Obmedzenia, nebezpečenstvá a komplikácie transplantácie buniek

Regeneratívna plastická medicína je založená na klinickom využití toti- a pluripotentných vlastností embryonálnych a progenitorových kmeňových buniek, ktoré umožňujú in vitro a in vivo vytváranie špecifických bunkových línií, ktoré repopulujú poškodené tkanivá a orgány chorého človeka.

Reálna možnosť využitia embryonálnych kmeňových buniek a kmeňových buniek definitívnych tkanív (tzv. „dospelé“ kmeňové bunky) ľudí na terapeutické účely už nie je spochybnená. Odborníci z Národnej a lekárskej akadémie USA (Kmeňové bunky a budúca regeneratívna medicína National Academy Press) a Národného inštitútu zdravia USA (Kmeňové bunky a budúce smery výskumu. Nat. Inst, of Health USA) však odporúčajú podrobnejšie štúdium vlastností kmeňových buniek v experimentoch na adekvátnych biologických modeloch a objektívne posúdenie všetkých dôsledkov transplantácie a až potom použiť kmeňové bunky v klinických podmienkach.

Bolo zistené, že kmeňové bunky sú súčasťou tkanivových derivátov všetkých troch zárodočných vrstiev. Kmeňové bunky sa nachádzajú v sietnici, rohovke, epiderme kože, kostnej dreni a periférnej krvi, v cievach, zubnej dreni, obličkách, gastrointestinálnom epiteli, pankrease a pečeni. Pomocou moderných metód sa dokázalo, že nervové kmeňové bunky sú lokalizované v mozgu a mieche dospelého človeka. Tieto senzačné údaje pritiahli osobitnú pozornosť vedcov a médií, pretože neuróny v mozgu slúžili ako klasický príklad statickej bunkovej populácie, ktorá sa neobnovuje. V skorom aj neskorom období ontogenézy sa v mozgu zvierat a ľudí tvoria neuróny, astrocyty a oligodendrocyty vďaka nervovým kmeňovým bunkám (Kmeňové bunky: vedecký pokrok a budúce smery výskumu. Národný inštitút zdravia USA).

Za normálnych podmienok sa však plasticita kmeňových buniek definitívnych tkanív neprejavuje. Aby sa realizoval plastický potenciál kmeňových buniek definitívnych tkanív, musia byť izolované a následne kultivované v médiu s cytokínmi (LIF, EGF, FGF). Deriváty kmeňových buniek sa navyše úspešne uchytia iba po transplantácii do tela zvieraťa s oslabeným imunitným systémom (γ-ožiarenie, cytostatiká, busulfán atď.). Doteraz neboli získané žiadne presvedčivé dôkazy o realizácii plasticity kmeňových buniek u zvierat, ktoré neboli vystavené žiareniu alebo iným účinkom spôsobujúcim hlbokú imunosupresiu.

V takýchto podmienkach sa nebezpečný potenciál embryonálnych kmeňových buniek (ESC) prejavuje predovšetkým počas ich transplantácie do ektopických oblastí - počas subkutánnej injekcie ESC imunodeficientným myšiam sa v mieste vpichu tvoria teratokarcinómy. Okrem toho je počas vývoja ľudského embrya frekvencia chromozómových abnormalít vyššia ako pri embryogenéze u zvierat. V štádiu blastocysty pozostáva iba 20 – 25 % ľudských embryí z buniek s normálnym karyotypom a prevažná väčšina skorých ľudských embryí získaných po oplodnení in vitro vykazuje chaotickú chromozómovú mozaiku a veľmi často sa stretáva s numerickými a štrukturálnymi aberáciami.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Priaznivé účinky kmeňových buniek

Predbežné výsledky klinických štúdií potvrdzujú priaznivý účinok kmeňových buniek na pacienta, ale stále neexistujú žiadne informácie o dlhodobých účinkoch transplantácie buniek. V literatúre spočiatku dominovali správy o pozitívnych výsledkoch transplantácie embryonálnych mozgových fragmentov pri Parkinsonovej chorobe, no potom sa začali objavovať údaje popierajúce účinný terapeutický účinok embryonálneho alebo fetálneho nervového tkaniva transplantovaného do mozgu pacientov.

V polovici 20. storočia bola prvýkrát objavená obnova hematopoézy u letálne ožiarených zvierat po intravenóznej transfúzii buniek kostnej drene a v roku 1969 americký výskumník D. Thomas vykonal prvú transplantáciu kostnej drene u ľudí. Nedostatok znalostí o mechanizmoch imunologickej nekompatibility buniek kostnej drene darcu a príjemcu v tom čase viedol k vysokej úmrtnosti v dôsledku častého zlyhania transplantácie a rozvoja reakcie štep verzus hostiteľ. Objav hlavného histokompatibilného komplexu, ktorý zahŕňa ľudské leukocytové antigény (HbA1c), a zlepšenie metód ich typizácie umožnili výrazne zvýšiť prežitie po transplantácii kostnej drene, čo viedlo k širokému použitiu tejto liečebnej metódy v onkohematológii. O desaťročie neskôr boli vykonané prvé transplantácie hematopoetických kmeňových buniek (HSC) získaných z periférnej krvi pomocou leukaferézy. V roku 1988 bola pupočná krv prvýkrát použitá ako zdroj HSC vo Francúzsku na liečbu dieťaťa s Fanconiho anémiou a od konca roka 2000 sa v tlači objavujú správy o schopnosti HSC diferencovať sa na bunky rôznych typov tkanív, čo potenciálne rozširuje rozsah ich klinického použitia. Ukázalo sa však, že transplantačný materiál spolu s HSC obsahuje značné množstvo nečistôt nehematopoetických buniek rôznej povahy a vlastností. V tejto súvislosti sa vyvíjajú metódy čistenia transplantátu a kritériá na hodnotenie jeho bunkovej čistoty. Používa sa najmä pozitívna imunoselekcia buniek CD34+, ktorá umožňuje izoláciu HSC pomocou monoklonálnych protilátok.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ], [ 12 ]

