Experimentálne modely osteoartritídy

Chrupavka je vysoko špecializovaná tkanina, ktorá obsahuje iba jeden typ buniek (chondrocyty), ktorý sa vyznačuje absenciou krvných a lymfatických ciev. Výživa chrupavky sa vykonáva hlavne absorpciou zo synoviálnej tekutiny. Metabolizmus chondrocytov je regulovaný množstvom rozpustných faktorov produkovaných lokálne chondrocytmi a okolitými tkanivami. Funkcia chondrocytov závisí tiež od zloženia extracelulárneho média (napätie kyslíka, koncentrácia iónov, pH atď.), Zloženie VCM, interakcia buniek a matrice, fyzické signály. Hlavnou úlohou experimentálneho modelovania je vytvorenie kultúr v extracelulárnom prostredí bez zmeny fenotypu zrelých buniek. Druhou úlohou je vytvoriť kultúry na štúdium predčasnej, oneskorenej, krátkej alebo dlhodobej odpovede chondrocytov na chemické a / alebo fyzické signály. Štúdia in vitro tiež poskytujú príležitosť na štúdium správania chondrocytov u osteoartrózy. Treťou úlohou je vývoj ko-liečebných systémov, ktoré umožňujú študovať interakcie rôznych tkanív v kĺbe. Štvrtou úlohou je príprava chrupavkových implantátov pre následnú transplantáciu. A napokon piatou úlohou je študovať rastové faktory, cytokíny alebo terapeutické činidlá, ktoré sú schopné stimulovať opravu a / alebo inhibovať jeho resorpciu chrupavky.

Počas posledných desaťročí boli vytvorené rôzne modely kultúr bunkových kĺbov, vrátane monovrstvových kultúr, suspendovaných kultúr, chondrónových kultúr, explantátov, kokultúr, nesmrteľných bunkových kultúr. Každá kultúra má svoje výhody a nevýhody a každá z nich je vhodná na štúdium jedného konkrétneho aspektu metabolizmu chondrocytov. Takže chrupavkové explantáty sú vynikajúcim modelom pre štúdium obratu matricových prvkov, ktoré vyžadujú skutočné bunkové povrchové receptory a normálne interakcie bunka-matrica a matrix-bunka. Súčasne sa odporúča, aby sa štúdia usadenín v matrici alebo mechanizmy na reguláciu metabolizmu chondrocytov vykonávala na kultúre izolovaných buniek. Na štúdium procesu diferenciácie buniek je potrebná jednovrstvová kultúra s nízkou hustotou. Kultúry suspendované v prírodnej alebo syntetickej matrici sú modelom na analýzu adaptačnej reakcie chondrocytov na mechanické napätie.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]

Chondrocytové kultúry

Pri výbere tkanív chrupavky pre in vitro štúdie je potrebné zvážiť niekoľko dôležitých bodov. Zloženie matrice a metabolická aktivita chondrocytov sa líšia v rôznych kĺboch a tie závisia aj od hĺbky chondrocytu v tkanive. Tieto údaje boli získané v niekoľkých experimentoch, v ktorých boli študované izolované subpopulácie chondrocytov z chrupavkových zón rôznych hĺbok. Početné morfologické a biochemické rozdiely sa zistili medzi kultivovanými chondrocytmi umiestnenými v povrchu a hlbokými vrstvami kĺbovej chrupavky. Povrchové bunky syntetizujú vzácnu, ochudobnenú proteoglykánovú vláknitú matricu, zatiaľ čo hlbšie bunky produkujú matricu, ktorá je bohatá na vlákna a proteoglykány. Okrem toho povrchové bunky produkujú relatívne viac malých nezagregovaných proteoglykánov a kyseliny hyalurónovej a relatívne menej agregánu a keratansulfátu ako hlbšie umiestnené chondrocyty. Ďalším dôležitým znakom metabolizmu chondrocytov izolovaných z chrupavkových zón rôznych hĺbok je odozva na exogénny stimul. Podľa M. Aydelotte a spoluautorov boli býčie chondrocyty z povrchovej zóny chrupavky citlivejšie na IL-1 ako bunky hlbokej zóny.

Chovanie buniek závisí aj od umiestnenia tkaniva. Chondrocyty chrupavky a ušné hrany, zhotovených z rovnakého zvieraťa, ktoré reagujú rôzne na rastové faktory, ako je fibroblastový rastový faktor (FGF) a TGF-beta. FGF zvýšil inkorporáciu tymidínu, prolínu a leucínu do chondrocytovej kultúry rebrá, ale nie do ucha. TGF-P zvyšuje inkorporácii tymidínu do chrupavky chondrocytov rebrá a ucha, ale nemal žiadny účinok na inkorporácii tymidínu do chondrocytov a prolínu ucha. Bunky chrupavky získané z oblastí s najväčšou záťažou sa líšia od tých miest s nízkym zaťažením chrupavky. Napríklad, zrelých chondrocytov z chrupavky kolenného kĺbu z centrálnej oblasti ovce kĺbovej tibiálne povrch kostí sa nevzťahuje menisku, ktorý nesie najväčšie zaťaženie in vivo, menšie syntetizovaný agrekanu, dekorinu ale väčšie než buniek oblastiach, ktorých sa menisku. Autori tiež zdôrazňujú dôležitosť použitia chrupavky z identických kĺbových zón pri skúmaní syntetickej funkcie kĺbov.

Metabolizmus chondrocytov a ich reakcia na regulačné faktory tiež významne závisia od veku darcu, vývoja jeho kostry a stavu kĺbov, z ktorých sa bunky odoberajú. V ľudských chondrocytoch sa pozoruje významný pokles s vekom proliferačnej odpovede. Najväčší pokles zaznamenali darcovia vo veku 40-50 rokov a viac ako 60 rokov. Navyše závažnosť proliferatívnej odpovede na rastové faktory (napr. FGF a TGF-beta) klesá počas starnutia. Okrem kvantitatívnych zmien v proliferácii chondrocytov existujú aj kvalitatívne zmeny. Bunky mladých darcov (vo veku 10 až 20 rokov) lepšie reagujú na rastový faktor odvodený od krvných doštičiek (PDGF) ako na TGF-beta, zatiaľ čo protilátka sa pozoruje u dospelých darcovských buniek. Na vysvetlenie vekových závislých zmien v syntetickej funkcii chondrocytov a ich reakcie na účinok rastových faktorov sa používa niekoľko mechanizmov. Medzi nimi je zníženie počtu a afinity povrchových bunkových receptorov, zmena syntézy a bioaktivity rastových faktorov a cytokínov, modifikácia postreceptorových signálov.

Patologický stav kĺbov tiež mení morfológiu a metabolickú aktivitu chondrocytov. Takže J. Kouri a spoluautori (1996) identifikovali tri subpopulácie chondrocytov v chrupke s osteoartritídou. Chondrocyty z povrchnej a hornej časti chrupavky tvoria klastre a syntetizujú viac proteoglykánov a kolagénu. TGF-beta a rastový faktor podobný inzulínu (IGF) sú schopné stimulovať syntézu proteoglykánov chondrocytmi a čiastočne neutralizovať účinky IL-1 a TNF-a. Chrupavky explantáty boli postihnuté s osteoartritídou a chondrocyty izolované z chrupavky u pacientov s osteoartritídou, sú citlivejšie na stimuláciu TGF-beta ako zdravie chondrocyty chrupavky. Tieto rozdiely sa s najväčšou pravdepodobnosťou spájajú s fenotypovými zmenami chondrocytov v horných vrstvách kĺbovej chrupavky.

