Karyotypizácia

Na štúdium chromozómov sa najčastejšie používajú krátkodobé hemokultúry, bunky kostnej drene a fibroblastové kultúry. Krv s antikoagulanciom dodaná do laboratória sa centrifuguje, aby sa erytrocyty sedimentovali, a leukocyty sa inkubujú v kultivačnom médiu 2-3 dni. Do vzorky krvi sa pridáva fytohemaglutinín, pretože urýchľuje aglutináciu erytrocytov a stimuluje delenie lymfocytov. Najvhodnejšou fázou na štúdium chromozómov je metafáza mitózy, preto sa na zastavenie delenia lymfocytov v tomto štádiu používa kolchicín. Pridanie tohto lieku do kultúry vedie k zvýšeniu podielu buniek v metafáze, teda v štádiu bunkového cyklu, keď sú chromozómy najviditeľnejšie. Každý chromozóm sa replikuje (vytvára svoju vlastnú kópiu) a po vhodnom zafarbení je viditeľný ako dva chromatidy pripojené k centromére alebo centrálnemu zúženiu. Bunky sa potom ošetria hypotonickým roztokom chloridu sodného, fixujú a zafarbia.

Na farbenie chromozómov sa najčastejšie používa farbivo Romanovsky-Giemsa, 2 % acetkarmín alebo 2 % acetarseín. Tieto farbia chromozómy úplne, rovnomerne (rutinná metóda) a možno ich použiť na detekciu numerických anomálií ľudských chromozómov.

Na získanie detailného obrazu štruktúry chromozómov, identifikáciu (definíciu) jednotlivých chromozómov alebo ich segmentov sa používajú rôzne metódy diferenciálneho farbenia. Najčastejšie používané metódy sú Giemsa, ako aj G- a Q-pruhovanie. Pri skúmaní preparátu mikroskopiou pozdĺž dĺžky chromozómu sa odhalí množstvo zafarbených (heterochromatín) a nezafarbených (euchromatín) pásov. Povaha priečneho pruhovania získaného týmto spôsobom umožňuje identifikovať každý chromozóm v súbore, pretože striedanie pásov a ich veľkosti sú pre každý pár striktne individuálne a konštantné.

Metafázové platničky jednotlivých buniek sa fotografujú. Jednotlivé chromozómy sa z fotografií vystrihnú a nalepia sa v poradí na list papiera; tento obrázok chromozómov sa nazýva karyotyp.

Použitie dodatočného farbenia, ako aj nové metódy na získanie chromozómových preparátov, ktoré umožňujú natiahnutie chromozómov na dĺžku, výrazne zvyšujú presnosť cytogenetickej diagnostiky.

Na opis ľudského karyotypu bola vyvinutá špeciálna nomenklatúra. Normálny karyotyp muža a ženy sa označuje ako 46, XY a 46, XX. Pri Downovom syndróme, ktorý sa vyznačuje prítomnosťou ďalšieho chromozómu 21 (trizómia 21), sa karyotyp ženy opisuje ako 47, XX 21+ a karyotyp muža je 47, XY, 21+. V prípade štrukturálnej anomálie chromozómu je potrebné označiť zmenené dlhé alebo krátke rameno: písmeno p označuje krátke rameno, q označuje dlhé rameno a t označuje translokáciu. V prípade delécie krátkeho ramena chromozómu 5 (syndróm cri du chat) sa teda ženský karyotyp opisuje ako 46, XX, 5p-. Matka dieťaťa s translokačným Downovým syndrómom, nositeľka balancovanej translokácie 14/21, má karyotyp 45, XX, t(14q; 21q). Translokačný chromozóm vzniká fúziou dlhých ramien chromozómov 14 a 21 a krátke ramená sa strácajú.

Každé rameno je rozdelené na oblasti, ktoré sú zase rozdelené na segmenty, pričom oba sú označené arabskými číslicami. Centroméra chromozómu je východiskovým bodom pre počítanie oblastí a segmentov.

Pre topografiu chromozómov sa teda používajú štyri označenia: číslo chromozómu, symbol ramena, číslo oblasti a číslo segmentu v oblasti. Napríklad položka 6p21.3 znamená, že hovoríme o chromozóme 6 6. páru, jeho krátkom ramene, oblasti 21, segmente 3. Existujú aj ďalšie symboly, najmä pter - koniec krátkeho ramena, qter - koniec dlhého ramena.

Cytogenetická metóda výskumu umožňuje detekciu delécií a iných zmien v chromozómoch s veľkosťou iba približne 1 milión báz (nukleotidov).

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]