Komplikácie terapie kmeňovými bunkami

Komplikácie pri transplantácii kostnej drene sú najčastejšie hematologické a spojené s dlhým obdobím iatrogénnej pancytopénie. Najčastejšie sa vyvíjajú infekčné komplikácie, anémia a krvácania. V tejto súvislosti je mimoriadne dôležité zvoliť optimálny spôsob odberu, spracovania a skladovania kostnej drene pre maximálne zachovanie kmeňových buniek, čo zabezpečí rýchle a stabilné obnovenie hematopoézy. Pri charakterizácii transplantátu sa v súčasnosti bežne hodnotia nasledujúce parametre: počet mononukleárnych a/alebo jadrových buniek, jednotky tvoriace kolónie a obsah CD34-pozitívnych buniek. Tieto ukazovatele, žiaľ, poskytujú iba nepriame posúdenie skutočnej hematopoetickej kapacity populácie kmeňových buniek transplantátu. V súčasnosti neexistujú absolútne presné parametre na určenie dostatočnosti transplantátu na dlhodobé obnovenie hematopoézy u pacientov, a to ani pri autológnej transplantácii kostnej drene. Vypracovanie všeobecných kritérií je mimoriadne náročné kvôli nedostatku prísnych štandardov pre spracovanie, kryokonzerváciu a testovanie transplantátu. Okrem toho je potrebné zohľadniť celú škálu faktorov ovplyvňujúcich parametre úspešnej obnovy hematopoézy u každého jednotlivého pacienta. Pri autológnej transplantácii kostnej drene sú najdôležitejšie počet predchádzajúcich cyklov chemoterapie, charakteristiky kondicionačného režimu, obdobie ochorenia, v ktorom bola kostná dreň odobratá, a schémy použitia faktorov stimulujúcich kolónie v období po transplantácii. Okrem toho by sa nemalo zabúdať, že chemoterapia predchádzajúca odberu transplantátu môže mať negatívny vplyv na kmeňové bunky kostnej drene.

Výskyt závažných toxických komplikácií sa počas alogénnej transplantácie kostnej drene výrazne zvyšuje. V tejto súvislosti sú zaujímavé štatistické údaje o alogénnej transplantácii kostnej drene pri talasémii. Správy Európskej skupiny pre transplantáciu kostnej drene zaznamenali približne 800 transplantácií kostnej drene pacientom s talasémiou major. Alogénna transplantácia pri talasémii sa vo veľkej väčšine prípadov vykonáva od HLA-identických súrodencov, čo je spojené so závažnými komplikáciami a vysokou úmrtnosťou počas transplantácie materiálu kmeňových buniek od čiastočne kompatibilných príbuzných alebo kompatibilných nepríbuzných darcov. Aby sa minimalizovalo riziko fatálnych infekčných komplikácií, pacienti sú umiestnení do izolovaných aseptických boxov s laminárnym prúdením vzduchu a dostávajú nízko- alebo abakteriálnu diétu. Na bakteriálnu dekontamináciu čreva sa perorálne predpisujú nevstrebateľné formy antibiotík a antimykotiká. Na profylaxiu sa intravenózne podáva amfotericín B. Prevencia systémových infekcií sa posilňuje amikacínom a ceftazidímom, ktoré sa predpisujú deň pred transplantáciou, pričom liečba pokračuje až do prepustenia pacienta. Všetky krvné produkty sú pred transfúziou ožarované dávkou 30 Gy. Parenterálna výživa počas transplantácie je nevyhnutnou podmienkou a začína sa ihneď po obmedzení príjmu potravy prirodzenou cestou.

S vysokou toxicitou imunosupresívnych liekov, ktoré často spôsobujú nevoľnosť, vracanie a mukozitídu, poškodenie obličiek a intersticiálnu pneumóniu, sa spája množstvo komplikácií. Jednou z najzávažnejších komplikácií chemoterapie je venookluzívne ochorenie pečene, ktoré vedie k úmrtiu v skorom období po transplantácii. Medzi rizikové faktory trombózy žíl portálneho systému pečene patrí vek pacientov, prítomnosť hepatitídy a fibrózy pečene, ako aj imunosupresívna liečba po transplantácii kostnej drene. Venookluzívne ochorenie je obzvlášť nebezpečné pri talasémii, ktorú sprevádza hemosideróza pečene, hepatitída a fibróza – častí spoločníci transfúznej terapie. Trombóza žíl portálneho systému pečene sa vyvíja 1 – 2 týždne po transplantácii a vyznačuje sa rýchlym zvýšením obsahu bilirubínu a aktivity transamináz v krvi, progresiou hepatomegálie, ascitu, encefalopatie a bolesti v hornej časti brucha. Histologicky sa v pitevnom materiáli zistí poškodenie endotelu, subendotelové krvácania, poškodenie centrilobulárnych hepatocytov, trombotická obštrukcia venúl a centrálnych žíl pečene. U pacientov s talasémiou boli popísané prípady fatálnej zástavy srdca spojenej s toxickými účinkami cytostatík.

V období pred transplantáciou cyklofosfamid a busulfán často spôsobujú toxicko-hemoragickú cystitídu s patologickými zmenami v uroepiteliálnych bunkách. Použitie cyklosporínu A pri transplantácii kostnej drene je často sprevádzané nefro- a neurotoxicitou, hypertenzným syndrómom, retenciou tekutín v tele a cytolýzou hepatocytov. Sexuálna a reprodukčná dysfunkcia sa častejšie pozoruje u žien. U malých detí nie je pubertálny vývoj po transplantácii zvyčajne ovplyvnený, ale u starších detí môže byť patológia vývoja sexuálnej sféry veľmi závažná - až po sterilitu. Medzi komplikácie priamo súvisiace so samotnou transplantáciou patrí odmietnutie alogénnych buniek kostnej drene, ABO inkompatibilita, akútne a chronické formy reakcie štepu proti hostiteľovi.

