Hemopoetické kmeňové bunky pupočníkovej krvi

Plienková krv pôsobí ako zdroj hematopoetických kmeňových buniek na schopnosti proliferácie a repopulácie hematopoetických buniek. Bolo opakovane preukázané, že pri pôrode pupočníková krv obsahuje dostatočne veľký počet zlých hematopoetických progenitorových buniek. Niektorí autori sa domnievajú, že výhodou transplantácie hematopoetických kmeňových buniek pupočníkovej krvi je to, že nie je potrebné hľadať donora kompatibilného s HLA antigénmi. Podľa nich nezrelosť imunitného systému spôsobuje, že novorodenca znížená funkčnú aktivitu imunokompetentných buniek, a teda nižšie ako v transplantáciu kostnej drene, bol výskyt závažného reakcia "štep verzus hostiteľ". V tomto transplantáciu buniek prežitie pupočníkovej krvi nie je nižšia ako bunky kostnej drene, a to aj v prípade použitia menšieho počtu GSK podávaného na 1 kg hmotnosti pacienta. Avšak, podľa nášho názoru optimálny počet otázok transplantované pupočníkovej krvi bunky nevyhnutné pre efektívne štepu v tele príjemcu, ich imunologickú kompatibilitu a rad ďalších aspektov transplantácie krvotvorných kmeňových buniek pupočníkovej krvi vyžaduje oveľa vážnejšie analýzu.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10]

Získanie hematopoetických kmeňových buniek pupočníkovej krvi

Postup na získanie krvotvorných kmeňových buniek z pupočníkovej krvi si vyžaduje jeho príjem ihneď po narodení a jeho oddelenie od placenty, kedy placenta v maternici alebo ex maternici, rovnako ako pre cisárskym rezom, ale aj ex utero. Je ukázané, že v prípade, že skrátenie doby od narodenia novonarodeným tým, placentárnu separácia až 30 sekúnd objemu pupočníkovej krvi získaných zvyšuje v priemere o 25-40 ml. Pri neskoršom postupe sa stratí rovnaké množstvo krvi. Bolo zistené, že včasným oddelenie dieťaťa z placenty nepredstavuje žiadne negatívne dôsledky pre novorodencov.

Ruská Výskumný ústav hematológie a krvnej transfúzie vyvinutý účinný a nízkymi nákladmi technológie pre pupočníkovej krvi pri fyziologických línií ((70,2 + 25,8) ml) a cisárskym rezom ((73,4 + 25,1) ml). Spôsob separácie pupočníkovej krvi s dostatočne vysokým výťažkom mononukleárnych buniek a nukleace - (83,1 + 9,6) a (83,4 + 14,1)%, v danom poradí. Zlepšený spôsob kryokonzervácie pupočníkovej krvi, ktorý zaisťuje vysokú bezpečnosť mononukleárnych buniek a CFU-GM - (96,8 + 5,7) a (89,6 + 22,6)%, v tomto poradí. Bola stanovená účinnosť odtokovej metódy odberu vzoriek pupočníkovej krvi pomocou kontajnera "Kompoplast-300" (Rusko). Plotové pupočníkovej krvi autori vykonáva ihneď po pôrode a jej oddelenie od placenty, pokiaľ ide o umiestnenie placenty v maternici alebo ex maternici. Pred punkciou pupočnej žily pupočnej šnúry raz pridá 5% tinktúra jódu, a potom dvakrát - 70% etylalkoholu. Krv pretekala spontánne cez spojovacie trubice do zásobníka. Trvanie plotu trvalo maximálne 10 minút. 66 zhromaždené metóda objem drenážne Vzorky pupočníkovej krvi v priemere (72 + 28) ml a počet leukocytov vo vzorke priemeru plný - (1,1 + 0,6) x x 107. Analýza pupočníkovej krvi na sterilitu (bakteriálna kontaminácia, HIV-1, vírusy hepatitídy B a C, syfilis a cytomegalovírusom infekcie) v jednej vzorke boli identifikované IgG-protilátky hepatitídy C v inej štúdii raz placenty po fetálny povrch narodení bol umiestnený na špeciálnom ráme smerom nadol, bol kord upravovaný s 5% roztoku jódu a 75% etylu th alkohol. Žily pupočníka boli odvodnené ihlou z transfúzneho systému (G16). Krv sa vyprázdnila do zásobníka spontánne. Takto získaný objem krvi bol priemerný (55 + 25) ml. Papier G. Koglerových et al (1996), pupočníkovej krvi vziať uzavretý spôsob a získa veľké objemy krvi - v priemere (79 + 26) ml. Autori na vedomie, že medzi 574 šnúry krvné vzorky obsahujú približne 7% nižšia ako 40 ml krvi, čo neumožňuje ich využitie pre transplantáciu. K. Isoyama et al (1996), pričom sa krv kábel aktívny exfusion za použitia injekčnej striekačky, dostal v priemere 69,1 ml krvi (objem pupočníkovej krvi sa pohybovala od 15 do 135 ml). A konečne, A. Abdel-Mageed PI spolupracovníci (1997) od punovinnoy žilovej katetrizácia boli získané v priemere 94 ml pupočníkovej krvi (od 56 do 143 ml).

Aby sa znížilo riziko iatrogénnou infekcie a kontaminácie materských sekrétov rozvinutých uzavretý systém zberu krvi založený na široko používaný transfuzioinoy systému Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL (USA), ktorý obsahuje 62,5 ml CPDA (citrát-fosfát-dextrózu s adenínu), ako je antikoagulačný. Technológie pre výrobu materiálu má prvoradý význam pre prípravu kvalitnej vzorky vzhľadom na množstvo obsahu a čistoty bunkovej suspenzie. Z existujúcich metód pupočníkovej odber krvi, kotoryeuslovno klasifikované do uzavretej, polootvorené a otvorený systém sleduetotdavat prednostne najprv, ako je v uzavretom systéme, výrazne znižuje riziko mikrobiálnej kontaminácie materiálu, ako aj znečistenie bunkovej suspenzie z materskej bunky.

A. Nagler a spoluautorov (1998) vykonali komparatívnu analýzu účinnosti všetkých troch systémov odberu vzoriek z pupočníkovej krvi. V prvej variante sa postup uskutočňoval v uzavretom systéme exfúziou krvi priamo do kontajnera. V druhej variante sa pupočníková krv získala metódou aktívnej krvnej exfúzie injekčných striekačiek1 s ďalším premytím žíl placenty a súčasným odvodňovaním krvi do kontajnera (otvorená metóda). V treťom variante bola krv vytiahnutá v polo-otvorenom systéme aktívnym extrakciou striekačkami a premytím tepnou pupočníkovej šnúry súčasnou exfúziou do kontajnera. V prvom vyhotovení, autori získané v objeme pupočníkovej krvi (76,4 + 32,1) ml pri obsahu leukocytov (10,5 + 3,6) x 10 ⁶ v 1 ml krvi. V druhom prevedení, boli zodpovedajúce hodnoty (174,4 + 42,8) ml a (8,8 + 3,4) x 10 ⁶ / ml; Tretia - (173,7 + 41,3) ml a (9,3 + 3,8) x 10 ⁶ / ml. Najčastejšia infekcia vzoriek pupočníkovej krvi bola zaznamenaná pri použití otvoreného systému. Je stanovená priama korelácia medzi hmotnosťou placenty a objemom extrahovanej krvi - s rastúcou placentovou hmotou sa zvyšuje množstvo zozbieranej krvi.