Izolácia jednotlivých chondrocytov je dosiahnutá sekvenčnou liečbou proteolytickými enzýmami ECM. Po ich uvoľnení z ECM sú izolované bunky ideálne vhodné na štúdium syntézy de novo matricových zložiek . Niektorí autori používajú len klostridium kolagenázu, iní preinkubujú chrupavku trypsínom, pronázou, DNázou a / alebo hyaluronidázou. Počet izolovaných buniek závisí od použitých enzýmov. Teda, pri spracovaní jedného z 1 g kolagenázy tkaniva môže byť získaná 1,4T0 ⁶ chondrocyty, zatiaľ čo pri použití prednáša, Hyaluronidase a kolagenázu - 4,3-10 ⁶. Pri spracovaní s kolagenázou aggrecan, proteíny, IL-6, IL-8 zostávajú v bunkovej kultúre oveľa viac ako v prípade postupného ošetrenia rôznymi enzýmami. Existuje niekoľko vysvetlení týchto rozdielov medzi dvoma bunkovými kultúrami:

• Bunkové receptory poškodené alebo depresie pôsobením enzýmov, TGF-beta inhibuje syntézu DNA proteoglykánov v novo izolovaných chondrocytov (deň 1), zatiaľ čo DNA a proteoglykanu syntézy chondrocytov kultivovaných v monovrstvě (7 dní) stimulovanej TGF-beta. Avšak na opätovné vystavenie týchto komponentov membrány je potrebná adekvátna doba pred začiatkom experimentu.
• Exogénne proteázy môžu prerušiť interakciu buniek a matrice, ktoré sú sprostredkované integrínmi. Rodina integrínov podporuje naviazanie chondrocytov na molekuly VKM (Shakibaei M. A kol., 1997) .Táto ruptúra môže ovplyvniť expresiu génov matrice.
• Zvyšky matricových zložiek môžu regulovať syntetickú funkciu chondrocytov. Integríny dokážu rozpoznať produkty degradácie ECM, a tým zohrávajú dôležitú úlohu pri oprave tkaniva po expozícii proteolytickým enzýmom. T. Larsson a spoluautori (1989) uviedli, že pridanie intaktných alebo fragmentovaných pro-teoglykánov do bunkovej kultúry stimuluje syntézu proteínov a proteoglykánov. Avšak, vysoké hladiny kyseliny hyalurónovej spôsobuje významné zníženie v začlenení síranu proteoglykanu syntézy chondrocytov chondrocyty kuracích embryí zrelý prasacej a potkania chondrosarkom bunky. Okrem toho kyselina hyaluronová - inhibítor proteoglykanu uvoľňovanie z buniek aj v prítomnosti IL-lb, TNF-a, FGF, čo ukazuje, že pôsobí proti prvej biologickú aktivitu rastových faktorov a cytokínov. Presný mechanizmus, ktorý je základom pôsobenia kyseliny hyalurónovej, zostáva nejasný; Je známe, že chondrocyty obsahujú receptor pre kyselinu hyalurónovú, spojenú s aktínovými vláknami cytosolu. Väzba kyseliny hyalurónovej na jej receptor stimuluje fosforyláciu proteínov. Tieto údaje teda demonštrujú moduláciu metabolickej funkcie chondrocytov fragmentovanými alebo natívnymi molekulami matricových proteínov aktiváciou membránových receptorových buniek.
• Rýchla stimulácia syntézy matrice chondrocytov enzýmových proteínov môže byť v dôsledku zmien tvare chondrocytov a / alebo reorganizácii cytoskeletu.
• Niektoré cytokíny (napr. IL-8) a rastové faktory (napr. IGF-1, TGF-P) sú fixované v ECM. Najznámejším príkladom je väzba TGF-beta s dekórom, čo vedie k zníženiu schopnosti pôvodcu indukovať bunkový rast buniek vaječníkov u čínskych škrečkov. Údaje o tom, že obsah dekorácie chrupavky sa zvyšuje s vekom, naznačujú pokles biologickej dostupnosti TGF-beta pri starnutí. Rastové faktory a cytokíny sa môžu uvoľňovať z matricových zvyškov počas kultivácie a potom modulovať funkciu chondrocytov.

[8], [9], [10], [11],

Jednovrstvová kultúra chondrocytov

Diferencovaný fenotyp chondrocytov je primárne charakterizovaný syntézou kolagénu typu II a tkanivovo špecifickými proteoglykánmi, ako aj nízkou úrovňou mitotickej aktivity. Existujú dôkazy, že dlhodobé kultiváciu buniek v monovrstvě, a po niekoľkých opakovaných pasážach buniek, chondrocytov strácajú svoj tvar gule, stane sa podlhovastý, fibroblastov podobný tvar. S takým fibroblastov metaplázia syntetickej funkcie je tiež modifikované bunky, charakterizované progresívnym znížením syntézy kolagénu II, IX a XI typy a zlepšená syntéza kolagénu I, III a Utipov. Malé neagregované proteoglykány sa syntetizujú funkčným agregánom. Syntetzatepsín B a L je extrémne nízky v diferencovaných bunkách, ale v procese straty diferenciácie sa zvyšuje. Kolagenáza-1 je exprimovaná v diferencovaných chondrocytoch s predĺženou kultiváciou, jej expresia sa znižuje, zatiaľ čo produkcia tkanivových inhibítorov metaloproteáz (TIMP) sa zvyšuje.

Diferencované chondrocyty re-exprimujú kolagén diferencovaného fenotypu, keď sú prenesené z monovrstvovej kultúry na suspendovanú. Proces diferenciácie pravdepodobne súvisí s tvarom buniek. Táto vlastnosť pravidelne využívajú výskumníci, ktorí skúmajú chybné transplantácie s autológnymi chondrocytmi. Malý počet buniek získaných z materiálu biopsie môže byť násobený v monovrstvovej kultúre a potom znova umiestnený do trojrozmernej matrice pred transplantáciou. Re-expresia špecifického fenotypu dediferencovanými chondrocytmi prenesenými do agarózovej kultúry sa môže stimulovať pomocou TGF-p, komplexu ossein-hydroxyapatitu a kyseliny askorbovej.

V reakcii na účinok rastových faktorov a cytokínov sa chondrocyty modifikujú počas diferenciácie. Bunková odozva na cytokíny a rastové faktory sa líši medzi nediferencovanými a diferencovanými chondrocytmi. IL-1 stimuluje proliferáciu fibroblastov, zatiaľ čo rast nediferencovaných chondrocytov je inhibovaný IL-1. Syntéza DNA je stimulovaná IGF-1 v predĺžených, ale nie sploštených chondrocytoch. V diferencovaných chondrocytoch sú stimulačné účinky IL-ip a TNF-a na produkty prokolagenázy výraznejšie ako u nediferencovaných.