U pacientov s transplantáciou kostnej drene nekompatibilnou s ABO systémom sa izoaglutiníny hostiteľa verzus darcu ABO produkujú 330 – 605 dní po transplantácii, čo môže viesť k predĺženej hemolýze a dramaticky zvýšiť potrebu krvných transfúzií. Tejto komplikácii sa predchádza transfúziou iba červených krviniek typu 0. Po transplantácii sa u niektorých pacientov vyskytne autoimunitná neutropénia, trombocytopénia alebo pancytopénia, ktorých korekcia si vyžaduje splenektómiu.

U 35 – 40 % príjemcov sa akútna reakcia štepu proti hostiteľovi vyvinie do 100 dní po alogénnej transplantácii kostnej drene s identickým HLA. Stupeň postihnutia kože, pečene a čriev sa pohybuje od vyrážky, hnačky a miernej hyperbilirubinémie až po deskvamáciu kože, črevnú obštrukciu a akútne zlyhanie pečene. U pacientov s talasémiou je výskyt akútnej reakcie štepu proti hostiteľovi I. stupňa po transplantácii kostnej drene 75 % a stupňa II a vyššieho je 11 – 53 %. Chronická reakcia štepu proti hostiteľovi ako systémový multiorgánový syndróm sa zvyčajne vyvinie do 100 – 500 dní po alogénnej transplantácii kostnej drene u 30 – 50 % pacientov. Postihnutá je koža, ústna dutina, pečeň, oči, pažerák a horné dýchacie cesty. Rozlišuje sa medzi obmedzenou formou chronickej reakcie štepu proti hostiteľovi, keď je postihnutá koža a/alebo pečeň, a rozšírenou formou, keď sú generalizované kožné lézie kombinované s chronickou agresívnou hepatitídou, léziami očí, slinných žliaz alebo akéhokoľvek iného orgánu. Úmrtie je často spôsobené infekčnými komplikáciami vyplývajúcimi zo závažnej imunodeficiencie. Pri talasémii sa mierna forma chronickej reakcie štepu proti hostiteľovi vyskytuje u 12 %, stredne závažná forma u 3 % a závažná forma u 0,9 % príjemcov alogénnej HLA-kompatibilnej kostnej drene. Závažnou komplikáciou transplantácie kostnej drene je odmietnutie štepu, ktoré sa vyvíja 50 – 130 dní po operácii. Frekvencia odmietnutia závisí od režimu prípravy. Najmä u pacientov s talasémiou, ktorí počas prípravného obdobia dostávali iba metotrexát, sa odmietnutie transplantátu kostnej drene pozorovalo v 26 % prípadov, pri kombinácii metotrexátu s cyklosporínom A v 9 % prípadov a pri podávaní iba cyklosporínu A v 8 % prípadov (Gaziev a kol., 1995).

Infekčné komplikácie po transplantácii kostnej drene sú spôsobené vírusmi, baktériami a hubami. Ich vývoj je spojený s hlbokou neutropéniou vyvolanou chemoterapeutickými liekmi počas obdobia prípravy, poškodením slizničných bariér cytostatikami a reakciou štep verzus hostiteľ. V závislosti od času vývoja sa rozlišujú tri fázy infekčných komplikácií. V prvej fáze (vyvíja sa v prvom mesiaci po transplantácii) prevláda poškodenie slizničných bariér a neutropénia, často sprevádzané vírusovými infekciami (herpes, vírus Epstein-Barrovej, cytomegalovírus, Varicella zoster), ako aj infekciami spôsobenými grampozitívnymi a gramnegatívnymi baktériami, hubami Candida, aspergilmi. V skorom posttransplantačnom období (druhý a tretí mesiac po transplantácii) je najzávažnejšou infekciou cytomegalovírus, ktorý často vedie k úmrtiu pacientov v druhej fáze infekčných komplikácií. Pri talasémii sa cytomegalovírusová infekcia po transplantácii kostnej drene vyvíja u 1,7 – 4,4 % príjemcov. Tretia fáza sa pozoruje v neskorom období po transplantácii (tri mesiace po operácii) a je charakterizovaná ťažkou kombinovanou imunodeficienciou. Infekcie spôsobené Varicella zoster, streptokokom, Pneumocystis carinii, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae a hepatotropnými vírusmi sú počas tohto obdobia bežné. Pri talasémii je úmrtnosť pacientov po transplantácii kostnej drene spojená s bakteriálnou a plesňovou sepsou, idiopatickou intersticiálnou a cytomegalovírusovou pneumóniou, syndrómom akútnej respiračnej tiesne, akútnym srdcovým zlyhaním, srdcovou tamponádou, mozgovým krvácaním, venookluzívnym ochorením pečene a akútnou reakciou štepu proti hostiteľovi.

V súčasnosti sa dosiahli určité úspechy vo vývoji metód na izoláciu čistých populácií hematopoetických kmeňových buniek z kostnej drene. Zlepšila sa technika získavania fetálnej krvi z pupočníkovej šnúry a vytvorili sa metódy na izoláciu hematopoetických buniek z pupočníkovej krvi. Vo vedeckej tlači sa objavujú správy o tom, že hematopoetické kmeňové bunky sú schopné množenia pri kultivácii v médiu s cytokínmi. Pri použití špeciálne navrhnutých bioreaktorov na expanziu hematopoetických kmeňových buniek sa biomasa hematopoetických kmeňových buniek izolovaných z kostnej drene, periférnej alebo pupočníkovej krvi výrazne zvyšuje. Možnosť expanzie hematopoetických kmeňových buniek je dôležitým krokom ku klinickému vývoju bunkovej transplantácie.