Po odbere vzorky pupočníkovej krvi nasleduje separačný krok - izolácia mononukleárnych buniek a čistenie bunkovej suspenzie z erytrocytov. Za experimentálnych podmienok sa nukleované bunky izolujú metódou ich sedimentácie metylcelulózou počas lýzy erytrocytov amónneho chloridom. Na klinické účely by sa však nemala používať metylcelulóza, keďže strata hematopoetických kmeňových buniek dosiahla 50-90%. Lýzou červených krviniek v súvislosti s veľkými objemami pracovného roztoku na klinike tiež ťažko realizuje, aj keď percento separácia týmto spôsobom jadrových buniek s fenotypom CD34 + a progenitorové bunky CFU-GM funkcie a CFU-Gemma podstatne vyššia. Bol hlásený nový prostriedok na izoláciu mononukleárnych buniek v roztoku hustoty kúpnej hustoty (BDS72). Táto látka má nasledujúce fyziologické parametre: pH - 7,4, osmolalita - 280 mosm / kg, hustota - 1,0720 g / ml. Podľa autorov je s jej pomocou možné izolovať až 100% CD34-pozitívnych buniek a odstrániť 98% červených krviniek. Klinika však ešte neuplatňuje BDS72.

Tieto separačné metódy Testované jadrovej bunky z pupočníkovej krvi sa zvyčajne používa 10% roztok HES alebo 3% roztokom želatíny. Účinnosť precipitácie erytrocytov a izolácia nukleovaných buniek je v oboch prípadoch približne rovnaká. Avšak, v prípade použitia ako želatína sedimentujúca činidlo možné získať o niečo väčší počet CFU-GM, ako pri použití HES. Predpokladá sa, že rozdiel v účinnosti zotavenie CFU-GM nerovnakej rýchlosti v dôsledku ukladania jednotlivých frakcií alebo jadrové bunky výkonnostných HES molekúl absorbovaných na hematopoetických bunkové povrchové receptory, a tak blokovať ich citlivosť na faktory stimulujúce kolónie, ktoré sa používajú pri kultivácii CFU-GM in vitro. Avšak ako sedimenter môže tiež byť vhodné pre izoláciu jadrových buniek pri vytváraní rozsiahlych banky pupočníkovej krvi.

Metódy oddeľovania a kryokonzervácie pupočníkovej krvi sa v zásade nelíšia od metód používaných pri liečbe krvotvorných kmeňových buniek periférnej krvi a kostnej drene dospelých darcov. Pri príprave veľkého množstva vzoriek pupočníkovej krvi pre svoje banky je však potrebné, aby metódy oddelenia boli predovšetkým nízke. Preto sa teraz, bohužiaľ, používajú už bežné klinické potreby bežných metód izolácie a kryokonzervácie buniek z pupočníkovej krvi a efektívnejšie, ale finančne účinné metódy zostávajú veľa experimentátorov.

Celkové hodnotiace kritériá etablovali krvotvorných požiadavky na počet buniek a na štúdium vzoriek pupočníkovej krvi za účelom zistenia infekčné agens. V záujme ochrany transplantáciu krvotvorných krvných buniek z pupočníkovej, plná krv by mali byť skúmané predovšetkým infekcií prenášaných hematogénne a genetických chorôb. Niektorí autori odporúčajú ďalšie špeciálne metódy štúdia pupočníkovej krvi na účely diagnostiky genetických chorôb, ako thalassemia a kosáčiková anémia, adenozín deamináza deficitu, agamaglobulinémiou Bruton, ochorenia Harlera a stávkara.

Podľa odporúčaní Ticheli L. Et al (1998), v každej vzorke pupočníkovej krvi, je potrebné určiť počet jadrových buniek, SB34-pozitívnych buniek a CFU-GM, niesť HLA-písanie pre určenie krvnou skupinou ABO a Rh jeho členstva. Okrem toho, očkovanie sa vykonáva bakteriologické, sérologické testy na HIV a infekcie CMV, HBsAg, hepatitídy C, HTLY-I a HTLV-II (T-bunkové leukemické, človek), syfilis, toxoplazmózy. Polymerázová reťazová reakcia na infekciu cytomegalovírusom a HIV je povinná.

Samotný postup na získanie pupočníkovej krvi by mal byť vykonávaný v prísnom súlade so zásadami lekárskej bioetiky. Pred začiatkom odberu krvi je potrebné získať súhlas tehotnej ženy na jej vykonanie. Predbežný rozhovor s tehotnou ženou na získanie informovaného súhlasu na vykonanie všetky manipulácie, pretože krv exfusion plnenie a dokončovanie dokumentov sa vykonáva len zdravotníckymi pracovníkmi. V každom prípade neprípustný vykonávajúcim týchto postupov pracovníkov s biologickou, chemický, farmaceutický a iné nelekárske vzdelávania, s ohľadom na porušenie stanovených noriem bioethics a ľudských práv. Pre pozitívne testy na nosnej HBsAg, protilátky proti pôvodcu hepatitídy C, HIV a syfilis pupočníkovej krvi neberú a odobratej vzorky krvi je už odstránený a zničený. Je potrebné poznamenať, že preprava latentných infekcií u novorodencov je oveľa vzácnejšie ako u dospelých, a preto pravdepodobnosť hematogénne prenosu a rozvoja infekčných komplikácií krvotvorných infúziách pupočníkovej krvi buniek je výrazne nižšia ako v prípade transplantácie kostnej drene od dospelých darcov.

Dôležitým bodom aplikácie pupočníkovej krvi na klinike je zhodnotenie štepu, ktorý je založený na kvantifikáciu krvotvorných buniek vo vzorke pupočníkovej krvi buniek a v dávkach potrebných pre transplantáciu. Normy pre optimálny počet buniek z pupočníkovej krvi potrebných na transplantáciu ešte neboli vyvinuté. Neexistuje všeobecne prijateľné hľadisko ani na takých rutinných parametroch, ako je počet CD34-pozitívnych buniek a CFU-GM. Niektorí autori hodnotia potenciál krvotvorných buniek analýzou dlhodobých kultúrach sa stanovenie obsahu jednotiek pre tvorbu kolónií, ktoré sú spoločné granulocyty, erytrocyty, monocyty a megakaryocytov - CFU-GEMMA.

V klinických situáciách štandardné hodnotenie transplantácie pupočníkovej krvi zvyčajne zahŕňa len stanovenie počtu jadrových alebo mononukleárnych buniek.

Skladovanie hematopoetických kmeňových buniek pupočníkovej krvi

Niektoré problémy existujú v technológii uchovávania hemopoetických krvných buniek krvného obehu. Keď kryokonzervácia krvotvorných kmeňových buniek, aby sa dosiahlo optimálneho režimu zmrazovanie sa minimalizovať množstvo pupočníkovej krvi a červenými krvinkami skôr odstránená, aby sa zabránilo hemolýze a riziko nezlučiteľnosti reakcie antigénom erytrocytov (ABO, Rh). Na tieto účely sú vhodné rôzne spôsoby izolácie nukleovaných buniek. Na začiatku 90. Rokov minulého storočia najrozšírenejší spôsob separácie jadrových buniek v gradientu hustoty Ficoll na báze s hustotou 1,077 g / ml, alebo perkoláciou s hustotou 1,080 g / ml. Separácia pupočníkovej krvi hustotním gradientu umožňuje zvoliť prevažne mononukleárny bunky, ale vedie k značným stratám krvotvorných progenitorových buniek, - až do 30-50%.

