Laboratórna diagnostika tuberkulózy

Tuberkulóza je ochorenie, ktoré sa v moderných podmienkach a vďaka vedeckým úspechom ľahko diagnostikuje. Laboratórna diagnostika tuberkulózy zaujíma medzi ostatnými diagnostickými metódami ústredné miesto, hneď po röntgenových vyšetrovacích metódach.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Klinický krvný test

U pacientov s tuberkulózou nie sú zmeny v celkovom krvnom teste patognomonické. Pri obmedzených a nízko aktívnych formách tuberkulózy je charakteristická hypochrómia erytrocytov s normálnym počtom. Pri masívnych infiltrátoch alebo kazeóznej pneumónii, s rozsiahlou kazeóznou lymfadenitídou, špecifickým poškodením čriev, ako aj pri rozsiahlych pľúcnych alebo pooperačných krvácaniach, erytropénii a mikrocytóze sa pozoruje oligochromázia, polychromázia. Makrocytóza, a najmä poikilocytóza, sa vyskytuje oveľa menej často, zvyčajne pri ťažkej anémii. Počet retikulocytov v kompenzovanom štádiu tuberkulózy sa pohybuje od 0,1 do 0,6 %, v subkompenzovanom štádiu od 0,6 do 1,0 % a pre dekompenzované štádium je charakteristických 1 % retikulocytov.

V niektorých prípadoch tuberkulózy sa môže pozorovať mierna leukocytóza (až 15 tisíc leukocytov), menej často leukopénia, ktorá sa vyskytuje v 2 – 7 % prípadov u pacientov s obmedzenými a miernymi formami procesu a v 12,5 % pri deštruktívnej a progresívnej pľúcnej tuberkulóze.

Najčastejšie sa vyskytujú posuny vo vzorci leukocytov. Zaznamenáva sa relatívna aj absolútna neutrofília, mierny posun vo vzorci leukocytov doľava k promyelocytom. Myelocyty sa veľmi zriedkavo vyskytujú v prípadoch nekomplikovanej tuberkulózy. Zvýšenie počtu neutrofilov s patologickou granularitou v hemograme pacienta s tuberkulózou vždy naznačuje trvanie procesu: u pacientov s ťažkou tuberkulózou takmer všetky neutrofily obsahujú patologickú granularitu. Po ústupe ohniska tuberkulózy sa jadrový posun relatívne rýchlo vráti do normálu. Patologická granularita neutrofilov zvyčajne pretrváva dlhšie ako iné zmeny v hemograme.

Obsah eozinofilov v periférnej krvi tiež kolíše v závislosti od fázy procesu a alergického stavu organizmu. Ich počet klesá na aneozinofíliu pri závažných a dlhotrvajúcich prepuknutiach ochorenia a naopak sa zvyšuje počas resorpcie infiltrátov a pleurálneho výpotku, ako aj pri skorých formách primárnej tuberkulózy.

Väčšinu foriem primárnej tuberkulózy sprevádza lymfopénia, ktorá sa niekedy pozoruje aj niekoľko rokov aj po zjazvení špecifických zmien. Sekundárna tuberkulóza v akútnej fáze môže byť v závislosti od závažnosti procesu sprevádzaná buď normálnym počtom lymfocytov, alebo lymfopéniou.

Medzi testami na posúdenie tuberkulózneho procesu zaujíma osobitné miesto stanovenie rýchlosti sedimentácie erytrocytov (ESR), ktorá je dôležitá pri hodnotení priebehu tuberkulózneho procesu a identifikácii jeho aktívnych foriem. Zvýšenie ESR naznačuje prítomnosť patologického procesu (infekčno-zápalového, hnisavého, septického, hemoblastózy, lymfogranulomatózy atď.) a slúži ako indikátor jeho závažnosti, ale normálne hodnoty ESR nie vždy naznačujú absenciu patológie. Zrýchlenie sedimentácie erytrocytov je uľahčené zvýšením obsahu globulínov, fibrinogénu, cholesterolu v krvi a znížením viskozity krvi. Spomalenie sedimentácie erytrocytov je charakteristické pre stavy sprevádzané hemokoncentráciou, zvýšením obsahu albumínov a žlčových kyselín.