Pred in vitro rozmnožovaním hematopoetických kmeňových buniek je však potrebné izolovať homogénnu populáciu hematopoetických kmeňových buniek. To sa zvyčajne dosahuje pomocou markerov, ktoré umožňujú selektívne značenie hematopoetických kmeňových buniek monoklonálnymi protilátkami kovalentne viazanými na fluorescenčnú alebo magnetickú značku a ich izoláciu pomocou vhodného bunkového triediča. Zároveň otázka fenotypových charakteristík hematopoetických kmeňových buniek nebola definitívne vyriešená. A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) považujú bunky s antigénmi CD34, AC133 a Thyl na povrchu a bez markerov CD38, HLA-DR alebo iných diferenciačných markerov (bunky s fenotypom CD34+Liir) za kandidátov na hematopoetické kmeňové bunky. Medzi markery línie (Lin) patrí glykoforín A (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). Bunky s fenotypom CD34+CD45RalüW CD71low, ako aj s fenotypom CD34+Thyl+CD38low/c-kit/low, sa považujú za sľubné na transplantáciu.

Problematická zostáva otázka počtu hematopoetických kmeňových buniek dostatočných na účinnú transplantáciu. V súčasnosti sú zdrojmi hematopoetických kmeňových buniek kostná dreň, periférna a pupočníková krv a embryonálna pečeň. Expanzia hematopoetických kmeňových buniek sa dosahuje ich kultiváciou v prítomnosti endotelových buniek a hematopoetických rastových faktorov. V rôznych protokoloch sa na indukciu proliferácie HSC používajú myeloproteíny, SCF, erytropoetín, inzulínu podobné rastové faktory, kortikosteroidy a estrogény. Pri použití kombinácií cytokínov in vitro je možné dosiahnuť významný nárast zásoby HSC s vrcholom ich produkcie na konci druhého týždňa kultivácie.

Transplantácia hematopoetických kmeňových buniek z pupočníkovej krvi sa tradične používa hlavne pri hemoblastózach. Minimálna dávka hematopoetických buniek potrebná na úspešnú transplantáciu buniek z pupočníkovej krvi je však 3,7 x 107 ^jadrových buniek na 1 kg telesnej hmotnosti príjemcu. Použitie menšieho počtu hematopoetických kmeňových buniek z pupočníkovej krvi významne zvyšuje riziko zlyhania štepu a relapsu ochorenia. Preto sa transplantácia hematopoetických kmeňových buniek z pupočníkovej krvi používa hlavne na liečbu hemoblastóz u detí.

Bohužiaľ, stále neexistujú žiadne štandardy pre odber ani štandardizované protokoly pre klinické použitie hematopoetických buniek z pupočníkovej krvi. Preto samotné kmeňové bunky z pupočníkovej krvi nie sú legálne uznávaným zdrojom hematopoetických buniek na transplantáciu. Okrem toho neexistujú žiadne etické ani právne normy upravujúce činnosť a organizáciu bánk pupočníkovej krvi, ktoré existujú v zahraničí. Medzitým, pre bezpečnú transplantáciu musia byť všetky vzorky pupočníkovej krvi starostlivo monitorované. Pred odberom krvi od tehotnej ženy je potrebné získať jej súhlas. Každá tehotná žena musí byť vyšetrená na nosičstvo HBsAg, prítomnosť protilátok proti vírusom hepatitídy C, HIV a syfilisu. Každá vzorka pupočníkovej krvi musí byť štandardne testovaná na počet jadrových buniek, CD34+ a schopnosť tvoriť kolónie. Okrem toho sa vykonáva typizácia HbA, stanovenie krvnej skupiny pomocou ABO a jej príslušnosti podľa Rh faktora. Potrebné testovacie postupy sú bakteriologická kultúra na sterilitu, sérologické testovanie na infekcie HIV-1 a HIV-2, HBsAg, vírusovú hepatitídu C, cytomegalovírusovú infekciu, HTLY-1 a HTLY-II, syfilis a toxoplazmózu. Okrem toho sa na detekciu cytomegalovírusových a HIV infekcií vykonáva polymerázová reťazová reakcia. Zdá sa vhodné doplniť testovacie protokoly o analýzu GSC z pupočníkovej krvi na detekciu genetických ochorení, ako je α-talasémia, kosáčikovitá anémia, deficit adenozíndeaminázy, Brutonova agamaglobulinémia, Hurlerova a Ponterova choroba.

Ďalšou fázou prípravy na transplantáciu je otázka konzervácie hematopoetických kmeňových buniek. Najnebezpečnejšími postupmi pre životaschopnosť buniek počas ich prípravy sú zmrazovanie a rozmrazovanie. Pri zmrazovaní hematopoetických buniek môže byť ich významná časť zničená v dôsledku tvorby kryštálov. Na zníženie percenta bunkovej smrti sa používajú špeciálne látky - kryoprotektory. Najčastejšie sa ako kryoprotektor používa DMSO v konečnej koncentrácii 10 %. DMSO v takejto koncentrácii sa však vyznačuje priamym cytotoxickým účinkom, ktorý sa prejavuje aj za podmienok minimálnej expozície. Zníženie cytotoxického účinku sa dosahuje prísnym udržiavaním nulovej teploty expozičného režimu, ako aj dodržiavaním predpisov pre spracovanie materiálu počas a po rozmrazovaní (rýchlosť všetkých manipulácií, použitie viacerých premývacích postupov). Nemali by sa používať koncentrácie DMSO nižšie ako 5 %, pretože to spôsobuje masívnu smrť hematopoetických buniek počas obdobia zmrazovania.