Sedimentačná účinnosť hydroxyetylškrobu v procese izolácie buniek z pupočníkovej krvi sa odhaduje rôznymi spôsobmi. Niektorí autori naznačujú nízku kvalitu oddeľovania pomocou tejto metódy, zatiaľ čo iní vedci naopak spomedzi všetkých možných metód dávajú prednosť rozdeleniu HSC pupočníkovej krvi presne pomocou 6% roztoku hydroxyetylškrobu. To poukazuje na vysokú účinnosť sedimentácie hemopoetických buniek, ktorá podľa niektorých údajov dosahuje od 84% do 90%.

Zastáncové iného hľadiska si, že takmer všetky procesy frakcionácie zahŕňať veľké straty yadrosoderzhashih buniek a ponúknuť, aby oddelenie odstredením, oddelením krv šnúry na 3 frakcie: erytrocytov, leukocytov a plazmy v kruhu. Oddeľovanie buniek týmto spôsobom, vynálezcovia zistili, že obsah mononukleárnych buniek skorých hematopoetických progenitorových buniek a buniek s CD34 + imunofenotypoch nakoniec bol v tomto poradí 90, 88 a 100% pôvodnej úrovne. Podobné množstvo čisteného rastu v tomto spôsobe pupečníkových krvných buniek, získaných inými výskumníkmi: Po sedimentácii nukleované pridelilo 92%, 98% - mononukleárny, 96% - CD34-pozitívne bunky, a 106% jednotiek tvoriacich kolónie.

Koncom deväťdesiatych rokov bola želatína široko používaná ako sedimentačné činidlo. V klinickej praxi, s použitím želatíny krvotvorné kmeňové bunky izolované z pupočníkovej krvi už od roku 1994. Pri použití 3% roztoku želatíny dosahuje účinnosť izolácie nukleovaných buniek 88-94%. Široké používanie želatíny pri vývoji pupočníkovej krvi potvrdilo svoje výhody oproti ostatným sedimentačným činidlám. Porovnávacia analýza všetkých vyššie uvedených spôsobov izolácie jadrových buniek z hľadiska ich následné použitie v každom zo vzoriek testu pupočníkovej krvi ukázali, že optimálna mononukleárny bunky sedimenter-out s fenotypom CD34 + / CD45 +, ako aj počet CFU-GM a CFU-Gemma je 3% roztoku želatíny. Ukázalo sa, že podstatne menej účinné metódy za použitia gradientu Ficoll hustoty, a použitia metylcelulóza a hydroxyetylškrob, v ktorom hematopoetických strata buniek dosiahol 60%.

Rozšírenie objemu transplantácie kmeňových buniek pupočníkovej krvi súvisí nielen s vývojom metód ich produkcie, ale aj s ukladaním. Existuje veľa problémov priamo súvisiacich s prípravou pupočníkovej krvi na dlhodobé uchovávanie a výberom optimálnej technológie kryokonzervácie pre jej vzorky. Medzi nimi sú otázky účelnosti vykonávania separačných postupov, použitia rôznych kryoprezervačných prostriedkov a použitie metód na prípravu roztopených buniek na transplantáciu. Preprava prírodných vzoriek pupočníkovej krvi sa často vykonáva z oblastí vzdialených od hematologických centier. V súvislosti s tým vzniká problém prípustných období skladovania pupočníkovej krvi od okamihu jej príjmu až po začiatok kryokonzervácie, čo je obzvlášť dôležité pri vývoji banky pupočníkovej krvi.

Štúdia funkčné aktivity krvotvorných pupočníkovej krvi buniek po dlhodobom skladovaní (do 12 rokov) v kvapalnom dusíku bolo zistené, že asi 95% z krvotvorných buniek počas tejto doby nestrácajú svoju vysokú proliferačnú kapacitu. Papier Yurasova S. Et al (1997) ukázali, že pupočníkovej krvi skladovať pri izbovej teplote (22 ° C) alebo pri teplote 4 ° C počas 24 a 48 hodín podstatne neznižuje životaschopnosť krvotvorných buniek, že počiatočná koncentrácia je s výhodou 92 a 88%. Ak sa však doba skladovania predlžuje na tri dni, počet životaschopných nukleovaných buniek v pupočníkovej krvi sa významne zníži. V rovnakej dobe, ďalšie štúdie zistila, že v priebehu skladovania po dobu 2-3 dní pri teplote 22 ° C alebo 4 ovplyvnená predovšetkým životaschopnosť zrelých granulocytov, ale nie krvotvorné bunky.

Životaschopnosť krvotvorných kmeňových buniek pupočníkovej krvi môže byť nepriaznivo ovplyvnená systémovými zložkami na jej zber. Analýza účinku rôznych antikoagulanty, ktoré akčný mechanizmus je vzhľadom k viazaniu iónov vápnika (ACD, EDTA, XAPD-1) na krvných progenitorových buniek v podmienkach pupočníkovej krvi uchovávanie 24 až 72 hodín ukázalo ich negatívny vplyv na životaschopnosť jadrových buniek. V tejto súvislosti, autori odporúčajú použitie PBS (fosfátový pufer roztok) s prídavkom natívneho heparínu bez konzervačné látky v koncentrácii 20 U / ml, ktoré podľa ich názoru, umožňuje zvýšiť dobu skladovania nefrakcionovaného pupočníkovej krvi do 72 hodín a uloží funkčnú aktivitu kolónie tvoriacich jednotiek. Avšak, v štúdii o zachovaní CFU-GM a CFU-G ukazujú, že pupočná dobu skladovania pupočníkovej krvi pred kryokonzervácia nepresiahla deväť hodín. Je zrejmé, že v tomto prípade by mala pôsobiť zásadu, že v prípade, že je v rozpore, údaje by mali používať minimálnej odporúčanej trvanlivosti pupočníkovej krvi a začať programovateľného buniek zmrazenie izoluje tak rýchlo, ako je to možné.

Pri zmrazení krvotvorných kmeňových buniek pupočníkovej krvi sa zvyčajne používa ako kryoprotektant 10% roztok DMSO. Avšak okrem uvedeného kryoprotektívneho účinku má dimetylsulfoxid v tejto koncentrácii priamy cytotoxický účinok, dokonca aj za podmienky minimálnej expozície krvotvorným bunkám pupočníkovej krvi. Na zníženie cytotoxického účinku DMSO sa aplikuje nulová teplota expozície, zvýšenie rýchlosti všetkých manipulácií a opakované premytie po rozmrazení vzoriek pupočníkovej šnúry.

Ústav hematológie a transfúziológie Akadémie lekárskych vied Ukrajiny rozvíja vedecký smer od roku 1995, ktorého cieľom je študovať pupočníkovú krv ako alternatívny zdroj krvných hemopoetických buniek. Konkrétne boli vyvinuté nové technológie na kryoprezerváciu nízkotepelných hemopoetických buniek nefrakcionovanej a frakcionovanej pupočníkovej krvi. Ako kryoprotektant sa používa lekársky polyvinylpyrolidón s nízkou molekulovou hmotnosťou. Spôsob kryokonzervácie nefrakcionovanej pupočníkovej krvi je založený na pôvodnej technológii predbežnej prípravy buniek na zmrazenie a na technike špeciálneho ošetrenia bunkovej suspenzie bezprostredne pred transplantáciou.

Jedným z najdôležitejších faktorov ovplyvňujúcich úroveň funkčnej aktivity kryokonzervovaných hemopoetických kmeňových buniek je rýchlosť ochladzovania bunkovej suspenzie, najmä počas fázy kryštalizácie. Softvérový prístup k riešeniu problému rýchlosti a času zmrazovania poskytuje veľké príležitosti na vytvorenie jednoduchých a vysoko účinných metód kryokonzervácie bez premývania bunkovej suspenzie z kryoprotektantov pred transplantáciou.

Stupne okamžitého zmrazenia a rozmrazovania sú najnebezpečnejšie pre životaschopnosť buniek počas ich prípravy. Pri zmrazení hemopoetických buniek môže byť značná časť z nich zničená v okamihu prechodu medzibunkového média z kvapaliny na kryštalizáciu v pevnej fáze. Na zníženie percentuálneho podielu úmrtia buniek sa používajú kryoprotektanty, mechanizmy účinku a kryoprotektívna účinnosť boli primerane pokryté vo vedeckej literatúre.

Sľubný smer optimalizácia Techniky kryoprezerváciu kostnej drene a pupočníkovej krvi buniek je kombinovať v rovnakom roztoku s nízkou koncentráciou kryoprotektantů s niekoľkými rôznymi mechanizmami účinku, napríklad pôsobením na intracelulárnej úrovni DMSO a hydroxyetylškrobu alebo albumín majúceho extracelulárnej obopínajúci účinok.

Pre kryokonzervácia krvných buniek pupočníkovej sa tradične používajú 20% roztok DMSO, ktorá je trvalo mechanicky miešanému v ľadovom kúpeli, sa pomaly naleje do suspenzie buniek, aby sa dosiahlo rovnaké (1: 1) pomer objemu bunkovej suspenzie a cryoprotectant. Konečná koncentrácia dimetylsulfoxidu je 10%. Bunková suspenzia sa potom ochladí na softvérovom kryostatu s rýchlosťou HS / min až -40 ° C, po čom sa rýchlosť ochladzovania zvýši na 10 ° C / min. Po dosiahnutí -100 ° C sa nádoba s bunkovou suspenziou umiestni do tekutého dusíka (-196 ° C). Pri tejto metóde kryokonzervácie dosiahne bezpečnosť funkčne aktívnych mononukleárnych buniek po rozmrazení 85% počiatočnej hladiny.

Modifikácie spôsobov kryokonzervácie sú zamerané na zníženie koncentrácie DMSO pridaním hydroxyetylškrobu (konečné koncentrácie dimetylsulfoxidu a hydroxyetylškrobu sú 5% resp. 6%). Vysoká účinnosť tejto kombinácie kryoprotektantov sa pozoruje, keď je suspenzia myeloidných buniek zmrznutá, bez zníženia cytoprotekcie ako s jedným 10% roztokom dimetylsulfoxidu. Počet životaschopných nukleárnych buniek dosiahol 96,7% východiskovej úrovne a ich funkčná aktivita, odhadnutá počtom CFU-GM, bola 81,8%.

Pri použití dimetylsulfoxidu roztoku pri koncentráciách v rozmedzí od 5 do v kombinácii s 4% hydroxyetylškrob (konečná koncentrácia), 10% zistilo, že zachovanie CD34-pozitívnych buniek v týchto rozmedziach dimetylsulfoxid prakticky bezo zmeny. Zároveň sa v podmienkach zníženia koncentrácie DMSO z 5 až 2,5% je pozorovaná hmota je smrť krvných buniek pupočníkovej - počet živých buniek jednotiek sa znižuje z 85,4 na 12,2%. Ďalší autori tiež k záveru, že je to 5 až 10% roztok dimetylsulfoxidu (v autorskom prevedení - v kombinácii s autológnou sérum) s maximálnou účinnosťou zabezpečiť ochrana buniek počas kryokonzervácia pupočníkovej krvi HSC. Okrem toho, vysoká bezpečnosť postupne zmrazené a rozmrazené bunka je označená v prípade kombinácie 5 alebo 10% DMSO 4% roztokom hydroxyetyl škrobu, a to najmä pri riadenej rýchlosti chladení TOS / min. V ďalšom použitého papiera kryoprotekční riešenie skladajúci sa z troch zložiek už - DMSO, čistený ľudský albumín a RPMI médiom v pomere 1: 4: 5, ktorá bola pridaná k bunkovej suspenzii až do rovnakých objemových pomeroch (konečná koncentrácia DMSO bola 5%). Po rozmrazení vo vodnom kúpeli pri teplote + 4 ° C bola bezpečnosť CFU-GM vyššia ako 94%.

Niektorí autori naznačujú použitie nefrakcionovanej pupočníkovej krvi na kryokonzerváciu, pretože sa počas odstránenia červených krviniek stratia významné množstvá hematopoetických buniek. V tomto uskutočnení sa 10% roztok dimetylsulfoxidu použije na ochranu mononukleárnych buniek pred škodlivým účinkom kryokryštalizácie. Mrazenie sa uskutočňuje pri konštantnej rýchlosti ochladzovania HS / min až -80 ° C, potom sa suspenzia buniek z pupočníkovej krvi ponorí do tekutého dusíka. Pri tejto metóde zmrazovania dochádza k čiastočnej lýze erytrocytov, preto krvné vzorky nevyžadujú frakcionáciu. Po rozmrazení sa bunková suspenzia premýva z voľného hemoglobínu a dimetylsulfoxidu v roztoku ľudského albumínu alebo v autológnom sére pacienta a používa sa na transplantáciu.

Zachovanie krvotvorných progenitorových buniek po rozmrazení nefrakcionovaný pupočníkovej krvi je skutočne vyšší ako frakcionáciu, ale v súvislosti s krioustoychivostyu červených krviniek môže spôsobiť vážne problémy v dôsledku post-transfúzne transfúzia ABO-nekompatibilný červených krviniek. Okrem toho sa výrazne zvyšuje objem uloženej nefrakcionovanej krvi. Z klinického hľadiska, ešte viac s výhodou kryokonzervácia skôr izolovaný a prečistí od ostatných bunkových frakcií krvotvorných buniek pupočníkovej krvi.

Najmä spôsob je kryokonzervácia šnúra krviniek frakcionované umožňuje odstránenie erytrocytov v príprave pre zmrazenie, ktorý používa 6% roztoku hydroxyetylškrobu v kompozícii plazmozameshchath riešení "Stabizol". Po rozmrazení je takto získaná bunková suspenzia pripravená na klinické použitie bez ďalšej manipulácie.

V súčasnosti existuje veľa pomerne účinných spôsobov kryokonzervácie pupočníkovej krvi. Hlavným rozdielom je, že krvné vzorky sú počas fázy prípravy zmrazené nefrakcionované alebo podrobené separácii na bunkové frakcie a zbierané jadrové bunky bez prídavku erytrocytov.

Transplantácia hemopoetických kmeňových buniek pupočníkovej krvi

Na konci 80. Rokov - začiatku 90. Rokov minulého storočia sa zistilo, že pupočníková krv dodávajúca plod počas gravidity je charakterizovaná vysokým obsahom hematopoetických kmeňových buniek. Relatívna jednoduchosť získania buniek pupočníkovej krvi a absencia zjavných etických problémov podporujú používanie kmeňových buniek pupočníkovej krvi v praktickej medicíne. Prvá úspešná transplantácia pupočníkovej krvi do dieťaťa s Fanconiho anémiou slúžila ako východiskový bod pre rozšírenie objemu transplantácie kmeňových buniek z pupočníkovej krvi a vytvorenie systému pre jej poskytovanie. V globálnom systéme krvných kmeňových bánk najväčší je New York Center for Placental Blood, ktorý je súčasťou bilancie Národných inštitútov zdravia. Počet uložených vzoriek krvnej vzorky v tejto banke sa blíži k 20 LLC. Počet prijímateľov (najmä detí) rastie a bola vykonaná úspešná transplantácia. Podľa ministerstva zdravotníctva USA obdobie bezpredmetného po transplantácii u príjemcov pupočníkovej krvi HSC už prekročilo 10 rokov.