Kultivácia chondrocytov

Kultivácia chondrocytov v suspenzii v kvapalnom médiu alebo v prírodnej alebo syntetickej trojrozmernej matrici stabilizuje fenotyp chondrocytu. Bunky si zachovávajú svoj sférický tvar, syntetizujú tkanivovo špecifické proteíny. Vážená chondrocytová kultúra sa zvyčajne odporúča na štúdium vytvorenia novej perikulárnej matrice. Chondrocytové kultúry v syntetických alebo prírodných absorpčných polyméroch sa používajú na implantáciu buniek do defektov chrupky na stimuláciu regenerácie chrupavkového tkaniva kĺbu. Syntetické alebo prírodné prostredie pre implantovateľné bunky musí spĺňať niekoľko požiadaviek:

• Implantáty by mali mať poréznu štruktúru pre adhéziu a rast buniek,
• ani samotný polymér, ani produkty jeho degradácie by nemali spôsobovať zápal alebo toxické reakcie počas implantácie in vivo,
• nosič transplantátu by mal byť schopný viazať sa na susednú chrupavku alebo subchondrálnu kosť,
• prírodná alebo syntetická matrica musí byť schopná absorbovať, jej degradácia musí byť vyvážená regeneráciou tkaniva,
• Aby sa uľahčila reparácia chrupavky, chemická štruktúra a matricová štruktúra matrice by mala pomôcť udržať bunkový fenotyp zakódovaný chondrocytmi a syntézu tkanivovo špecifických proteínov,
• počas implantácie in vivo je potrebné skúmať mechanické vlastnosti syntetickej alebo prírodnej matrice.

[12], [13], [14], [15], [16]

Suspenzia chondrocytov v kvapalnej fáze

Prichytenie buniek na plastové nádoby, v ktorej je kultivácia chondrocytov môžu byť zabránené ich steny potiahnu roztokom metylcelulóza, agaróza, hydrogél (poly-2-hydroxyethylmethakrylát) alebo zmes kolagénu-agarózy. Za týchto podmienok sa tvoria zhluky a chondrocyty syntetizovať najmä tkanivovo špecifické agrekanu a kolagénu (II, IX, XI typy). Zvyčajne sa nájdu dva typy buniek. Nachádza sa v centre buniek zachovávajú guľovitý tvar, ktorý je obklopený rozvinutú ECM, ktorá bola potvrdená histochemickými a ultrastrukturální štúdie. Na periférii chondrocyty majú diskoidné obrysy, sú obklopené zriedkavou ECM; Nie je známe o funkčných charakteristikách takýchto buniek.

Je možné kultiváciu chondrocytov na mikronosičoch podporovaných v suspenzii; ako mikronosiče s použitím dextranové perličky (tsitodeks), kolagén potiahnuté dextranové perličky (tsitodeks III), besporovye mikroguličky sú kolagén typu I (tsellagen). Za týchto podmienok kultivácie sa chondrocyty pripájajú k povrchu mikronosiča, zachovávajú svoj sférický tvar a vytvárajú materiál podobný matrici. Okrem toho použitie kolagénu podporuje proliferáciu chondrocytov a opätovné vyjadrenie normálneho fenotypu. Preto môže byť kultivácia chondrocytov na mikrosférech kolagénu použitá na obnovenie bunkového fenotypu pred transplantáciou.

Ďalší spôsob kultivácie chondrocytov suspendované v kvapalnom médiu je vo forme ich pestovanie hustých korálky, skladajúci sa z buniek (0,5 až 1 * 10 ^b ) získané centrifugáciou. Takéto chondrocyty sú schopné produkovať matricu obsahujúcu veľké množstvo proteoglykánov, kolagénu typu II, ale nie typu I kolagénu, čo je potvrdené histologickými, imunohistochemickými a kvantitatívnymi metódami.

Suspenzia chondrocytov v prirodzenej ECM

Chondrocyty môžu byť kultivované v suspenzii v trojrozmernej matrice (mäkkom agare, agarózy, volanie gény gél alebo huba, kyselina hyaluronová, fibrínové lepidlo, alginátové perličky).

Kultivované agarózové chondrocyty si zachovajú svoj normálny fenotyp a syntetizujú kolagén typu II a tkanivovo špecifické agregáty s novými agregátmi. Ak sa kultivujú v agaróze, proteoglykány syntetizované bunkami sa uvoľňujú do média počas 50 dní. Pre porovnanie - v monovrstvovej kultúre bunková fáza je preplnená glykozaminoglykánmi už v prvých 5-6 dňoch kultivácie; keď sa kultivuje v médiu po syntéze a uvoľňuje sa glykosaminoglykány, časovo závislé zníženie glykozaminoglykánov nastáva v prvých 8 až 10 dňoch. Napriek tomu chovanie chondrocytov počas ich kultivácie v agaróze sa líši od chovania v podmienkach in vivo. V agaróze obsahuje veľké množstvo syntetizovaných Aggreganových agregátov menšie a menšie molekuly ako in vivo. TGF-P stimuluje syntézu proteoglykánov v explantáte, ale znižuje syntézu aggrekánu v agaróze.

Alginát je lineárny polysacharid odvodený od hnedých morských rias. V prítomnosti dvojmocných katiónov, ako sú ^ióny Ca2 ⁺, sa tento polymér stáva gélom. Každý chondrocytov chytený v alginátu, ktoré je obklopené matricou negatívne nabitých polysacharidov, póry, ktoré sú porovnateľné s tými, hyalínových chrupavky. Matice, ktorá je vytvorená v chondrocyty alginátových partikúl, skladajúci sa z dvoch častí - tenká vrstva buniek asociované matice zodpovedajúce pericelulárních a územnú matrice kĺbovej chrupavky a vzdialenejšie matice územiami ekvivalent v natívnom tkanive. Na 30. Deň kultivácie, relatívny a absolútny objem obsadený bunkami, a každý z dvoch oddelení v alginátové perličky, je takmer úplne identické s natívnou chrupavke. U takmer 30 dní chondrocyty zachovať ich guľový tvar a produkujú agrekan, hydrodynamické vlastnosti, ktoré sú podobné tým, ktoré agrekanu molekúl v matrici kĺbovej chrupavky a molekuly kolagénu II, IX a XI typy. V rovnakej dobe, ako iných kultúr, suspenzií, alginátové guľôčky na povrchu sploštených buniek sú prítomné, ktoré generujú malé množstvo kolagénu typu I molekuly, vypúšťané priamo do životného prostredia a nezahrnuté do videorekordéra. V alginátových perličkách sa pozoruje mierna proliferácia chondrocytov. Po 8 mesiacoch kultivácie v alginátového gélu zrelých chondrocytov nestrácajú metabolickú aktivitu a pokračuje syntetizovať špecifické tkaniva kolagén typu II a agrekan.

N. Tanaka a spoluautoři (1984) skúmali difúzne vlastnosti rôznych prirodzených molekúl v algináte a zistili, že molekuly väčšie ako 70 kD nedosahujú alginát. Takže kultivácia buniek v algináte je vhodná na štúdium regulácie biosyntézy matrice a organizácie ECM. Dostupnosť buniek kultivovaných v algináte umožňuje skúmať účinok peptidových regulačných faktorov a farmakologických činidiel na transkripčnú, posttranskripčnú a translačnú úroveň.