Prítomnosť erytrocytových nečistôt v suspenznej zmesi hematopoetických kmeňových buniek vytvára riziko vzniku reakcie nekompatibility s erytrocytovými antigénmi. Zároveň sa po odstránení erytrocytov výrazne zvyšuje strata hematopoetických buniek. V tejto súvislosti bola navrhnutá metóda nefrakcionovanej izolácie hematopoetických kmeňových buniek. V tomto prípade sa na ochranu jadrových buniek pred škodlivými účinkami nízkych teplôt používa 10 % roztok DMSO a konštantná rýchlosť chladenia (GS/min) na -80 °C, po čom sa bunková suspenzia zmrazí v tekutom dusíku. Predpokladá sa, že táto metóda kryokonzervácie vedie k čiastočnej lýze erytrocytov, takže vzorky krvi nevyžadujú frakcionáciu. Pred transplantáciou sa bunková suspenzia rozmrazí, premyje od voľného hemoglobínu a DMSO v roztoku ľudského albumínu alebo v krvnom sére. Konzervácia hematopoetických prekurzorov pri použití tejto metódy je síce vyššia ako po frakcionácii pupočníkovej krvi, ale riziko transfúznych komplikácií v dôsledku transfúzie ABO-nekompatibilných erytrocytov zostáva.

Vyššie uvedené problémy by mohlo vyriešiť vytvorenie bankového systému na uchovávanie vzoriek HSC testovaných a typizovaných pomocou HLA. Vyžaduje si to však vypracovanie etických a právnych noriem, o ktorých sa v súčasnosti iba diskutuje. Pred vytvorením bankovej siete je potrebné prijať množstvo predpisov a dokumentov o štandardizácii postupov odberu, frakcionácie, testovania a typizácie, ako aj kryokonzervácie HSC. Povinnou podmienkou pre efektívne fungovanie bánk HSC je organizácia počítačovej základne pre interakciu s registrami Svetovej asociácie darcov drene (WMDA) a Národného programu darcov drene Spojených štátov (NMDP).

Okrem toho je potrebné optimalizovať a štandardizovať metódy expanzie HSC in vitro, predovšetkým hematopoetických buniek z pupočníkovej krvi. Expanzia HSC z pupočníkovej krvi je nevyhnutná na zvýšenie počtu potenciálnych príjemcov kompatibilných so systémom HLA. Vzhľadom na malé objemy pupočníkovej krvi počet HSC v nej obsiahnutých zvyčajne nedokáže zabezpečiť repopuláciu kostnej drene u dospelých pacientov. Zároveň je na vykonanie nepríbuzných transplantácií potrebný prístup k dostatočnému počtu typovaných vzoriek HSC (od 10 000 do 1 500 000 na príjemcu).

Transplantácia hematopoetických kmeňových buniek neodstraňuje komplikácie, ktoré sprevádzajú transplantáciu kostnej drene. Analýzy ukazujú, že pri transplantácii kmeňových buniek z pupočníkovej krvi sa u 23 % príjemcov vyvinú závažné formy akútnej reakcie štepu proti hostiteľovi a u 25 % príjemcov chronické formy. U onkohematologických pacientov sa relapsy akútnej leukémie počas prvého roka po transplantácii kmeňových buniek z pupočníkovej krvi pozorujú v 26 % prípadov.

V posledných rokoch sa intenzívne rozvíjajú metódy transplantácie periférnych hematopoetických kmeňových buniek. Obsah HSC v periférnej krvi je taký malý (1 HSC na 100 000 krviniek), že ich izolácia bez špeciálnej prípravy nemá zmysel. Preto sa darcovi najprv podá kurz liekovej stimulácie uvoľňovania hematopoetických buniek z kostnej drene do krvi. Na tento účel sa používajú také nie neškodné lieky, ako je cyklofosfamid a faktor stimulujúci kolónie granulocytov. Ale ani po procedúre mobilizácie HSC do periférnej krvi obsah CD34+ buniek v nej nepresahuje 1,6 %.

Na mobilizáciu hematopoetických kmeňových buniek v klinických podmienkach sa najčastejšie používa S-SEC, ktorá sa vyznačuje relatívne dobrou toleranciou, s výnimkou takmer prirodzeného výskytu bolesti kostí. Treba poznamenať, že použitie moderných krvných separátorov umožňuje efektívnu izoláciu hematopoetických kmeňových buniek. Za normálnych podmienok hematopoézy je však potrebné vykonať najmenej 6 procedúr, aby sa získal dostatočný počet hematopoetických kmeňových buniek porovnateľných repopulačnou kapacitou so suspenziou kostnej drene. Každý takýto postup vyžaduje spracovanie 10 – 12 litrov krvi na separátore, čo môže spôsobiť trombocytopéniu a leukopéniu. Separačný postup zahŕňa zavedenie antikoagulantu (citrátu sodného) darcovi, čo však nevylučuje kontaktnú aktiváciu krvných doštičiek počas extrakorporálnej centrifugácie. Tieto faktory vytvárajú podmienky pre rozvoj infekčných a hemoragických komplikácií. Ďalšou nevýhodou metódy je významná variabilita mobilizačnej odpovede, ktorá si vyžaduje sledovanie obsahu HSC v periférnej krvi darcov, čo je potrebné na stanovenie ich maximálnej hladiny.

Autogénna transplantácia hematopoetických kmeňových buniek, na rozdiel od alogénnej transplantácie, úplne eliminuje rozvoj rejekčnej reakcie. Významnou nevýhodou autotransplantácie hematopoetických kmeňových buniek, ktorá obmedzuje rozsah indikácií pre jej vykonanie, je však vysoká pravdepodobnosť reinfúzie leukemických klonových buniek s transplantátom. Okrem toho absencia imunitne sprostredkovaného efektu „štep verzus nádor“ významne zvyšuje frekvenciu relapsov malígnych ochorení krvi. Preto jedinou radikálnou metódou eliminácie neoplastickej klonálnej hematopoézy a obnovenia normálnej polyklonálnej hematopoézy pri myelodysplastických syndrómoch zostáva intenzívna polychemoterapia s transplantáciou alogénnej hematopoézy.