To nie je prekvapujúce, pretože početné štúdie hematopoetického potenciálu pupočníkovej krvi ukázali, že množstvo a kvalita z prvých kmeňových buniek nie je len nie je horší ako u dospelého človeka kostnej drene, ale aj niektoré opatrenia ho prekročiť. Vyššia proliferačnej potenciál pupočníkovej krvi kmeňových buniek spôsoboval vývojové bunkovej signalizácie funkcie, prítomnosť receptorov na HSC do konkrétnych rastových faktorov, kapacita kábel krviniek autokrinný produkciu rastových faktorov, veľké veľkosti a dĺžky telomér.

Genómové a fenotypové znaky krvotvorných buniek krvotvorných buniek, ktoré tvoria krvný obeh, predurčujú kvalitatívnu engraftáciu transplantátu s vysokým potenciálom obnovenia hemopoézy darcu v organizme príjemcu.

Výhody hematopoetických kmeňových buniek pupočníkovej krvi

Medzi skutočné výhody používania krvotvorných pupočníkovej krvi kmeňových buniek pre transplantáciu oproti iným zdrojom krvotvorných buniek je potrebné poznamenať, takmer nulové riziko pre zdravie darcu (ak nie je považovaný za taký placenty), pričom odpadá nutnosť celkovej anestézie. Použitie pupočnej transplantáciu pupočníkovej krvi buniek expanduje čiastočne HLA-kompatibilný štepu systému (nekompatibility od jednej do troch antigénov). Technika dlhodobého skladovania krvotvorných kábel krviniek v zmrazenom stave, čo zvyšuje pravdepodobnosť získania vzácne HLA-typu a znižuje čas vyhľadávania HLA zhodou alogénne transplantáciu. Súčasne je významne znížené riziko vzniku niektorých latentných infekcií prenášaných prenosovou cestou. Navyše existuje lacná forma biologického životného poistenia v súvislosti s možnosťou používania kmeňových krvných buniek na autológnu transplantáciu.

Avšak, pretože malé množstvo krvi, ktoré môžu byť získané z placenty (priemer nie väčší ako 100 ml), do popredia problém, ako získať maximálne možné množstvo krvi z pupočníkovej žily presne v súlade s podmienkami minimálne riziko bakteriálnej kontaminácie pupočnej odvodených vzoriek pupočníkovej krvi.

Primitívne krvotvorné bunky z pupočníkovej krvi sú všeobecne identifikované prítomnosťou na svojom povrchu glikofosfoproteina CD34, a to na základe ich funkčných vlastností skúmaním klonogenní testu alebo kolónie tvorby in vitro. Porovnávacia analýza ukázala, že sa v pupočníkovej krvi a kostnej drene maximálny obsah CD34-pozitívnych mononukleárnych bunkách vo frakcii sú príslušne 1,6 a 5,0%, maximálna úroveň jednotiek tvoriacich kolóniu na subpopulácii buniek CD34 + - 80 a 25%, celková účinnosť klonovanie CD34 + -buňky - 88 a 58%, maximálna tvoriacich kolónie buniek s vysokým proliferačním potenciálom (HPP-CFC v -populyatsii CD34 +) - 50, a 6,5%. Treba dodať, že účinnosť klonovanie CD34 + CD38-bunkách a schopnosť reagovať na stimuláciu cytokinové tiež vyššia v hemopoetických kmeňových buniek pupočníkovej krvi.

Kombinované fenotypové antigény Thy-1, CD34 a CD45RA potvrdzuje vysokú proliferačnú kapacitu pupočníkovej krvi krvotvorných buniek a expresie troch antigénov na povrchu krvných buniek pupočníkovej naznačuje, že patrí do kmeňové bunky. Okrem toho sa zistilo, že pupočníková krv obsahuje bunky s fenotypom CD34 +, ktoré nemajú lineárne diferenciačné markery. Úroveň v pupočníkovej krvi bunkových subpopulácií s fenotypovou profilom CD34 + / Lin je približne 1% z celkového počtu CD34-pozitívnych buniek. Hematopoietické progenitorové bunky vedú k pupočníkovej krvi ako lymfoidných bunkových línií, a množstvo lineárneho pluripotentných myeloidnej diferenciácie buniek, čo tiež naznačuje, že patrí do kmeňových buniek.

Ako už bolo uvedené, podstatné rozdiely medzi kostnou dreňou a pupočníkovou krvou sú množstvo hematopoetických buniek použitých na transplantáciu, ktoré sa získajú jedným postupom. Pri kostnej drene strata transplantátu z bunkovej hmoty v separačnom procese, kryokonzervácia, rozmrazovanie a skúšanie sú prípustné v rozmedzí 40-50%, šnúra krvné bunky, ako sú strata je veľmi významný, pretože pri použití nedostatočný počet transplantácie HSC môžu byť neudržateľný. Podľa G. Kogler et al (1998), pre transplantáciu buniek v príjemcu telesnej hmotnosti 10 kg potenciálu po transplantácii (celkový počet odobratých vzoriek pupočníkovej krvi - 2098), môžu byť všetky vzorky pupočníkovej krvi, telesná hmotnosť 35 kg - 67%, a to iba 25% vzoriek bude schopných poskytnúť účinnú transplantáciu u pacientov s telesnou hmotnosťou 50-70 kg. Táto klinická situácia naznačuje potrebu optimalizovať a zlepšiť účinnosť existujúcich metód odberu vzoriek, reprodukcie a uchovávania buniek z pupočníkovej krvi. Z tohto dôvodu, otázky štandardizácie metód odberu vzoriek, testovania, separácie a kryokonzervácii pupočníkovej krvi je teraz široko popísané v literatúre pre vytvorenie krvných bánk, jeho použitie v klinickej praxi, rovnako ako sa určujú podmienky a podmienky skladovania krvotvorných kmeňových buniek z pupočníkovej krvi.

[11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]

Použitie hematopoetických kmeňových buniek pupočníkovej krvi v medicíne

Z krvného obehu z pupočníkovej krvi sa zvyčajne môže izolovať až ¹⁰⁶ hematopoetických kmeňových buniek, zriedka viac. V súvislosti s týmto až do dnešného dňa zostáva otázka dostatočnosti toľkých krvotvorných buniek hematopoietickej krvi na obnovenie hematopoézy dospelého príjemcu. Názory na túto otázku boli rozdelené. Niektorí výskumníci sa domnievajú, že toto množstvo je dostatočné na transplantáciu deti, ale príliš malá na transplantáciu dospelého človeka, pre ktoré je podávanie optimálne (7-10) x 10 ⁶ CD34-pozitívnych buniek na 1 kg telesnej hmotnosti - priemerne 7 x 10 ⁸ na transplantáciu. Z týchto výpočtov vyplýva, že jedna vzorka pupočníkovej šnúry obsahuje 700 krát menej hematopoetických kmeňových buniek, než sa vyžaduje pri jednej transplantácii dospelého pacienta. Takéto kvantitatívne hodnotenie sa však uskutočňuje analogicky s počtom transfúzovaných buniek v kostnej dreni a úplne ignoruje ontogenetické znaky hematopoézy.