Hemogram pacientov s tuberkulózou sa počas liečby mení. Čím úspešnejší je terapeutický zásah, tým rýchlejšie hematologické zmeny vymiznú. Zároveň treba mať na pamäti vplyv rôznych antibakteriálnych liekov na hematopoézu. Často spôsobujú eozinofíliu, v niektorých prípadoch leukocytózu a častejšie leukopéniu až po agranulocytózu a lymfoidno-retikulárnu reakciu. Systematické hematologické monitorovanie a správna analýza získaných údajov sú nevyhnutné pre posúdenie klinického stavu pacienta, dynamiky procesu a účinnosti liečby.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Klinická analýza moču

V prípade tuberkulózy močových ciest je hlavnou laboratórnou diagnostickou metódou analýza moču. Môže sa pozorovať leukocytúria, erytrocytúria, proteinúria, hypoizostenúria, tuberkulózna mykobakteriúria, nešpecifická bakteriúria.

Leukocytúria je najčastejším príznakom tuberkulózy močových ciest pred špecifickou chemoterapiou a chýba len vo výnimočných prípadoch, napríklad pri úplnej obliterácii lúmenu močovodu. Nechiporenkov test (stanovenie počtu leukocytov v 1 ml moču) pomáha objektívnejšie posúdiť stupeň leukocytúrie pri nefrotuberkulóze a v niektorých prípadoch ju odhaliť aj pri normálnom celkovom rozbore moču. Treba však vziať do úvahy, že leukocytúria sa môže vyskytnúť pri akútnej a chronickej pyelonefritíde, cystitíde, uretritíde, obličkových kameňoch a močovodoch.

Erytrocytúria, podobne ako leukocytúria, sa považuje za jeden z najbežnejších laboratórnych príznakov urogenitálnej tuberkulózy. Frekvencia hematúrie závisí od prevalencie procesu; zvyšuje sa s rozvojom deštruktívneho tuberkulózneho procesu v obličkách. Erytrocytúria bez leukocytúrie je typickejšia pre skoré štádiá renálnej tuberkulózy. Hematúria, ktorá prevažuje nad leukocytúriou, je dôležitým argumentom v prospech renálnej tuberkulózy pri jej odlíšení od nešpecifickej pyelonefritídy.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Biochemický krvný test

Pri tuberkulóze závisia zmeny niektorých biochemických ukazovateľov predovšetkým od fázy procesu, komplikácií a rôznych sprievodných ochorení. U pacientov s inaktívnou tuberkulózou pľúc a iných orgánov sa celkový proteín a proteínové frakcie krvného séra nemenia a určujú ich normálny obsah.

Pri akútnych formách ochorenia, ako aj pri exacerbácii a progresii chronických foriem tuberkulózy, sa albumín-globulínový koeficient znižuje.

Pri posudzovaní funkčného stavu a organického poškodenia pečene pri tuberkulóze a jej komplikáciách má zásadný význam stanovenie priameho a celkového bilirubínu, aspartátaminotransferázy (AST), alanínaminotransferázy (ALT) v krvnom sére. Dynamické stanovenie hladiny aminotransferáz. Bilirubín pri liečbe pacientov s tuberkulózou, najmä v jej závažných formách, je povinnou súčasťou biochemického vyšetrenia pacientov s tuberkulózou a vykonáva sa mesačne.

Vyhodnotenie funkčného stavu obličiek zahŕňa stanovenie sérového kreatinínu a výpočet rýchlosti glomerulárnej filtrácie pomocou Cockcroftovho-Gaultovho vzorca. Výpočet rýchlosti glomerulárnej filtrácie pomocou Rebergovho testu poskytuje menej presné výsledky.

Hlavným cieľom dynamických biochemických štúdií pacientov s tuberkulózou je sledovanie priebehu procesu, včasné odhalenie vedľajších účinkov liekov a adekvátna korekcia vznikajúcich porúch homeostázy.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Aplikácia biochemických výskumných metód pri extrapulmonálnej tuberkulóze

Za najinformatívnejší ukazovateľ sa považuje obsah kyseliny tuberkulostearovej v biologických tekutinách, jeho stanovenie je však spojené s technickými ťažkosťami (potreba použiť plynovú chromatografiu a hmotnostnú spektrometriu).

Sľubné je meranie aktivity adenozíndeaminázy - enzýmu stanoveného v tekutinách: synoviálnej, perikardiálnej, ascitickej alebo cerebrospinálnej. Hlavnými producentmi adenozíndeaminázy sú lymfocyty a monocyty. Stanovenie aktivity adenozíndeaminázy v biologických tekutinách uľahčuje diagnostiku tuberkulóznej synovitídy, tuberkulózy lymfatických uzlín, tuberkulóznej meningitídy, tuberkulóznej serozitídy.