Ale aj v tomto prípade je liečba väčšiny hemoblastóz zameraná iba na zvýšenie doby prežitia pacientov a zlepšenie ich kvality života. Podľa niekoľkých rozsiahlych štúdií sa dlhodobé prežitie bez relapsu po alotransplantácii HSC dosiahne u 40 % onkohematologických pacientov. Pri použití kmeňových buniek HLA-kompatibilného súrodenca sa najlepšie výsledky pozorujú u mladých pacientov s krátkou anamnézou ochorenia, počtom blastových buniek do 10 % a priaznivou cytogenetikou. Bohužiaľ, úmrtnosť spojená s postupom alotransplantácie HSC u pacientov s myelodysplastickými ochoreniami zostáva vysoká (vo väčšine správ - približne 40 %). Výsledky 10-ročnej práce Národného programu darcovstva kostnej drene v USA (510 pacientov, medián veku - 38 rokov) naznačujú, že prežitie bez relapsu počas dvoch rokov je 29 % s relatívne nízkou pravdepodobnosťou relapsu (14 %). Úmrtnosť spojená s alotransplantáciou HSC od nepríbuzného darcu je však extrémne vysoká a dosahuje 54 % počas dvoch rokov. Podobné výsledky sa dosiahli v európskej štúdii (118 pacientov, medián veku - 24 rokov, dvojročné prežitie bez relapsu - 28 %, relaps - 35 %, úmrtnosť - 58 %).

Počas intenzívnych chemoterapeutických kurzov s následnou obnovou hematopoézy alogénnymi hematopoetickými bunkami sa často vyskytujú imunohematologické a transfúzne komplikácie. Sú do značnej miery spôsobené tým, že ľudské krvné skupiny sa dedia nezávisle od molekúl MHC. Preto aj keď sú darca a príjemca kompatibilní pre hlavné HLA antigény, ich erytrocyty môžu mať odlišné fenotypy. Rozlišuje sa medzi „veľkou“ inkompatibilitou, keď má príjemca už existujúce protilátky proti erytrocytovým antigénom darcu, a „menej veľkou“ inkompatibilitou, keď má darca protilátky proti erytrocytovým antigénom príjemcu. Možné sú prípady kombinácie „veľkej“ a „menej veľkej“ inkompatibility.

Výsledky porovnávacej analýzy klinickej účinnosti alotransplantácie hematopoetických kmeňových buniek kostnej drene a pupočníkovej krvi pri hemoblastózach naznačujú, že u detí po alotransplantácii hematopoetických kmeňových buniek z pupočníkovej krvi je riziko vzniku reakcie štep verzus hostiteľ významne znížené, ale pozoruje sa dlhšie obdobie obnovy počtu neutrofilov a krvných doštičiek s vyšším výskytom 100-dňovej úmrtnosti po transplantácii.

Štúdium príčin skorej úmrtnosti umožnilo objasniť kontraindikácie alogénnej transplantácie HSC, medzi ktorými sú najdôležitejšie:

• prítomnosť pozitívnych testov na cytomegalovírusovú infekciu u príjemcu alebo darcu (bez preventívnej liečby);
• akútna choroba z ožiarenia;
• prítomnosť alebo dokonca podozrenie na prítomnosť mykotickej infekcie u pacienta (bez vykonania systémovej včasnej profylaxie fungicídnymi liekmi);
• hemoblastózy, pri ktorých pacienti dostávali dlhodobú liečbu cytostatikami (kvôli vysokej pravdepodobnosti náhlej zástavy srdca a zlyhania viacerých orgánov);
• transplantácia od HLA-neidentických darcov (bez profylaxie akútnej reakcie štepu proti hostiteľovi cyklosporínom A);
• chronická vírusová hepatitída C (kvôli vysokému riziku vzniku venookluzívneho ochorenia pečene).

Transplantácia HSC teda môže spôsobiť závažné komplikácie, ktoré často vedú k úmrtiu. V skorom období (až 100 dní po transplantácii) patria medzi ne infekčné komplikácie, akútna reakcia štepu proti hostiteľovi, odmietnutie štepu (zlyhanie darcovských HSC), venookluzívne ochorenie pečene, ako aj poškodenie tkaniva spôsobené toxicitou kondicionačného režimu, ktorý sa vyznačuje vysokou mierou remodelácie (koža, cievny endotel, črevný epitel). Medzi komplikácie neskorého obdobia po transplantácii patrí chronická reakcia štepu proti hostiteľovi, relapsy základného ochorenia, spomalenie rastu u detí, dysfunkcia reprodukčného systému a štítnej žľazy a poškodenie očí.

Nedávno sa v súvislosti s publikáciami o plasticite buniek kostnej drene objavila myšlienka využitia HSC na liečbu infarktov a iných ochorení. Hoci niektoré experimenty na zvieratách túto možnosť podporujú, závery o plasticite buniek kostnej drene je potrebné potvrdiť. Túto okolnosť by mali vziať do úvahy tí výskumníci, ktorí sa domnievajú, že transplantované ľudské bunky kostnej drene sa ľahko transformujú na bunky kostrového svalstva, myokardu alebo CNS. Hypotéza, že HSC sú prirodzeným bunkovým zdrojom regenerácie týchto orgánov, si vyžaduje seriózne dôkazy.

Predovšetkým boli publikované prvé výsledky otvorenej randomizovanej štúdie V. Belenkova (2003). Jej cieľom bolo študovať vplyv C-SvK (t. j. mobilizácie autológnych HSC do krvi) na klinický, hemodynamický a neurohumorálny stav pacientov so stredne ťažkým až ťažkým chronickým srdcovým zlyhaním, ako aj vyhodnotiť jej bezpečnosť na pozadí štandardnej liečby (inhibítory angiotenzín konvertujúceho enzýmu, beta-blokátory, diuretiká, srdcové glykozidy). V prvej publikácii výsledkov štúdie autori programu poznamenávajú, že jediným argumentom v prospech O-SvK sú výsledky liečby jedného pacienta, u ktorého došlo k nespornému zlepšeniu všetkých klinických a hemodynamických parametrov na pozadí liečby týmto liekom. Teória mobilizácie HSC do krvného obehu s následnou regeneráciou myokardu v postinfarktovej zóne sa však nepotvrdila - ani u pacienta s pozitívnou klinickou dynamikou stresová echokardiografia s dobutamínom neodhalila výskyt zón životaschopného myokardu v oblasti jazvy.