Najmä sa ignoruje skutočnosť, vyššiu proliferačnú kapacitu krvotvorných kmeňových buniek z pupočníkovej krvi v porovnaní s krvotvorných progenitorových buniek kostnej drene. Výsledky štúdií potenciálu tvorby kolónií in vitro naznačujú, že jedna dávka pupočníkovej krvi môže poskytnúť rekonštitúciu krvotvorby dospelého príjemcu. Na druhej strane, nemali by sme zabúdať, že počet HSC klesá aj v procese embryonálneho vývoja: obsah CD34-pozitívnych buniek v pupočníkovej krvi sa lineárne znižuje 5x po dobu 20 týždňov (krvi pre štúdii bola získaná v prípade predčasného ukončenia tehotenstva), do 40 týždňov tehotenstva (obdobie fyziologických pôrodov), ktoré sprevádza paralelné, trvalé zvýšenie expresie lineárnych markerov cytodiferenciácie.

Vzhľadom na nedostatok štandardizovaného prístupu k kvantifikácie v pupočníkovej krvných vzorkách progenitorov spor optimálnej dávke krvotvorných kmeňových buniek z pupočníkovej krvi pokračuje. Niektorí vedci sa domnievajú, že počet jadrových buniek a mononukleárnych buniek prepočítaných na telesnú hmotnosť príjemcu, to znamená ich dávku, sa môže použiť ako kritérium na výber vzoriek pupočníkovej šnúry. Niektorí autori sa domnievajú, že minimálna hranica kvantifikácie CD34 + buniek aj pre autotransplantácia GCW je 2 x 10 ⁶ / kg. Zvýšenie dávky krvotvorných buniek na 5 x 10 ⁶ buniek / kg (celkovo 2,5) už poskytuje vhodnejšie pre ranom období po transplantácii, znižuje výskyt infekčných komplikácií a skracuje dobu preventívnej antibiotickej terapie.

Podľa E. Gluckman et al (1998) v hematológii pre úspešnú transplantáciu krvných buniek z pupočníkovej je zavedenie aspoň 3,7 x 10 ⁷ jadrových buniek na 1 kg telesnej hmotnosti príjemcu. Pri znížení dávky krvotvorných kmeňových buniek na 1 x 10 ⁷ a menej jadrových buniek na 1 kg telesnej hmotnosti sa riziko zlyhania štepu a recidívy rakoviny výrazne zvýšilo. Malo by sa zistiť, že minimálny počet progenitorových buniek potrebných na rýchle zotavenie hemopoézy po transplantácii GSG ešte nie je známy. Teoreticky môže byť dosiahnuté pomocou jedinej bunky, ale v klinickej Transplantácia kostnej drene rýchle a stabilné uchytiť sa zaručené transfúziu aspoň (1-3) x 10 ⁸ jadrových buniek na 1 kg telesnej hmotnosti pacienta.

Nedávna podrobná štúdia na určenie optimálneho množstva HSC v onkohematológii zahŕňala pozorovanie pacientov troch izolovaných skupín v závislosti od obsahu CD34-pozitívnych buniek v transplantačnom materiáli. Pacienti užívali prvej skupiny (3-5) x 10 ⁶ buniek / kg. GSK dávka u pacientov druhej skupiny predstavovala (5-10) x 10 ⁶ buniek / kg a tretej skupine pacientov transplantovaných viac ako 10 x 10 ⁶ buniek CD34 + / kg. Najlepšie výsledky boli pozorované u skupiny príjemcov liečených počtu štepu CD34-pozitívne bunky boli rovná (3-5) x 10 ⁶ / kg. So zvyšujúcou sa dávky transplantovaných buniek ako 5 x 10 ⁶ / kg, boli zistené štatisticky významné výhody. Tak veľmi veľké HSC obsah v transplantáciu (> 10 x x 10 ⁶ / kg) bol spojený s významným množstvom zvyškového reinfúzi nádorových buniek, čo vedie k relapsu ochorenia. Neexistuje žiadny priamy vzťah medzi počtom transplantovaných alogénnych progenitorových buniek a vývojom reakcie "štep proti hostiteľovi".

Kumulovaná svetová skúsenosť s transplantáciou pupočníkovej krvi HSC potvrdzuje ich vysoký potenciál repopulácie. Rýchlosť prieniku transplantátu pupočníkovej krvi koreluje s počtom zavedených nukleových buniek. Najlepšie výsledky sa pozorujú pri transplantácii 3 × 10 ⁷ / kg, zatiaľ čo u kostnej drene je táto dávka 2 × 10 ⁸ / kg. Podľa údajov koordinačných centier bolo na konci roka 2000 uskutočnených 1200 transplantátov buniek z pupočníkovej krvi vo svete, hlavne od darcovských príbuzných (83%). Je zrejmé, že pupočníková krv by mala byť považovaná za alternatívu kostnej drene na transplantáciu pacientom s hemoblastózami.

Avšak, novorodeneckú povaha Cordova zdrojom krvotvorného tkaniva podporovať v dôsledku prítomnosti funkčných vlastností jeho GCW. Avšak iba klinické skúsenosti môže dať odpoveď na otázku adekvátnosti vzorky pupočníkovej krvi pre dospelých krvotvorné rozpustenie príjemcu s apláziou krvotvorby. Transplantácia krvných buniek pupočníkovej sa používa pri liečbe mnohých ochorení nádoru a non-nádorové povahy: leukémií a myelodysplastického syndrómu, non-Hodgkinovho lymfómu, a neuroblastómu, aplastickej anémie, kongenitálna Fanconiho anémia a Diamond Black ventilátor, deficitom adhézie leukocytov, Barr syndróm, Gunther ochorenie Harlera syndróm, talasémia ,

Veľká pozornosť a samostatný výskum si zaslúžia imunologické aspekty transplantácie krvotvorných buniek pupočníkovej krvi. Je ukázané, že v prípade, že transplantáciu pupočníkovej krvi kmeňových buniek od darcov s neúplnými výsledky po transplantácii HLA zhodou sú úplne uspokojivé, že, podľa autorov, čo ukazuje na nižšiu imunoreaktivita pupočníkovej krvi, než kostnej dreni.

Detailné štúdium bunkové zloženie pupočníkovej krvi ukázal rysy ako fenotypové spektrum efektorových buniek imunitného systému a ich funkčnú aktivitu, čo umožňuje považovať pupočníkovej krvi ako zdroj HSC s relatívne nízkym rizikom reakcie "štep verzus hostiteľ". Medzi príznakmi funkčnej nezrelosti imunokompetentných buniek z pupočníkovej krvi je potrebné poznamenať nerovnováhu produkcie cytokínov a zníženie citlivosti na cytokínovú reguláciu imunitnej odpovede. Výsledná inhibícia aktivity cytotoxických lymfocytov sa považuje za faktor prispievajúci k tvorbe imunologickej tolerancie k transplantovanému hemopoetickému tkanivu. V populácii pupočníkovej krvi lymfocytov, na rozdiel od periférnej krvi a kostnej drene od dospelých darcov, dominuje neaktívne, nezrelé bunky a supresorové bunky. To naznačuje zníženú dostupnosť T-lymfocytov z pupočníkovej krvi na imunitnú odpoveď. Dôležitým znakom monocytovej populácie buniek z pupočníkovej krvi je nízky obsah funkčne kompletných a aktívnych antigén prezentujúcich buniek.