Niektoré biochemické ukazovatele sa kvôli svojej nešpecifickosti stanovujú iba v biologických tekutinách v blízkosti lézie. Hladina ukazovateľov sa meria v reakcii na subkutánne alebo intradermálne podanie tuberkulínu (zvyčajne pred podaním a 48 a 72 hodín po ňom). Následne sa vypočíta stupeň zvýšenia hladiny markera (v %) vo vzťahu k počiatočnej hladine.

Optimálne sa aktivita orgánovo-špecifického enzýmu transamidinázy stanovuje v moči; jej výskyt sa zaznamenáva pri poškodení obličiek rôzneho pôvodu. Štúdium transamidinázy je opodstatnené iba v podmienkach subkutánneho podávania tuberkulínu s cieľom zhoršiť lokálny zápalový proces. Aktivita transamidinázy sa stanovuje v moči spočiatku a 24-72 hodín po podaní 50 TE tuberkulínu. Zvýšenie fermentúrie 2-krát alebo viac umožňuje v 82 % prípadov odlíšiť aktívnu tuberkulózu obličiek od exacerbácie chronickej pyelonefritídy.

V prípade tuberkulózy ženských pohlavných orgánov sa koncentrácie haptoglobínu a malondialdehydu v krvi stanovujú za podmienok provokačného tuberkulínového testu. Tuberkulín sa podáva subkutánne v dávke 50 TE a po 72 hodinách sa vykoná opakované biochemické vyšetrenie. V prípade tuberkulóznej etiológie je stupeň zvýšenia hladiny haptoglobínu najmenej 28 % a hladina malondialdehydu je 39 % alebo viac. Používa sa aj stanovenie aktivity adenozíndeaminázy v peritoneálnej tekutine získanej z Douglasovho vaku. Punkcia sa opäť vyšetrí 72 hodín po intradermálnom podaní tuberkulínu v dávkach 0,1 TE a 0,01 TE v oblasti projekcie vnútorných pohlavných orgánov na prednú brušnú stenu. Zvýšenie aktivity adenozíndeaminázy o 10 % alebo viac v porovnaní s počiatočnou hodnotou naznačuje tuberkulózny proces.

V prípade poškodenia oka sa skúma fokálna reakcia, ktorá sa v oku vyskytuje ako reakcia na stimuláciu antigénom. V tomto prípade je nežiaduci vývoj prudko vyjadrenej reakcie sprevádzanej znížením zrakových funkcií. Keďže hodnotenie minimálnych fokálnych reakcií je často náročné, odporúča sa paralelne zamerať na stupeň zvýšenia haptoglobínu alebo adenozíndeaminázy v krvnom sére, aby sa objektivizoval záver.

Všetky biochemické štúdie by sa mali vykonávať v kombinácii s inými metódami.

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

Štúdium systému zrážania krvi

Relevantnosť štúdia stavu systému zrážania krvi vo ftizeológii je spôsobená prítomnosťou hemoptýzy alebo pľúcneho krvácania u mnohých pacientov s tuberkulózou pľúc, ako aj hemokoagulačnými komplikáciami pri chirurgickej liečbe tuberkulózy. Okrem toho prirodzene sprievodná latentná intravaskulárna hemokoagulácia ovplyvňuje priebeh ochorenia a účinnosť chemoterapie.

U pacientov s pľúcnou tuberkulózou s prevažujúcou exsudatívnou zložkou zápalu sa pozoruje zníženie antikoagulačnej aktivity krvi. U pacientov s nízkou prevalenciou špecifického poškodenia pľúc s prevažujúcou produktívnou zložkou zápalu je intravaskulárna hemokoagulácia nevýznamná. U pacientov s pľúcnou tuberkulózou s hemoptýzou a pľúcnym krvácaním je stav systému zrážania krvi odlišný: u pacientov s malou stratou krvi na vrchole hemoptoey alebo bezprostredne po jej ukončení sa pozoruje prudký nárast koagulačnej kapacity krvi v dôsledku výrazného zintenzívnenia procesov tvorby trombínu pri zachovaní zvýšenej „štrukturálnej“ zrážateľnosti. U pacientov s masívnou stratou krvi sa pozoruje zníženie koagulačného potenciálu v dôsledku zníženia koncentrácie fibrinogénu, aktivity faktora XIII a počtu krvných doštičiek. V štádiu chirurgickej liečby u pacientov s obmedzenými formami pľúcnej tuberkulózy nedochádza k významným poruchám homeostázového systému. U pacientov s rozsiahlymi procesmi sa pri pneumonektómii alebo pleuropneumonektómii často vyvíja DIC syndróm, ktorý môže mať formu „druhého ochorenia“.

Na monitorovanie stavu systému zrážania krvi u pacientov s pľúcnou tuberkulózou je potrebné stanoviť aktivovaný parciálny tromboplastínový čas (APTT), fibrinogén, trombínový čas, protrombínový index, ako aj čas krvácania a čas zrážania krvi.

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

Hormonálne štúdie

Moderné experimentálne a klinické pozorovania naznačujú prítomnosť zmien hormonálneho stavu pri špecifickom tuberkulóznom zápale pľúc. Bolo dokázané, že korekcia dysfunkcie hypofyzárno-nadobličkového, hypofyzárno-štítneho systému a funkcie pankreasu v kombinácii s antituberkulóznou liečbou prispieva k aktivácii fibrogenézy a reparačných procesov v ohnisku špecifického zápalu.

Funkčný stav systému hypofýza-štítna žľaza sa posudzuje podľa obsahu trijódtyronínu (T3), tyroxínu (T4) a tyreostimulačného hormónu hypofýzy (TSH) v krvnom sére _. Zistilo _sa, že subklinická hypotyreóza sa zisťuje u 38 – 45 % pacientov s pľúcnou tuberkulózou a najčastejšie sa diagnostikuje pri diseminovaných a fibro-kavernóznych formách procesu. Pri týchto formách sú hladiny T3 aj T4 najvýraznejšie znížené _a dochádza k _nerovnováhe týchto hormónov vo forme zvýšenia _{pomeru T4/} T3.

Funkcia kôry nadobličiek sa hodnotí hladinou kortizolu v sére a endokrinná funkcia pankreasu sa hodnotí koncentráciou imunoreaktívneho inzulínu. V akútnej fáze infekčného ochorenia sa zvyšuje potreba endogénneho kortizolu a inzulínu. Hyperinzulinémia tiež naznačuje inzulínovú rezistenciu telesných tkanív, ktorá je typická pre akýkoľvek aktívny zápalový proces, najmä špecifický. Stanovenie glukokortikoidnej funkcie nadobličiek pri aktívnej pľúcnej tuberkulóze nám umožňuje zistiť prítomnosť hyperkorticizmu u väčšiny pacientov. Normálne koncentrácie kortizolu v krvi u pacienta s infekčným zápalom v akútnom období by sa mali považovať za relatívnu nedostatočnosť glukokortikoidnej funkcie kôry nadobličiek, čo môže slúžiť ako základ pre substitučnú liečbu adekvátnymi dávkami glukokortikoidov.

Takmer tretina pacientov s pľúcnou tuberkulózou má nízku hladinu inzulinémie blížiacu sa k dolnej hranici normy, zatiaľ čo 13 – 20 % má významný hyperinzulinizmus. Relatívny hypo- aj hyperinzulinizmus sú vysoko rizikovými faktormi pre rozvoj porúch metabolizmu sacharidov rôzneho stupňa závažnosti. Tieto zmeny funkčnej aktivity pankreatických B-buniek vyžadujú pravidelné monitorovanie glykémie u pacientov s tuberkulózou a včasnú prevenciu diabetes mellitus. Okrem toho to slúži ako ďalšie odôvodnenie vhodnosti použitia fyziologických dávok inzulínu v komplexnej liečbe tuberkulózy.

Vo všeobecnosti je zníženie hladín hormónov štítnej žľazy, ich nerovnováha, hyperkortizolémia a hyperinzulinizmus najvýraznejšie u pacientov s ťažkým priebehom tuberkulózneho procesu, s rozsiahlymi pľúcnymi léziami a výraznými príznakmi tuberkulóznej intoxikácie.

Mikrobiologická diagnostika tuberkulózy

Mikrobiologické štúdie sú potrebné na identifikáciu pacientov s tuberkulózou, overenie diagnózy, monitorovanie a korekciu chemoterapie, hodnotenie výsledkov liečby, inými slovami, od okamihu registrácie pacienta s tuberkulózou až po jeho vyradenie z registra.

Všetky epidemiologické programy a projekty sú založené na hodnotení počtu vylučovačov baktérií, čo nie je možné bez použitia laboratórnych metód na detekciu mykobaktérií tuberkulózy. Pri skúmaní príťažlivosti tzv. neorganizovanej populácie dosahuje percento vylučovačov baktérií 70 alebo viac, čo robí z laboratórnych metód pomerne účinný prostriedok na identifikáciu pacientov s tuberkulózou v tejto populačnej skupine.

Tradičné mikrobiologické metódy diagnostiky tuberkulózy sú bakterioskopické a kultivačné štúdie. Moderné metódy zahŕňajú kultiváciu mykobaktérií tuberkulózy v automatizovaných systémoch a PCR. Všetky tieto metódy sa však nevyhnutne kombinujú s klasickými bakteriologickými metódami.

Zber diagnostického materiálu

Účinnosť laboratórnych testov do značnej miery závisí od kvality diagnostického materiálu. Dodržiavanie pravidiel pre zber, skladovanie a prepravu diagnostického materiálu a presné vykonávanie algoritmu vyšetrenia pacienta priamo ovplyvňuje výsledok a zaisťuje biologickú bezpečnosť.

Na testovanie tuberkulózy sa používa množstvo materiálov. Keďže pľúcna tuberkulóza je najčastejšou formou tuberkulóznej infekcie, za hlavný materiál na testovanie sa považuje spútum a iné typy výluhov z tracheobronchiálneho stromu: výluhy z horných dýchacích ciest získané po inhalácii aerosólu: bronchiálne lavážne vody; bronchoalveolárne laváže; materiál získaný počas bronchoskopie, transtracheálnej a intrapulmonálnej biopsie: bronchiálny aspirát, stery z hrtana, exsudáty, stery z rán atď.

Účinnosť výskumu sa zvyšuje, ak sa vykonáva kontrolovaný odber materiálu od pacienta. Na tento účel sa prideľuje špeciálne vybavená miestnosť alebo sa zakúpia špeciálne kabínky. Odber materiálu je nebezpečný postup, preto sa materiál na výskum musí zbierať v súlade s pravidlami bezpečnosti infekcií.

Materiál na testovanie na Mycobacterium tuberculosis sa zhromažďuje v sterilných fľaštičkách s pevne zaskrutkovanými uzávermi, aby sa zabránilo kontaminácii prostredia a aby sa odobratý materiál chránil pred kontamináciou.

Fľaštičky na odber diagnostického materiálu musia spĺňať nasledujúce požiadavky:

• musia byť vyrobené z nárazuvzdorného materiálu;
• by sa mal pri autoklávovaní ľahko roztaviť;
• mať dostatočný objem (40 – 50 ml):
• mať široký otvor na zber spúta (priemer nie menší ako 30 mm);
• byť ľahko manipulovateľný, priehľadný alebo priesvitný, aby sa množstvo a kvalita odobratej vzorky dali posúdiť bez otvorenia veka.

Pre dosiahnutie optimálnych výsledkov výskumu musia byť splnené nasledujúce podmienky:

• odber materiálu by sa mal vykonať pred začiatkom chemoterapie;
• materiál na štúdiu sa musí zozbierať pred jedlom alebo užitím liekov ráno;
• Pre túto štúdiu sa odporúča odobrať aspoň 3 ranné vzorky spúta. Spúto sa odoberá 3 po sebe nasledujúce dni;
• Zozbieraný materiál musí byť doručený do laboratória čo najrýchlejšie:
• v prípadoch, keď nie je možné materiál doručiť do laboratória okamžite, uchováva sa v chladničke pri teplote vzduchu 4 °C maximálne 48 hodín;
• Pri preprave materiálu je potrebné venovať osobitnú pozornosť neporušenosti fliaš.

Správne odobraté spúto má hlienovitý alebo mukopurulentný charakter. Optimálny objem vyšetrovanej porcie spúta je 3-5 ml.

Spútum sa odoberá pod dohľadom zdravotníckeho pracovníka. Osoby zodpovedné za odber spúta musia zabezpečiť dodržiavanie určitých pravidiel:

• Je potrebné pacientovi vysvetliť účel vyšetrenia a potrebu vykašliavať nie sliny alebo nosohltanový hlien, ale obsah hlbokých častí dýchacích ciest. To sa dá dosiahnuť produktívnym kašľom, ktorý sa objaví po niekoľkých (2-3) hlbokých nádychoch. Je tiež potrebné pacienta upozorniť, že si musí najprv vypláchnuť ústa prevarenou vodou, aby sa odstránila hlavná časť mikroflóry vegetujúcej v ústnej dutine a zvyšky jedla, ktoré komplikujú vyšetrenie spúta;
• Zdravotnícky pracovník zapojený do zberu spúta musí okrem plášťa a čiapky nosiť aj masku, gumené rukavice a gumenú zásteru;
• Keď pacient stojí za ním, odporúča sa mu držať fľašu čo najbližšie k perám a pri vykašliavaní spúta do nej okamžite vstreknúť, pričom je potrebné zabezpečiť, aby prúd vzduchu smeroval od zdravotníckeho pracovníka:
• Po dokončení odberu spúta by mal zdravotnícky pracovník fľašu starostlivo uzavrieť viečkom a posúdiť množstvo a kvalitu odobratého spúta. Fľaša sa potom označí a umiestni do špeciálnej krabice na prepravu do laboratória.

Ak pacient neprodukuje spúta, potom by sa mu mal večer pred odberom a skoro ráno v deň odberu materiálu podať expektorans: extrakt z koreňov ibišteka lekárskeho (mukaltín), bromhexín, ambroxol atď. - alebo by sa mala použiť dráždivá inhalácia s použitím zariadenia inštalovaného v miestnosti na odber spúta. Takto odobratý materiál nepodlieha konzervácii a mal by sa vyšetriť v deň odberu. Aby sa predišlo jeho „odmietnutiu“ v laboratóriu, mala by sa v odporúčaní urobiť osobitná poznámka.

Ak sa v danej inštitúcii nevykonávajú mikrobiologické štúdie, odobratý diagnostický materiál sa musí do laboratória doručiť centrálne za predpokladu, že materiál sa medzi dodávkami uchováva v chladničke alebo s konzervačnými látkami. Materiál sa do laboratória dodáva v prepravných škatuliach, ktoré sa dajú ľahko dezinfikovať. Každá vzorka musí byť opatrená príslušným štítkom a celá šarža musí mať vyplnený sprievodný formulár.

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

Spôsoby a frekvencia vyšetrenia pacientov

Počas úvodného, tzv. diagnostického vyšetrenia pacienta na tuberkulózu je potrebné vyšetriť aspoň 3 porcie spúta odobratého pod dohľadom zdravotníckeho personálu počas 2 alebo 3 dní, čo zvyšuje účinnosť mikroskopie.

Primárny skríning tuberkulózy by mali vykonávať všetky lekárske a diagnostické zariadenia systému zdravotnej starostlivosti. V poslednom čase sa s cieľom zvýšiť účinnosť primárneho vyšetrenia na základe klinických diagnostických laboratórií organizujú tzv. mikroskopické centrá, ktoré sú vybavené modernými mikroskopmi a zariadeniami na zaistenie epidemickej bezpečnosti.

Protituberkulózne inštitúcie používajú schému prieskumu, ktorá zahŕňa najmenej 3-násobné vyšetrenie spúta alebo iného diagnostického materiálu do 3 dní. Počas liečby sa mikrobiologické vyšetrenia vykonávajú pravidelne najmenej raz mesačne v intenzívnej fáze chemoterapie. Pri prechode do následnej fázy sa vyšetrenia vykonávajú menej často - v intervaloch 2-3 mesiacov, pričom frekvencia vyšetrení sa znižuje na dve.

Funkcie zberu diagnostického materiálu pre extrapulmonálnu tuberkulózu

Charakteristickým znakom patologického materiálu pri extrapulmonálnych formách tuberkulózy je nízka koncentrácia mykobaktérií tuberkulózy v ňom, čo si vyžaduje citlivejšie metódy mikrobiologického výskumu, predovšetkým metódy siatia na živné médium.

V prípade urogenitálnej tuberkulózy je moč najdostupnejším materiálom na vyšetrenie. Zber moču by mala vykonávať špeciálne vyškolená zdravotná sestra.

Vonkajšie genitálie sa umyjú vodou a mydlom alebo slabým roztokom manganistanu draselného. Vonkajší otvor močovej trubice sa starostlivo ošetrí. Stredná časť ranného moču sa zhromažďuje do sterilnej fľaše: u mužov - prirodzene, u žien - pomocou katétra. Moč z obličkovej panvičky sa zhromažďuje do sterilných skúmaviek počas katetrizácie jednej alebo dvoch obličiek, v druhom prípade - nevyhnutne oddelene z každej obličky. Malé množstvo tohto moču sa centrifuguje a sediment sa vyšetrí.