Treba poznamenať, že v súčasnosti zjavne neexistuje dostatok údajov na to, aby sa dala odporúčať substitučná bunková terapia na široké zavedenie do každodennej klinickej praxe. Na určenie účinnosti rôznych možností regeneratívnej bunkovej terapie, vypracovanie indikácií a kontraindikácií pre ňu, ako aj usmernení pre kombinované použitie regeneratívno-plastickej terapie a tradičnej chirurgickej alebo konzervatívnej liečby sú potrebné dobre navrhnuté a kvalitné klinické štúdie. Stále neexistuje odpoveď na otázku, ktorá konkrétna populácia buniek kostnej drene (kmeňové hematopoetické alebo stromálne) môže viesť k vzniku neurónov a kardiomyocytov, a tiež nie je jasné, aké podmienky k tomu prispievajú in vivo.

Práca v týchto oblastiach sa vykonáva v mnohých krajinách. V zhrnutí sympózia o akútnom zlyhaní pečene Národných inštitútov zdravia USA sa medzi sľubnými metódami liečby popri transplantácii pečene uvádza transplantácia xeno- alebo alogénnych hepatocytov a mimotelové prepojenie bioreaktorov s pečeňovými bunkami. Existujú priame dôkazy o tom, že iba cudzie funkčne aktívne hepatocyty sú schopné poskytnúť účinnú podporu pečeni príjemcu. Pre klinické použitie izolovaných hepatocytov je potrebné vytvoriť bunkovú banku, ktorá výrazne skráti čas medzi izoláciou buniek a ich použitím. Najprijateľnejšou metódou na vytvorenie banky izolovaných hepatocytov je kryokonzervácia pečeňových buniek v tekutom dusíku. Pri použití takýchto buniek v klinických podmienkach u pacientov s akútnym a chronickým zlyhaním pečene sa zistil pomerne vysoký terapeutický účinok.

Napriek optimistickým a povzbudivým výsledkom transplantácie pečeňových buniek v experimentoch a klinickej praxi stále existuje mnoho problémov, ktoré nie sú ani zďaleka vyriešené. Patrí medzi ne obmedzený počet orgánov vhodných na získanie izolovaných hepatocytov, nedostatočne účinné metódy ich izolácie, absencia štandardizovaných metód na konzerváciu pečeňových buniek, nejasné predstavy o mechanizmoch regulácie rastu a proliferácie transplantovaných buniek, absencia adekvátnych metód na hodnotenie uchytenia alebo odmietnutia alogénnych hepatocytov. Patrí sem aj prítomnosť transplantačnej imunity pri použití alogénnych a xenogénnych buniek, aj keď menšia ako pri ortotopickej transplantácii pečene, ale vyžadujúca použitie imunosupresív, enkapsuláciu izolovaných hepatocytov alebo ich špeciálnu úpravu enzýmami. Transplantácia hepatocytov často vedie k imunitnému konfliktu medzi príjemcom a darcom vo forme rejekčnej reakcie, ktorá si vyžaduje použitie cytostatík. Jedným z riešení tohto problému môže byť použitie polymérnych mikroporéznych nosičov na izoláciu pečeňových buniek, čo zlepší ich prežitie, pretože membrána kapsuly účinne chráni hepatocyty napriek imunizácii hostiteľa.

Pri akútnom zlyhaní pečene je však takáto transplantácia hepatocytov neúčinná kvôli relatívne dlhému času potrebnému na uchytenie pečeňových buniek v novom prostredí a dosiahnutie štádia optimálnej funkcie. Potenciálnym obmedzením je sekrécia žlče počas ektopickej transplantácie izolovaných hepatocytov a pri použití bioreaktorov je významnou fyziologickou bariérou druhový nesúlad medzi ľudskými proteínmi a proteínmi produkovanými xenogénnymi hepatocytmi.

V literatúre sa uvádza, že lokálna transplantácia stromálnych kmeňových buniek kostnej drene uľahčuje účinnú korekciu kostných defektov a obnova kostného tkaniva v tomto prípade prebieha intenzívnejšie ako pri spontánnej reparatívnej regenerácii. Niekoľko predklinických štúdií na experimentálnych modeloch presvedčivo demonštruje možnosť použitia transplantátov stromálnych buniek kostnej drene v ortopédii, hoci je potrebná ďalšia práca na optimalizácii týchto metód, a to aj v najjednoduchších prípadoch. Najmä optimálne podmienky pre expanziu osteogénnych stromálnych buniek ex vivo ešte neboli nájdené a štruktúra a zloženie ich ideálneho nosiča (matrice) zostávajú nevyvinuté. Minimálny počet buniek potrebný na objemovú regeneráciu kostí nebol stanovený.

Bolo dokázané, že mezenchymálne kmeňové bunky vykazujú transgermálnu plasticitu, t. j. schopnosť diferencovať sa na bunkové typy fenotypovo nesúvisiace s bunkami pôvodnej línie. Za optimálnych kultivačných podmienok dokážu polyklonálne línie stromálnych kmeňových buniek kostnej drene vydržať viac ako 50 delení in vitro, čo umožňuje získať miliardy stromálnych buniek z 1 ml aspirátu kostnej drene. Populácia mezenchymálnych kmeňových buniek je však heterogénna, čo sa prejavuje variabilitou veľkosti kolónií, rôznou rýchlosťou ich tvorby a morfologickou rozmanitosťou bunkových typov, od fibroblastom podobných vretenovito tvarovaných buniek až po veľké ploché bunky. Fenotypová heterogenita sa pozoruje už po 3 týždňoch kultivácie stromálnych kmeňových buniek: niektoré kolónie tvoria uzlíky kostného tkaniva, iné tvoria zhluky adipocytov a ďalšie, zriedkavejšie, tvoria ostrovčeky chrupavkového tkaniva.