Na jednej strane, nízky stupeň zrelosti efektorových buniek imunitného systému v krvných hodnôt pupočníkovej vzťahuje na jeho použitie v klinickej praxi, pretože tieto funkcie umožňujú zníženie intenzity imunitného konfliktu medzi darcom a príjemcom buniek. Ale na druhej strane, vieme o existencii korelácia medzi mierou reakcie "reakcia štepu proti hostiteľovi" a transplantáciu protinádorový účinok, tj, vplyvom vývoja "reakcia štepu proti leukémii". V súvislosti s tým bola vykonaná štúdia protinádorovej cytotoxicity buniek z pupočníkovej krvi. Výsledky ukazujú, že napriek skutočnosti oslabenej imunitnej odpovede pupočníkovej krvi buniek na stimuláciu antigénom, aktivovaných v prvom rade sú NK bunky a killeropodobnymi bunky, ktoré sa aktívne podieľajú na mechanizmoch vykonávanie protinádorové cytotoxicity. Okrem toho, v subpopulácii lymfocytov pupočníkovej krvi boli nájdené s fenotypom CD16 + CD56 + a CD16 "TCRa / p +. Predpokladá sa, že tieto bunky sú v aktivovanej forme vykonávaní reakcie" štep leukémie ".

Na Ústavu onkológie Akadémie lekárskych vied Ukrajine boli podávané Kryokonzervované krvotvorné bunky z pupočníkovej krvi u pacientov s rakovinou s pretrvávajúcim hypoplázia krvotvorby v dôsledku chemoterapie a rádioterapie. U týchto pacientov po transplantácii krvotvorných kmeňových buniek z pupočníkovej krvi účinne obnoviť krvný útlaku, o čom svedčí pretrvávajúce eleváciou zrelých vytvorených prvkov v periférnej krvi, rovnako ako zvýšenie ukazovatele charakterizujúce stav bunkovej a humorálnej imunity. Stabilita repopulačného účinku po transplantácii krvotvorných buniek pupočníkovej krvi umožňuje pokračovanie žiarenia a chemoterapie bez prerušenia priebehu liečby. Existujú dôkazy o vyššej účinnosti alotransplantátu pacientov s rakovinou, kmeňové bunky pupočníkovej krvi: ročné riziko recidívy nádoru pri ich použití bolo 25% oproti 40% u pacientov s transplantovanými génu alogénnej kostnej drene.

Mechanizmus účinku kryokonzervovaných pupočníkovej krvi kmeňových buniek by sa malo považovať za výsledok humorálnej stimulácie príjemcov hematopoézy spôsobených jedinečné schopnosti neonatálnych buniek autokrinný produkciu hematopoetických rastových faktorov, ako aj v dôsledku dočasnej štepu darcovských buniek (ako potvrdenie - významné zvýšenie obsahu periférnej krvi príjemcu fetálneho hemoglobínu 7-15 deň po transfúzii v porovnaní so základnými údajmi). Neprítomnosť u príjemcov pupočníkovej krvi po transfúzii reakcií - výsledok jeho relatívna tolerancia imunitných buniek, rovnako ako kritérium spoľahlivosti užitočnosti Kryokonzervované biologického materiálu.

Progenitorové bunky T lymfocytov vrah pupočníkovej krvi schopné aktivácie pod vplyvom stimulácie exogénny cytokínov, ktorý je použitý na vytvorenie nových ex vivo a in vivo metódy indukcie protinádorovej cytotoxické lymfoidné bunky pre následnú transplantáciu imunoterapiu. Okrem toho, "nezrelosť" genómu pupočníkovej krvi imunitných buniek umožňuje ich použitie pre zvýšenie protinádorovej aktivity molekulárnym modelovaním.

V súčasnej dobe sa pupočníková krv našla široké uplatnenie hlavne v pediatrickej hematológii. U detí s akútnou leukémiou alotransplantácii krvotvorných kmeňových buniek z pupočníkovej krvi v porovnaní s allo-štepov kostnej drene, čo výrazne znižuje výskyt reakcie "štep verzus hostiteľ". Existuje však dlhšia doba neutropénie a trombocytopénie a bohužiaľ vyššia hladina 100-dňovej posttransplantačnej mortality. Dlhšia doba zotavenia v periférnej krvi granulocytov a krvných doštičiek môže byť z dôvodu nedostatočnej odlíšenie jednotlivých subpopulácií CD34 pozitívnych buniek pupočníkovej krvi, o čom svedčí nízka úroveň absorpcie rádioaktívneho rhodamin a nízkou expresiou CD38 antigénov na ich povrchu.

V rovnakej dobe, transplantácia krvotvorných kmeňových buniek z pupočníkovej krvi dospelých pacientov, ktorý prebieha vzhľadom na nedostatok ako kompatibilného nepríbuzného darcu kostnej drene, rovnako ako možnosť mobilizácie autológne HSC vykazoval vysokú ročnú prežitia bez relapsu u pacientov vo veku do 30 rokov (73%) , Rozšírenie vekovej skupiny príjemcov (18-46 rokov) malo za následok zníženie miery prežitia na 53%.

Kvantitatívna analýza buniek s fenotypom CD34 + kostnej drene a pupočníkovej krvi vykazovali vyššiu (3,5 krát) ich obsahu v kostnej dreni, ale pupočníkovej krvi ukázali významné prevahu buniek s fenotypovej profilom CD34 + HLA-DR .Izvestno, chtokletkikrovisimmunologicheskimi markerov CD34 + a HLA-DR proliferáciou aktívnejší ako bunky s imunocytologie CD34 + a HLA-DR +, ako bolo potvrdené v experimentálnych štúdiách rastu dlhodobej kultivácii krvotvorných buniek in vitro. Primitívne bunkové progenitory s fenotypom CD34 + CD38 obsiahnuté v pupočníkovej krvi a kostnej drene, ale pupočníkovej krvi bunky s markerom stanovenej CD34 + CD38 majú vyššiu aktivitu ako klonogenní krvotvorných buniek rovnakého fenotypu, izolované z dospelých darcu kostnej drene. Okrem toho sa pupočníkovej krvi bunky s CD34 + CD38 imunofenotypoch proliferáciou v reakcii na stimuláciu s cytokíny (IL-3, IL-6, G-CSF) a reprodukovať 7 krát viac kolónií v dlhodobých kultúrach než bunky kostnej drene.

Banky z kmeňových buniek z pupočníkovej krvi

Pre správny vývoj nového odboru praktického lekárstva - transplantácia pupočníkovej krvi kmeňových buniek, ako aj vykonávať transplantácie krvotvorných kmeňových buniek kostnej drene, je potrebné mať rozsiahlu sieť krvných bánk, ktoré sú už zavedené v USA a Európe. Vnútroštátne siete banky z pupočníkovej krvi združuje združenie Netcord Banks. Uskutočniteľnosť vytvorenia medzinárodné združenie banky pupočníkovej krvi je daná skutočnosťou, že na vykonanie nesúvisiace transplantácie potrebujú veľké množstvo vzoriek pupočníkovej krvi napísaný, čo umožňuje zvoliť HLA identický darcu. Len vytvorenie systému bánk so skladovaním krvných vzoriek rôznych typov HLA v nich môže skutočne vyriešiť problém nájdenia potrebného darcu. Organizácia takéhoto systému banky z pupočníkovej krvi vyžaduje predbežný vývoj etických a právnych noriem, o ktorých sa v súčasnosti diskutuje na medzinárodnej úrovni.

Ak chcete vytvoriť banky krvných šnúr na Ukrajine, je potrebné vypracovať niekoľko ustanovení a dokumentov.

Predovšetkým ide o otázky štandardizácie metód odberu vzoriek, frakcionácie a zmrazovania pupočníkovej krvi. Je potrebné upraviť pravidlá odberu pupočníkovej krvi v materských nemocniciach v súlade s požiadavkami lekárskej etiky s cieľom stanoviť minimálne množstvo pupočníkovej krvi, ktorá zabezpečí úspešnú transplantáciu. To by malo byť porovnané a štandardizáciu rôznych kritérií hodnotenia kvality a počet krvných progenitorových buniek, rovnako ako spôsoby HLA typizácie a metódy diagnostiky genetických a infekčných chorôb, ktoré môžu byť prenášané pomocou infúzií krvných buniek z pupočníkovej nastaviť všeobecné kritériá pre výber zdravých darcov. Je tiež potrebné diskutovať o vytvorení samostatných skladovacích zariadení pre sérum, bunky a DNA odvodené z pupočníkovej krvi.

Je absolútne nevyhnutné zorganizovať počítačovú sieť údajov o pupočníkovej krvi na implementáciu vzťahu s registrom darcov kostnej drene. Aby sa ďalej rozvíjala transplantácia buniek, mali by sa vypracovať špeciálne protokoly na porovnanie výsledkov transplantácie pupočníkovej krvi a kostnej drene z príbuzných s HLA identickými a nepríbuznými darcami. Pri rokovaní s etickými a právnymi problémami klinické využitie pupočníkovej krvi bunky môžu pomôcť štandardizovať dokumentáciu, vrátane informovaného súhlasu rodičov, ako aj oznámenia o matku alebo príbuzným dieťaťa identifikovaného genetické a / alebo infekčných chorôb.

Rozhodujúcou podmienkou pre rozvoj transplantácie buniek na Ukrajine bude prijatie Národného programu pre darovanie kmeňových buniek a rozvoj medzinárodnej spolupráce s ostatnými krajinami v rámci Svetovej asociácie darcov kostnej drene (WMDA), Národného programu amerického darcu kostnej drene (NMDP) a ďalších registrov.

Zovšeobecňovať ešte krátku históriu transplantáciou krvotvorných buniek z pupočníkovej krvi, berieme na vedomie, že prvý predpoklad o možnosti klinickej aplikácie pupočníkovej krvi, vyrobený na začiatku 70. Rokov, boli potvrdené v 80. Rokoch výsledky experimentálnych štúdií na zvieratách, a v roku 1988 rok bol vykonaný ako prvý na svete transplantáciu krvotvorných buniek ľudskej pupočníkovej krvi, a potom sa začala rozvíjať globálnu sieť banky pupočníkovej krvi. Po 10 rokoch sa počet pacientov s transplantovanými krvotvorných buniek, pupočníkovej krvi bližšie k 800. Medzi nimi boli pacienti s rôznymi nádorových ochorení (leukémie, lymfómu, pevné nádory) a nenádorových (kongenitálna imunodeficiencie, anémia, ochorenia spojené s metabolickými poruchami) povahy.

V pupočníkovej krvi je obsah skorých a spáchaných bunkových progenitorov vyšší ako v periférnej krvi dospelých. Početom jednotiek tvoriacich kolónie granulocytov a makrofágov a ich proliferačný potenciál, pupočníková krv výrazne prekračuje periférnu krv dospelých aj po zavedení rastových faktorov. V dlhodobých bunkových kultúrach in vitro bola väčšia proliferatívna aktivita a životaschopnosť buniek z pupočníkovej krvi ako bunky kostnej drene. Kritické momenty v transplantáciu pupočníkovej krvi kmeňových buniek sú hematopoetické potenciálny počet a bunky s jadrami, prítomnosť cytomegalovírusovej infekcie, HLA-kompatibilný darcu a príjemcu, telesnej hmotnosti a veku pacienta.

Napriek tomu by sa transplantácia kmeňových buniek z pupočníkovej krvi mala považovať za alternatívu k transplantácii kostnej drene s cieľom liečiť ťažké ochorenia krvi, najmä u detí. Klinické problémy transplantáciou krvných buniek z pupočníkovej postupne vyriešený - sú už pomerne účinné odoberanie vzoriek, separácie a kryokonzervácia pupočníkovej krvi bunky, za predpokladu, že podmienky pre vznik banky pupočníkovej krvi, testovacích metód zlepší jadrových buniek. Optimálne na oddelenie veľkokapacitným kmeňovým krvným riešením krvi z pupočníkovej krvi pri vytváraní bánk by sa malo zvážiť 3% roztok želatíny a 6% roztok hydroxyetylškrobu.

Perehrestenko P. Et al (2001) správne poukazujú na to, že transplantácia pupočníkovej krvi kmeňových buniek by malo svoje miesto v komplexe terapeutických opatrení na prekonanie depresii krvotvorby rôzneho pôvodu, ako GSK pupočníkovej krvi sa líšia v rade významných výhod, medzi ktorými dôležité je relatívna jednoduchosť zberu, neexistuje žiadne riziko pre darcu, nízka kontaminácia neonatálnych buniek vírusy a relatívne nízke náklady na transplantáciu. Niektorí autori uvádzajú, že transplantácia pupočníkovej krvi bunky menej často ako buniek kostnej drene je sprevádzaný komplikácií spojených s reakciou "štep verzus hostiteľ", ktorý je v dôsledku, podľa ich názoru, slabá expresia v pupočníkovej krvi buniek HLA-DR antigénov a ich nezrelosť. Avšak, hlavný populácie jadrových buniek z pupočníkovej krvi sú T-lymfocyty (DDZ-pozitívnych buniek), ktorých obsah je asi 50%, čo je o 20% menej ako v periférnej krvi dospelého človeka, ale fenotypové rozdiely subpopulácií T-buniek od nich zdroje sú nevýznamné.

Medzi faktory, ktoré priamo ovplyvňujú prežitie transplantácie kmeňových buniek z pupočníkovej krvi, mali by sme poznamenať, vek pacientov (najlepšie výsledky sú vidieť u príjemcov vo veku do 5 rokov), včasnú diagnózu ochorenia a formu leukémie (účinnosť je výrazne vyššia u akútnej leukémie). Veľmi dôležitá je dávka nukleovaných buniek pupočníkovej krvi, ako aj ich kompatibilita s HLA s príjemcom. Je žiadna analýza nehoda klinickej účinnosti transplantácie pupočníkovej krvi GSK v onkológii a hematológii ukazuje najlepšie výsledky liečby pomocou súvisiacich sadeníc jednoročné prežívanie bez ochorenia v tomto prípade dosahuje 63%, zatiaľ čo nepríbuzných transplantácii - iba 29%.

To znamená, že prítomnosť veľkého počtu kmeňových buniek v pupočníkovej krvi a vysoké repopulyatsionnaya výkonnostných neonatálnych krvotvorných kmeňových buniek, aby boli vhodné pre alogénnu transplantáciu u pacientov s hematologickými malignitami. Uvedomte si však, že rekapitulácia krvotvorby po transplantácii krvotvorných kmeňových buniek z pupočníkovej krvi "sa pretiahol v čase": obnovenie obsah neutrofilov periférnej krvi sa zvyčajne vyskytuje na konci 6. Týždňa, a trombocytopénia jav zmizne, zvyčajne po 6 mesiacoch. Okrem toho, nezrelé krvotvorné bunky pupočníkovej krvi nevylučuje imunologický konflikt: ťažký priebeh akútne a chronické reakcie "štep verzus hostiteľ", pozorované v tomto poradí v 23 a 25% príjemcov. V 26% prípadov sa zaznamenali recidívy akútnej leukémie koncom prvého roka po transplantácii buniek pupočníkovej krvi.

[18], [19], [20], [21]