Chondrocyty sa tiež kultivujú v matrici typov kolagénových vlákien I a II. S. Nehrer et al (1997), v porovnaní so operácia u psov chondrocytov proteoglykánov seba kolagénom polymérnej matrici obsahujúcej kolagény rôznych typov. Zistili významné rozdiely v morfológii biosyntetickej funkcie chondrocytov kultivovaných v kolagénových matriciach obsahujúcich kolagén typu I a II. Bunky v matrici kolagénu typu II navíjali guľovitý tvar, zatiaľ čo v kolagéne typu I mali morfológiu podobné fibroblastom. Navyše, v matrici kolagénu typu II, chondrocyty produkujú viac glykozaminoglykánov. J. Van Susante a kol. (1995) porovnali vlastnosti chondrocytov kultivovaných v algináte a kolagéne (typ I). Autori zistili významný nárast počtu buniek v kolagénovom géle, ale od 6. Dňa kultivácie stratili bunky charakteristický fenotyp a premenili sa na bunky podobné fibroblastom. V alginátovom géli sa pozorovalo zníženie počtu buniek, ale chondrocyty si zachovali svoj normálny fenotyp. Množstvo kolagénu gélových proteoglykánov na bunku boli významne vyššie ako v alginátu, avšak tento pokles bol pozorovaný v syntéze gélovej matrice prvkov, ktoré začínajú od 6. Dňa kultivácie, zatiaľ čo v alginátové syntéze pokračoval rast.

Pevná trojrozmerná fibrínová matrica je prirodzenou látkou, ktorá podporuje chondrocyty vážené v nej v diferencovanom fenotype. 3D fibrínová matrica sa môže tiež použiť ako nosič na transplantáciu chondrocytov. Výhodami fibrínu sú neprítomnosť cytotoxicity, schopnosť vyplniť priestor, schopnosť lepenia. Tým, histologické a biochemické štúdie Autoren-diografii, elektrónová mikroskopia ukázala, že chondrocyty vo fibrínové gély zachovať ich morfológiu, násobenie a vyrobiť maticu aj po 2 týždňoch kultivácie. Avšak, G. Homminga et al (1993) uvádza, že po 3 dňoch kultivácie začína rozklad fibrínu postupuje Dediferenciace chondrocytov.

Suspenzia chondrocytov v umelom (syntetickom) ECM

Chrupavkové implantáty na rekonštrukčnú alebo ortopedickú chirurgiu je možné získať rastom izolovaných chondrocytov in vitro v syntetickej biologicky kompatibilnej matrici.

Kultivované chondrocyty kyseliny polyglykolovej proliferujú a udržujú normálnu morfológiu a fenotyp počas 8 týždňov. Komplex chondrocyt-polyglykolovej kyseliny pozostáva z buniek, glykozaminoglykánov, kolagénov a má vonkajšiu kolagénovú kapsulu. Avšak v takýchto implantátoch existujú dva typy molekúl kolagénu - I a II. Implantáty z dediferencovaných sérií priechodov chondrocytov majú väčší počet glykozaminoglykánov a kolagénov než implantáty z primárne nediferencovaných chondrocytov.

L. Freed a spoluautorov (1 993b) porovnávali správanie chondrocytových kultúr ľudí a býkov vo vláknitej polyglykolovej kyseline (HPHC) av kyseline polymliečnej (PPLC). Po 6-8 týždňoch kultivácie býkov chondrocytov v HSVG alebo PPLC autori pozorovali bunkovú proliferáciu a regeneráciu chrupavky. V HSBC boli chondrocyty sférické, nachádzajúce sa v medzerách obklopených chrupavkovitou matricou. Po 8 týždňoch kultivácie in vitro regenerované tkanivo obsahovalo až 50% sušiny (4% bunkovej hmotnosti, 15% glykozaminoglykánov a 31% kolagénu). V bunkách PPLK boli v tvare vretien, malé množstvo glykozaminoglykánov a kolagénu. V HSBC bol rast buniek dvakrát intenzívnejší ako v prípade PTCA. V podmienkach in vivo chondrocyty pestované v HPVC a PPLC počas 1 až 6 mesiacov produkovali tkanivo histologicky podobné chrupke. Implantáty obsahovali glykozaminoglykány, kolagény typu I a typu II.

Chondrocyty býčieho býka boli kultivované v poréznom hydrofóbnom a hydrofilnom polyetyléne s vysokou hustotou. Po 7 dňoch inkubácie v obidvoch substrátoch bunky zachovali guľovitý tvar, obsahujúci hlavne kolagén typu II. Po 21 dňoch kultivácie sa ukázalo, že hydrofilná matrica obsahuje viac kolagénu typu II ako hydrofóbna matrica.

Tkanivo chrupavky sa môže tiež získať kultiváciou v monovrstve na filtroch Millicell-CM. Predbežné pokovovanie filtrov s kolagénom je potrebné na upevnenie chondroitov. Histologické vyšetrenie kultúry demonštruje akumuláciu chondrocytov v proteoglykánoch obsahujúcich ECM a kolagéne typu II. Kolagén typu I v takejto kultúre nie je detegovaný. Chondrocyty vo výslednom chrupavkovom tkanive majú guľovitý tvar, ale na povrchu tkaniva sú trochu sploštené. Hrúbka novo vytvoreného tkaniva sa časom zvýšila a závisí od počiatočnej hustoty monovrstvy buniek. Za optimálnych podmienok kultivácie dosiahla hrúbka chrupavkového tkaniva 110 μm, organizácia buniek a kolagénu v povrchovej a hlbokej vrstve je podobná organizmu kĺbovej chrupavky. VKM obsahuje približne trikrát viac kolagénu a proteoglykánov. Po 2 týždňoch kultivácie sa zaznamenala akumulácia matrice-sa, čo umožnilo extrahovať tkanivo z filtra a použiť ho na transplantáciu.

Sims a kol. (1996) študovali kultiváciu chondrocytov v polymérnej matrici zapuzdrenej polyetylénoxidom, ktorá umožňuje veľký počet buniek transportovať injekciou. Šesť týždňov po injekcii do podkožného tkaniva atymických myší vznikla nová chrupka, ktorá bola morfologicky charakterizovaná bielou opalescenciou podobnou hyalínovej chrupke. Údaje histologických a biochemických štúdií naznačujú prítomnosť aktívne proliferujúcich chondrocytov, ktoré produkujú ECM.

Explantácii

Vyšetrenie chrupavkového tkaniva sa používa na štúdium procesov ana- a katabolizmu v ňom, homeostázy, resorpcie a opravy. Chondrocyty v explantátů chrupavky udržiava normálny fenotyp a zloženie ECM, rovnako ako tie, ktoré sa v kĺbovej chrupavky in vivo. Po 5 dňoch kultivácie v prítomnosti séra sa dosiahne konštantná úroveň syntézy a prirodzenej degradácie. Resorpcia môže urýchliť tkanivové kultúry a v hlavnej kultúre s prídavkom séra za použitia radu činidiel, napríklad, IL-IB, TNF-a, bakterialnyhlipopolisaharidov, deriváty retinovej kyseliny alebo aktívne kyslíkové radikály. Pre štúdium jeho poškodeniu opravy chrupavky je indukovaná rozpustných zápalových mediátorov (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a), alebo fyzikálne prasknutie matrice.

Metóda organotypických kultúr je modelom štúdia in vitro účinkov izolovaných vonkajších faktorov na chondrocyty a okolitú matricu. In vivo chondrocyty sa zriedkavo nachádzajú v module ECM a nekontaktujú sa navzájom. Kultúra explantovanej artikulárnej chrupavky si zachováva túto štrukturálnu organizáciu, ako aj jednotlivé interakcie medzi chondrocytami a ich okolitým extracelulárnym prostredím. Tento model sa tiež používa na štúdium účinku mechanického stresu, farmakologických činidiel, rastových faktorov, cytokínov a hormónov na metabolizmus chrupavky.

Ďalšou výhodou explantácie chrupavkového tkaniva je absencia poškodenia chondrocytov proteolytickými enzýmami alebo mechanickým faktorom, ktorý je nevyhnutný pri izolácii buniek. Receptory a iné membránové proteíny a glykoproteíny sú chránené pred škodlivými faktormi.

[17], [18], [19], [20], [21]

Kultúra chondrónov

Hondron - štrukturálne, funkčné a metabolické jednotky kĺbová chrupavka sa skladá z chondrocytov pericelulárních matrice a kompaktný vlákna kapsule a je zodpovedný za homeostázy matrice. Chondrony sa mechanicky extrahujú z chrupavky a zbierajú niekoľko postupných nízkorýchlostných homogenizácií. Izolované z oblastí rôznych hĺbok hondrony chrupavky možno rozdeliť do štyroch kategórií: jediné hondron, dvojité hondrony, násobok (tri alebo viac), lineárne usporiadané hondrony (kolóna hondronov) hondronov preťaženie.

Jednoduché chondrony sa zvyčajne nachádzajú v stredných vrstvách neporušenej chrupavky, spárované - na okraji stredných a hlbokých vrstiev, lineárne umiestnené viaceré chondróny sú typické pre hlboké vrstvy neporušenej chrupavky. Nakoniec, zhluky chondrónov pozostávajú z náhodne organizovaných skupín jednorazových a párových chondrónov, ktoré si zachovávajú agregovaný stav po homogenizácii. Akumulácie chondrónov sú veľké fragmenty chrupavky, zvyčajne obsahujúce niekoľko chondrónov a radiálne umiestnených kolagénových vlákien, tj typickú organizáciu charakteristiku hlbokých vrstiev matrice. Chondrony sú imobilizované v priehľadnej agaróze, čo umožňuje študovať ich štruktúru, molekulové zloženie a metabolickú aktivitu. Hondron systém - agarózy považovaná za mikro modelu chrupavky, ktorá sa líši od tradičného systému chondrocytov - agarózy, ktorý zachováva prírodné mikroprostredie, nie je potrebné vykonávať jeho syntézy a montáž. Kultúra chondrónov je model pre štúdium interakcií buniek a matríc v kĺbovej chrupavke v normálnych a patologických podmienkach.

[22], [23], [24], [25], [26], [27]

Kultúra nesmrteľných chondrocytov

Na vytvorenie trvalých bunkových línií sa používajú rekombinantné DNA alebo vírusy obsahujúce onkogén, ktoré môžu bunku "nesmrteľné". Nesmrteľné chondrocyty majú schopnosť nekonečnej proliferácie, udržujú stabilný fenotyp. F. Mallein-Gerin et al (1995) ukázal, že onkogén je SV40T-indukovanú proliferáciu myších chondrocytov, ktoré tak naďalej stabilnú expresiu kolagény II, IX a XI typy, rovnako ako spoločný a agrekan väzobný proteín. Takáto bunková línia však získa schopnosť syntetizovať kolagén typu I, keď sa kultivuje v monovrstvovej kultúre alebo v agarózovom géli.

W. Horton a spoluautori (1988) opísali rad imortálnych buniek s nízkou hladinou expresie mRNA kolagénu typu II. Tieto bunky boli získané ich transformáciou myšacím retrovírusom obsahujúcim I-myc- a y-ra-onkogény. Tento typ buniek je jedinečným modelom na štúdium interakcií kĺbovej matrice v neprítomnosti kolagénu typu II, ako aj regulácie syntézy kolagénu typu II.

Kultúra chondropytov s mutovanými alebo deletovanými génmi je vhodný model na štúdium ich fyziologických funkcií. Tento model je vhodný najmä pre štúdium úlohy špecifických molekúl v organizáciách matrix chrupavky alebo štúdium účinkov rôznych regulačných faktorov na metabolizmus chrupavky. Chondrocyty vzdialený génu syntetizovaný kolagén typu IX kolagénových fibríl širšie, než je normálne, čo naznačuje, že kolagén typu IX upravuje priemer vlákien. Ako je uvedené v kapitole 1, nedávno bola zistená mutácia génu COLAI kódujúceho kolagén typu II v rodinách s primárnou generalizovanou osteoartritídou. Pre štúdium vplyvu mutovaného kolagénu typu II v kĺbovej matrix R. Dharmrvaram et al (1997) sa vykonáva transfekcia ( "kontaminácia" cudzie nukleové kyseliny) defektný Kol ₂ AI (arginín v polohe 519 je nahradený cysteínom) v ľudských fetálnych chondrocytov in vitro.

Systém kokultúr. V kĺbe dochádza k interakcii chrupavky s bunkami iných typov obsiahnutých v synoviálnej membráne, synoviálnej tekutine, väzych, subchondrálnej kosti. Metabolizmus chondrocytov môže byť ovplyvnený rôznymi rozpustnými faktormi syntetizovanými týmito bunkami. Takže artritída kĺbovej chrupavky je zničená proteolytickými enzýmami a voľnými radikálmi, ktoré sú produkované synoviálnymi bunkami. Preto boli vyvinuté modely na štúdium zložitých interakcií medzi chrupavkou a okolitými tkanivami, ktoré sa nazývajú kokultura.

S. Lacombe-Gleis et al (1995) boli kultivované králik chondrocyty a osteoblasty v kokultivačního systéme (Costar), v ktorom boli bunky oddelené mikroporéznou membránou (0,4 mikrónov) umožňuje výmenu medzi dvoma typmi buniek bez akéhokoľvek priameho styku. Táto štúdia preukázala schopnosť osteoblastov stimulovať rast chondrocytov prostredníctvom rozpustných mediátorov.

AM Malfait a spoluautori (1994) skúmali vzťah medzi monocyty periférnej krvi a chondrocytov. Tento model je vhodný na štúdium procesov sprostredkovaných cytokínmi, pri zápalových artropatiách (reumatoidná artritída, séronegatívna spondylitída atď.). Autori modelu oddelili bunky membránou viažucou proteíny s pórmi s priemerom 0,4 μm. Štúdia zistila, že lipopolysacharid monocytov stimulovaných vypracovali iFNO IL-1-a, ktorý inhibuje syntézu chondrocytov agrekanu a prispel k degradácii už syntetizovaných agrekanu agregátov.

K. Tada et al (1994) vytvoril model kultivácie, v ktorej boli endotelové bunky v kolagénu (I-typ) gel uvedený do vnútornej komory z vonkajšej komory od neho oddelené chondrocytov umiestnených vo filtri s veľkosťou pórov 0,4 um. V plnej izolačného stavu z vonkajšej komory ľudskej bunkovej rúrky endoteliálny vytvorené vo kolagénového gélu v prítomnosti EGF alebo TGF-a. So súčasnou kultiváciou obidvoch typov TGF buniek bola inhibovaná závislá tvorba rúr endotelovými bunkami. Chondrocytová inhibícia tohto procesu bola čiastočne eliminovaná protilátkami proti TGF-beta. Možno predpokladať, že TGF-beta produkovaný chondrocytmi potlačuje vaskularizáciu samotnej chrupavky.

S. Groot a spoluautori (1994) súčasne kultivovali chondrocyty z hypertrofických a proliferatívnych zón kosti 16-dňovej fetálnej myši s kúskami mozgového tkaniva. Po 4 dňoch kultivácie bola pozorovaná transdiferenciacia chondrocytov na osteoblasty a začiatok tvorby osteoidov. Po 11 dňoch kultivácie bola časť chrupavky nahradená kostným tkanivom a kostná matrica bola čiastočne kalcinovaná. Niektoré neuropeptidy a neurotransmitery produkované mozgovým tkanivom ovplyvňujú metabolizmus osteoblastov alebo majú na nich receptory. Medzi nimi sa môže izolovať norepinefrín, vazoaktívny intestinálny peptid, peptid spojený s génom kalcitonínu, látkou P a somatostatínom. Kultivované chondrocytmi, kúsky mozgového tkaniva môžu produkovať niektoré z týchto faktorov, ktoré môžu indukovať proces transdiferencovania chondrocytov do osteoblastov.

[28], [29], [30], [31], [32], [33]

Vplyv vonkajších faktorov na kultúru chondrocytov

Účinok napätia kyslíka na metabolizmus chondrocytov

Vo väčšine prípadov sa chondrocytové kultúry vyvíjajú za podmienok atmosferického napätia kyslíka. Napriek tomu je dobre známe, že chondrocyty in vivo existujú za hypoxických podmienok a napätie kyslíka sa mení pri rôznych patologických podmienkach. Počas procesu dozrievania sa pozorujú významné zmeny v dodávke krvi do epifýz. Pretože sa vaskularizácia mení v rôznych oblastiach rastovej dosky, mení sa aj ich napätie v kyslíku. C. Brighton a R. Heppenstall (1971) preukázali, že v doske holennej kosti u králikov je napätie kyslíka v hypertrofickej zóne menšie ako v okolitej chrupke. Merania niektorých metabolických parametrov ukázali, že chondrocyty sú schopné rýchlo reagovať na lokálne zmeny koncentrácie kyslíka. Po prvé, s nízkym napätím kyslíka, jeho spotreba chondrocytov klesá. Pri znížení napätia kyslíka z 21 na 0,04% sa zvyšuje využitie glukózy, zvyšuje sa aktivita enzýmu glykolýzy a syntéza kyseliny mliečnej. Aj pri nízkym napätí kyslíka zostáva absolútne množstvo ATP, ADP a AMP stabilné. Tieto údaje naznačujú smerovanie metabolizmu chondrocytov s cieľom maximalizovať úsporu energie. Napriek tomu sa syntetická aktivita, a teda aj procesy reparácie, menia v podmienkach hypoxie.

Vysoké napätie kyslíka tiež ovplyvňuje metabolizmus chondrocytov, čo spôsobuje pokles syntézy proteoglykánov a DNA, degradáciu matrix chrupavky. Tieto účinky sú spravidla sprevádzané produkciou voľných kyslíkových radikálov.

Vplyv koncentrácie iónov a osmotického tlaku prostredia na funkciu chondrocytov

Koncentrácia natívneho chrupavky iónov je výrazne líši od iných tkanív: obsah sodíka v extracelulárnom médiu je 250 - 350 mmol, a jeho osmolarita - 350-450 mOsm. Pri izolácii chondrocytov z videorekordéra a inkubáciou v štandardnom médiu (DMEM (Dulbeccova minimálna esenciálne médium - Dulbeccova minimálna esenciálne médium) osmolarita - 250-280,7 mOsm) mení ostro okolitého prostredia bunky. Navyše koncentrácia vápnika a draslíka v štandardných médiách je oveľa nižšia ako v natívnom tkanive a koncentrácia aniónov je oveľa vyššia.

Pridanie sacharózového média vedie k zvýšeniu jeho osmolarity a vyvoláva prechodné zvýšenie koncentrácie intracelulárneho H ⁺ a anióny vápnika v cytosolu. Takéto vnútrobunkové zmeny môžu ovplyvňovať proces diferenciácie chondrocytov a ich metabolickú aktivitu. J. Urban et al (1993) zistili, že začlenenie ³⁵ 8-sulfátu a ³ H-prolín izolovaných chondrocyty inkubované v DMEM štandardnom médiu po dobu 2-4 hodín, bol iba 10%, ktorý v natívne tkanive. Intenzita Syntéza vyvrcholila, keď je osmolarita extracelulárnom médiu 350-400 mOsm v novo izolovaných chondrocyty a chrupkových explantátů v. Okrem toho sa objem chondrocytov zvýšil o 30 až 40% po umiestnení izolovaných buniek do štandardného DMEM média uvedenej osmolarity. Avšak, keď kultivované chondrocyty pod nefyziologickej osmolarity po dobu 12-16 hodín, bunky adaptované na nové prostredie znížením intenzity strihu je úmerná biosyntéza Osmolarita extracelulárnom médiu.

P. Borgetti et al (1995) skúmali vplyv osmolarity extracelulárneho média na rast, morfológiu a biosyntézu prasačích chondrocytov. Autori preukázali podobné biochemické a morfologické charakteristiky chondrocyty kultivované v médiu s osmolaritou mOsm 0,28 a 0,38. Pri 0,48 mOsm osmolarita médiá počas prvých 4-6 hodín kultivácie bol pozorovaný pokles v bunkovej proliferácii a syntézu proteínov, ale následne došlo k obnoveniu týchto parametrov, ktoré nakoniec dosiahla kontrolnej hodnoty. Pri kultivácii chondrocytov v médiu s 0,58 mOsm osmolarity bunky stratí svoju schopnosť podporovať fyziologický intenzity proliferačnej procesy a po 6 dňoch sa výrazne zníži počet chondrocytov. Pri osmolarite média, 0,58 mosmol, sa pozoruje hlboká inhibícia syntézy proteínov. Okrem toho, pri kultivácii v médiu s osmolaritou mOsm 0,28-0,38 chondrocyty udržať fyziologické fenotyp pri vyššej osmolaritu (mOsm 0,48-0,58) významné zmeny v bunkovej morfológii, čo sa prejavuje strata charakteristický fenotyp chondrocytov konverzie do buniek podobných fibroblastom, rovnako ako na straty buniek, schopnosť zostaviť matricové proteoglykány. Výsledky tejto štúdie naznačujú schopnosť chondrocytov reagovať na obmedzené oscilácie osmolality v extracelulárnom prostredí.

Zmena koncentrácie iných iónov môže tiež ovplyvniť procesy biosyntézy v chondrocytoch. To znamená, že miera inkorporácie ³⁵ S (síran) sa zvyšuje o polovicu s rastúcou koncentráciou draslíka iónov 5 mM (koncentrácia v štandardnom prostredí DM EM) do 10 mM (koncentrácia v ECM in vivo). Koncentrácia vápnika pod 0,5 mmol prispieva k produkcii kolagénu dospelými býčkovými chondrocytmi, zatiaľ čo koncentrácia 1-2 mmol (zodpovedajúca koncentrácii v štandardnom médiu DM DM) spôsobuje významné zníženie syntézy kolagénu. Mierne zvýšenie biosyntézy sa pozorovalo pri vysokých hladinách vápnika (2 až 10 mmol). Rôzne katióny sa podieľajú na pripojení chondrocytov k proteínom VKM. Magnézium a mangánové ióny teda poskytujú pripojenie k fibronektínu a kolagénu typu II, zatiaľ čo vápenaté ióny sa nezúčastňujú na pripojení chondrocytov k proteínom. Výsledky opísaných štúdií teda naznačujú vplyv zmien extracelulárnych iónov draslíka, sodíka, vápnika a osmolarity média na biosyntetickú funkciu chondrocytov inkubovaných v štandardných médiách.

Vplyv mechanického namáhania na metabolizmus chondrocytov

Imobilizácia kĺbu spôsobuje reverzibilnú atrofiu chrupavky, čo naznačuje potrebu mechanických stimulov pre normálny priebeh metabolických procesov v ECM. Vo väčšine prípadov existujú modely bunkových kultúr, ktoré sa používajú za normálnych atmosférických podmienok. M. Wright a spoluautori (1996) ukázali, že mechanické prostredie ovplyvňuje metabolizmus chondrocytov, odozva buniek závisí od intenzity a frekvencie kompresného zaťaženia. Pokusy s naplnením explantátov intaktnej kĺbovej chrupavky in vitro preukázali pokles syntézy proteínov a proteoglykánov pri pôsobení statického zaťaženia, zatiaľ čo dynamické zaťaženie stimuluje tieto procesy. Presné mechanizmy na vykonávanie mechanických zaťaženie účinky na komplexu chrupavky, a pravdepodobne súvisí s kmeň bunky, hydrostatického tlaku, osmotického tlaku, elektrický potenciál a receptory na povrchu buniek molekúl matrice. Na skúmanie účinku každého z týchto parametrov je potrebné vytvoriť systém, v ktorom sa jeden parameter môže nezávisle meniť. Napríklad kultúra explantátu nie je vhodná na štúdium deformácie buniek, ale môže sa použiť na štúdium celkového účinku tlaku na metabolickú aktivitu chondrocytov. Kompresia chrupavky vedie do bunky deformácii, a takisto sprevádzaná výskytom hydrostatického tlakového spádu, elektrického potenciálu a toku tekutiny zmeny fyzikálno-chemické faktory, ako je obsah vody v matrici, hustoty elektrického náboja, úroveň osmotického tlaku. Deformácia buniek sa môže študovať s použitím izolovaných chondrocytov ponorených do agarózového alebo kolagénového gélu.

Na štúdium účinku mechanickej stimulácie na kultúru chondrocytov bolo vyvinutých niekoľko systémov. Niektorí vedci používajú na tento účel systémy, v ktorých sa tlak pôsobí na bunkovú kultúru v plynnej fáze. Napríklad JP Veldhuijzen et al (1979), s použitím pretlaku 13 kPa pri nízkej frekvencii (0,3 Hz) počas 15 minút, pozorované zvýšenie syntézy cAMP a proteoglykánmi a spúšťanie syntézu DNA. R. Smith et al (1996) ukázal, že prerušovaná expozícia primárnych kultúr chondrocytov býka hydrostatického tlaku (10 MPa) pri 1 Hz po dobu 4 hodín spôsobil zvýšenie syntézy agrekanu a kolagénu typu II, zatiaľ čo konštantný tlak nemal žiadny vplyv na tieto procesy. Použitím podobného systému M. Wright et al (1996) uvádzajú, že cyklický tlak na bunkovej kultúre je spojená s hyperpolarizácii bunkovej membráne chondrocytov a aktivácia Ca ²⁺ -dependentních draslíkových kanálikov. Účinky cyklického tlaku sú teda sprostredkované iónovými kanálmi aktivovanými naťahovaním v chondrocytovej membráne. Odozva chondrocytov na hydrostatický tlak závisí od podmienok bunkovej kultúry a frekvencie aplikovaného zaťaženia. Tak, cyklický hydrostatický tlak (5 MPa) znižuje inkorporácii sulfátu do chondrocytov monovrstvy pri frekvencii 0,05, 0,25 a 0,5 Hz, zatiaľ čo pre frekvencie nad 0,5 Hz síranom začlenenie v zvyšuje explantátu chrupavky.

Bushmann M. A kol (1992) uvádza, že chondrocyty v agarózovom géle Mr. Meniť biosyntézu v reakcii na statické a dynamické mechanické zaťaženie, ako aj kultivované intaktné orgán. Autori zistili, že mechanické zaťaženie vytvára hyperosmotický stimul, po ktorom nasleduje pokles pH v chondrocytoch.

Účinok mechanického rozťahovania sa môže študovať na kultúre buniek ponorených do gélu. Napínacia sila môže byť vytvorená pomocou počítačom ovládaného vákua. Keď je systém v určitom stupni vákua, dno Petriho misky s kultúrou buniek bola predĺžená o známe množstvo, maximálna deformácia na okrajoch spodnej časti kalíška a minimálne v stredu. Stretnutie sa prenáša a kultivuje v petri miske chondrocytov. Pri použití tejto metódy, Holm-Vall K. Et al (1995) ukázal, že kultivované na kolagén (typ II), gél chondrosarkom bunky zvýšila expresiu mRNA a ₂ -integrina. ₂ p _r integrínu je schopná viazať sa na kolagén typu II. Je považovaný za mechanoreceptor, pretože interaguje s proteínmi viažucimi aktín, čím spája ECM a cytoskelet.

Účinok pH na metabolizmus chondrocytov

Hodnota pH intersticiálnej tekutiny ECM chrupavkového tkaniva je oveľa kyslejšia ako v iných tkanivách. A. Maroudas (1980) stanovil pH kĺbovej chrupavky pri 6,9. W. Diamant a spoluautori (1966) zistili v patologických podmienkach pH 5,5. Je známe, že chondrocyty žijú pri nízkych PO2, čo naznačuje dôležitú úlohu glykolýzy (95% celkového metabolizmu glukózy) v metabolizme týchto buniek; glykolýza je sprevádzaná produkciou veľkého množstva kyseliny mliečnej.

Okrem okyslenia prostredia produktmi glykolýzy sú samotné matricové komponenty veľmi dôležité. Veľký počet pevných záporného náboja na extracelulárnej proteoglykánov modifikuje iónové zloženie: existuje vysoká koncentrácia voľných katiónov (napríklad H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) a nízkej koncentrácii aniónov (napr., O2, NPHS). Navyše, pod vplyvom mechanického zaťaženia je voda vypustená z ECM, čo vedie k zvýšeniu koncentrácie fixných záporných nábojov a prilákaniu väčšieho počtu katiónov do matrice. To je spojené so znížením pH extracelulárneho média, ktoré ovplyvňuje intracelulárne pH, čím sa modifikuje metabolizmus chondrocytov. R. Wilkin a A. Hall (1995) študovali vplyv pH extracelulárneho a intracelulárneho média na biosyntézu matrice izolovanými chondrocytmi býkov. Pozorovali dvojitú modifikáciu syntézy matrice so znížením pH. Mierny pokles pH (7,4 35 S0 ₄ a ³ H-prolínu na chondrocyty, zatiaľ čo hlbšie acidifikácia (pH <7,1), inhibuje syntézu o 75% v porovnaní s ovládanie. Vytvorenie rovnakého nízkeho pH (6,65) amónnymi iónmi spôsobilo pokles syntézy matrice iba o 20%. Získané výsledky ukazujú, že modifikácia pH média na syntézu extracelulárnej matrice nemôže byť vysvetlená iba zmenami pH intracelulárneho média. Okrem toho, chondrocyty majú schopnosť regulovať intracelulárnu pH o Na ⁺, H ⁺ výmenník, Ca ⁺ -dependentní C1 ^_ -NSOZ -CONVEYORS a H ⁺ / ATPázy.

[34], [35], [36], [37], [38], [39], [40]

Vplyv zloženia média na kultiváciu na metabolizmus chondrocytov

Médium na kultiváciu chondrocytov musí zodpovedať experimentálnym podmienkam. V posledných rokoch sa teľacie sérum používa na optimalizáciu podmienok kultivácie. Pri používaní séra však treba zvážiť niekoľko dôležitých bodov:

• vonkajší rast buniek z periférie tkaniva v orgánových kultúrach,
• variabilita zloženia sér rôznych sérií,
• prítomnosť neznámych komponentov v nich,
• zvýšené riziko interferencie, artefakty v štúdii vplyvu rôznych biologických faktorov na metabolickú aktivitu buniek.

Príkladom toho je štúdia účinku EGF na chondrocyty chrupavky u potkanov. EGF stimulovanej inkorporácie ³ H-tymidínu a zvýšenie obsahu DNA v kultúre. Tento účinok bol výraznejší pri nízkych sérových koncentráciách (<1%), ale vo vysokých koncentráciách (> 7,5%) účinok zmizol.

Je dobre známe, že hladiny syntézy a degradácie v DMEM obohatené s teľacím sérom sú významne zvýšené v porovnaní s in vivo podmienkami. Rozdiely medzi metabolizmom in vivo a in vitro môžu byť spôsobené rozdielmi medzi synoviálnou tekutinou a prostredím, v ktorom sú bunky kultivované. D. Lee et al (1997) boli kultivované chondrocytov mladých býkov agarózy pomocou živného média obsahujúceho DMEM, obohatené o 20% teľacieho séra a veľké množstvo alogénne normálne synoviálnej tekutiny. Prítomnosť synoviálnej tekutiny v médiu indukovala zvýšenie počtu proteoglykánov až do 80% celkového množstva synoviálnej tekutiny. Tieto výsledky ukazujú, že synoviálna tekutina v kultúre indukuje rýchlosť metabolizmu, podobný tomu, ktorý in vivo, s vysokou úrovňou syntézy glykozaminoglykánov a nízkej úrovne bunkového delenia.

G. Verbruggen et al (1995) ukázal, že syntéza ³⁵ S-arrpeKaHa ľudských chondrocytov kultivované v agarózy v DMEM bez séra bolo 20 až 30% úrovne syntézy pozorované v DMEM, doplnenom 10% teľacieho séra. Autori určiť rozsah, v ktorom IGF-1, IGF-2, TGF-P alebo zníženie produkcie inzulínu agrekanu v médiu bez séra. Autori dospeli k záveru, že sa 100 ng / ml inzulínu, IGF-1 alebo IGF-2 čiastočne zníženej syntézy agrekanu na 39-53% úrovne kontroly. Pri kombinácii týchto faktorov neboli identifikované žiadne synergické alebo kumulatívne javy. V rovnakej dobe, 10 ng / ml TGF-P v prítomnosti 100 ng / ml inzulínu stimulovanej syntézy agrekanu až 90% alebo viac z referenčnej hodnoty. Nakoniec sérový transferín, samotný alebo v kombinácii s inzulínom, neovplyvnil syntézu agkrekánu. Keď sa teľacie sérum nahradilo hovädzím sérovým albumínom, celkový obsah aggrekánu bol výrazne znížený. Obohatenie média pre inzulínovú kultúru, IGF alebo TGF-P čiastočne obnovilo schopnosť buniek produkovať agrekanové agregáty. V tomto prípade IGF-1 a inzulín sú schopné udržať homeostázu v bunkových kultúrach. Po 40 dňoch kultivácie v médiu doplnenom 10-20 ng / ml IGF-1, proteoglykánmi syntéza bola udržiavaná na rovnakej úrovni, alebo dokonca vyššia v porovnaní s médiom obsahujúcim 20% teľacie sérum. Katabolické procesy pomaly postupoval v médiu doplnenom IGF-1, než v médiu doplnenom 0,1% roztoku albumínu, ale trochu rýchlejšie v médiu doplnenom 20% sérom. V dlhodobo žijúcich kultúrach udržuje IGF-1 stabilný stav buniek 20 ng / ml.

D. Lee et al (1993), v porovnaní účinok na zloženie kultivačného média (DMEM, DMEM + 20% teľacie sérum, DMEM + 20 ng / ml IGF-1) na syntézu DNA v kultúre explantátu chrupavky, jednovrstvovej kultúre a v suspenzii v agarózy , Keď sa kultivovali v agaróze v prítomnosti séra, autori pozorovali tendenciu zoskupovať chondrocyty do veľkých zhlukov. Bunky kultivované bez séra a s IGF1, zachovávajú kruhový tvar v agarózy, boli zhromaždené v malých skupinách, ale netvoria veľké agregáty. V monovrstve bola syntéza DNA významne vyššia v médiách obsahujúcich sérum ako v médiu obohatenom IGF-1; Syntéza DNA v poslednej z nich bola oveľa vyššia ako v neobmedzenom prostredí. Pri kultivácii chondrocytov suspendované v agarózy v nekoncentrované médium a v médiu s IGF-1, žiadny rozdiel v syntéze DNA. Súčasne sa suspenzia kultiváciu chondrocytov v agarózy v médiu doplnenom sérom, bola sprevádzaná zvýšeným začlenením radionukleotid ³ -thymidinu v porovnaní s inými prostredie.

Vitamín C je potrebný na aktiváciu enzýmov, ktoré sa podieľajú na tvorbe stabilnej špirálovej štruktúry kolagénových vlákien. Chondrocyty, nedostatočné vzhľadom na kyselinu askorbovú, syntetizujú pod-hydroxylované ne-helikálne prekurzory kolagénu, ktoré sa pomaly vylučujú. Zavedenie kyseliny askorbovej (50 μg / ml) spôsobuje hydroxyláciu kolagénu typu II a IX a ich sekréciu v normálnych množstvách. Prídavok vitamínu C neovplyvnil úroveň syntézy proteoglykánov. V dôsledku toho sa sekrécia kolagénu reguluje nezávisle od sekrécie proteoglykánov.

[41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]