Transplantácia embryonálneho nervového tkaniva sa pôvodne používala na liečbu degeneratívnych ochorení centrálneho nervového systému. V posledných rokoch sa namiesto embryonálneho mozgového tkaniva transplantujú bunkové prvky neurosfér získané z nervových kmeňových buniek (Poltavtseva, 2001). Neurosféry obsahujú viazané prekurzory neurónov a neuroglie, čo dáva nádej na obnovenie stratených mozgových funkcií po ich transplantácii. Po transplantácii dispergovaných buniek neurosfér do oblasti striata mozgu potkana sa zaznamenala ich proliferácia a diferenciácia na dopaminergné neuróny, čo eliminovalo motorickú asymetriu u potkanov s experimentálnym hemiparkinsonizmom. V niektorých prípadoch sa však z buniek neurosfér vyvinuli nádory, čo viedlo k úhynu zvierat (Bjorklund, 2002).

V klinike dôkladné štúdie dvoch skupín pacientov, v ktorých ani pacienti, ani lekári, ktorí ich pozorovali, nevedeli (dvojito zaslepená štúdia), že jednej skupine pacientov bolo transplantované embryonálne tkanivo s neurónmi produkujúcimi dopamín a druhá skupina pacientov podstúpila simulovanú operáciu, priniesli neočakávané výsledky. Pacienti, ktorým bolo transplantované embryonálne nervové tkanivo, sa necítili o nič lepšie ako pacienti v kontrolnej skupine. Okrem toho sa u 5 z 33 pacientov 2 roky po transplantácii embryonálneho nervového tkaniva vyvinula pretrvávajúca dyskinéza, ktorá nebola prítomná u pacientov v kontrolnej skupine (Kmeňové bunky: vedecký pokrok a budúce smery výskumu. Národný ústav zdravia. USA). Jedným z nevyriešených problémov klinického výskumu nervových kmeňových buniek mozgu zostáva analýza reálnych perspektív a obmedzení transplantácie ich derivátov na korekciu porúch CNS. Je možné, že neuronogenéza v hipokampe vyvolaná dlhodobou záchvatovou aktivitou, vedúca k jeho štrukturálnej a funkčnej reorganizácii, môže byť faktorom progresívneho rozvoja epilepsie. Tento záver si zaslúži osobitnú pozornosť, pretože poukazuje na možné negatívne dôsledky tvorby nových neurónov v zrelom mozgu a tvorby aberantných synaptických spojení nimi.

Netreba zabúdať, že kultivácia v médiách s cytokínmi (mitogénmi) približuje vlastnosti kmeňových buniek k vlastnostiam nádorových buniek, pretože v nich dochádza k podobným zmenám v regulácii bunkových cyklov, ktoré určujú schopnosť neobmedzeného delenia. Je bezohľadné transplantovať skoré deriváty embryonálnych kmeňových buniek človeku, pretože v tomto prípade je riziko vzniku malígnych nádorov veľmi vysoké. Oveľa bezpečnejšie je použiť ich angažovanejšie potomstvo, teda prekurzorové bunky diferencovaných línií. V súčasnosti však ešte nebola vyvinutá spoľahlivá technika na získanie stabilných línií ľudských buniek, ktoré sa diferencujú požadovaným smerom.

Využitie technológií molekulárnej biológie na korekciu dedičných patológií a ľudských ochorení modifikáciou kmeňových buniek je pre praktickú medicínu veľmi zaujímavé. Vlastnosti genómu kmeňových buniek umožňujú vyvinúť jedinečné transplantačné schémy na korekciu genetických ochorení. V tejto oblasti však existuje množstvo obmedzení, ktoré je potrebné prekonať pred praktickým využitím genetického inžinierstva kmeňových buniek. V prvom rade je potrebné optimalizovať proces modifikácie genómu kmeňových buniek ex vivo. Je známe, že dlhodobá (3-4 týždne) proliferácia kmeňových buniek znižuje ich transfekciu, takže na dosiahnutie vysokej úrovne ich genetickej modifikácie je potrebných niekoľko transfekčných cyklov. Hlavný problém je však spojený s trvaním terapeutickej génovej expresie. Doteraz v žiadnej štúdii nepresiahla doba účinnej expresie po transplantácii modifikovaných buniek štyri mesiace. V 100 % prípadov sa expresia transfekovaných génov časom znižuje v dôsledku inaktivácie promótorov a/alebo smrti buniek s modifikovaným genómom.

Dôležitou otázkou sú náklady na používanie bunkových technológií v medicíne. Napríklad odhadovaná ročná potreba financovať len liečebné náklady transplantačnej jednotky kostnej drene určenej na vykonávanie 50 transplantácií ročne je približne 900 000 USD.

Vývoj bunkových technológií v klinickej medicíne je zložitý a viacstupňový proces, ktorý zahŕňa konštruktívnu spoluprácu medzi multidisciplinárnymi vedeckými a klinickými centrami a medzinárodnou komunitou. Zároveň si osobitnú pozornosť vyžadujú otázky vedeckej organizácie výskumu v oblasti bunkovej terapie. Najdôležitejšie z nich sú vývoj protokolov klinického výskumu, kontrola spoľahlivosti klinických údajov, tvorba národného registra štúdií, integrácia do medzinárodných programov multicentrických klinických štúdií a implementácia výsledkov do klinickej praxe.

Na záver úvodu k problematike bunkovej transplantológie by som chcel vyjadriť nádej, že zjednotenie úsilia popredných ukrajinských špecialistov z rôznych oblastí vedy zabezpečí významný pokrok v experimentálnom a klinickom výskume a v nasledujúcich rokoch umožní nájsť účinné spôsoby poskytovania pomoci ťažko chorým ľuďom, ktorí potrebujú transplantáciu orgánov, tkanív a buniek.

[ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ]