov príjemcu.

Nemá zmysel analyzovať početné špekulatívne pokusy vysvetliť fakt odmietnutia neurotransplantátu reakciou imunitného systému príjemcu na endotelové bunky alebo gliové elementy darcu, pretože aj čisté línie neurálnych progenitorových buniek sú vystavené imunitnému útoku. Je pozoruhodné, že expresia Fas ligandov mozgovými bunkami, ktoré viažu apoptózne receptory (molekuly Fas) na T lymfocytoch infiltrujúcich mozog a indukujú ich apoptózu, zohráva dôležitú úlohu v mechanizmoch dlhšieho prežitia transplantátu v rámci CNS, čo je typický ochranný mechanizmus transbariérových autoimunogénnych tkanív.

Ako správne poznamenávajú V. Tsymbalyuk a spoluautori (2001), transplantácia embryonálneho nervového tkaniva je charakterizovaná rozvojom zápalu za účasti buniek senzibilizovaných na mozgové antigény a aktivovaných buniek, protilátok, a tiež v dôsledku lokálnej produkcie cytokínov. Dôležitú úlohu v tom zohráva už existujúca senzibilizácia organizmu na mozgové antigény, ktorá sa vyskytuje počas rozvoja ochorení CNS a môže byť zameraná na transplantačné antigény. Preto sa skutočne dlhodobé prežitie histoinkompatibilných neurotransplantátov dosahuje iba potlačením imunitného systému cyklosporínom A alebo zavedením monoklonálnych protilátok do CD4+ lymfocytov príjemcu.

Mnohé problémy neurotransplantácie teda zostávajú nevyriešené, vrátane problémov súvisiacich s imunologickou kompatibilitou tkanív, ktoré možno vyriešiť až po cielenom základnom a klinickom výskume.