U mužov sa spermie, vzorky zo semenníkov a sekréty prostaty centrifugujú, aby sa získal sediment. Pri akejkoľvek lokalizácii špecifického procesu v genitálnej oblasti u mužov môže masáž prostaty podporiť uvoľňovanie sekrétov obsahujúcich mykobaktérie tuberkulózy.

Menštruačná krv sa u žien odoberá odsávaním alebo pomocou Kafkovho uzáveru. Výsledný materiál sa zbaví erytrocytov premytím destilovanou vodou a následným odstredením. Sediment sa vyšetrí.

Výtok z krčka maternice sa zhromažďuje v nejakej nádobe alebo Kafkovom uzávere, to znamená, že je žiaduce zhromaždiť 1-2 ml patologického materiálu.

Materiál získaný počas chirurgických zákrokov na obličkách, genitáliách, biopsií, endometriálnych sterov sa homogenizuje. Na tento účel sa umiestni do sterilnej mažiare a dôkladne sa rozdrví sterilnými nožnicami. Do výslednej suspenzie sa pridá sterilný riečny piesok v množstve rovnajúcom sa jej hmotnosti, potom sa pridá 0,5-1,0 ml izotonického roztoku chloridu sodného a všetko sa rozomelie, kým sa po pridaní izotonického roztoku chloridu sodného (4-5 ml) nevytvorí kašovitá hmota. Potom sa hmota nechá usadiť 1-1,5 minúty a supernatant sa vyšetrí.

Tuberkulóza kostí a kĺbov. Vstreknutý hnis (z abscesov) získaný sterilnou injekčnou striekačkou sa umiestni do sterilnej nádoby a ihneď sa doručí do laboratória. Sterilnou pipetou, predtým navlhčenou sterilným izotonickým roztokom chloridu sodného, sa odoberie 2 – 5 ml hnisu, prenesie sa do fľaštičky s guľôčkami a pridajú sa ďalšie 2 – 3 ml izotonického roztoku chloridu sodného. Fľaštička sa uzavrie zátkou a pretrepáva sa v trepačke 8 – 10 minút. Homogenizovaná suspenzia sa skúma.

Pri fistulóznych formách osteoartikulárnej tuberkulózy sa hnis odoberá z fistuly. Hojný výtok sa zhromažďuje priamo do skúmavky. V prípade slabého hnisavého výtoku sa fistulový trakt premyje sterilným izotonickým roztokom chloridu sodného a výplach zozbieraný do skúmavky alebo kúsok tampónu nasiaknutý hnisom sa odošle na vyšetrenie.

Chirurgický materiál získaný počas chirurgických zákrokov na kostiach a kĺboch môže pozostávať z hnisavo-nekrotických hmôt, granulácií, jazvového tkaniva, kostného tkaniva, tkaniva synoviálnej membrány a iných substrátov. Jeho spracovanie sa vykonáva rovnako ako v prípade renálnej tuberkulózy.

Mikrobiologické vyšetrenie synoviálnej tekutiny v 3 % roztoku citrátu sodného (v pomere 1:1) na zabránenie zrážania sa vykonáva ihneď po punkcii.

Tuberkulóza lymfatických uzlín. Hnis extrahovaný pri punkcii lymfatických uzlín sa vyšetruje rovnakým spôsobom ako hnis z abscesov. Tkanivo lymfatických uzlín získané počas chirurgických zákrokov a biopsií sa vyšetruje rovnako ako pri iných formách tuberkulózy.

Štúdia výkalov na Mycobacterium tuberculosis sa vykonáva extrémne zriedkavo kvôli takmer úplnej absencii pozitívnych výsledkov.

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

Mikroskopia mykobaktérií

Mikroskopia spúta je relatívne rýchla, jednoduchá a lacná metóda, ktorá by sa mala použiť vo všetkých prípadoch podozrenia na tuberkulózu. Okrem toho sa táto štúdia vykonáva na posúdenie účinnosti chemoterapie a na potvrdenie zotavenia alebo zlyhania liečby v prípade absencie výsledkov kultivácie.

Používajú sa dve metódy mikroskopického vyšetrenia:

• metóda priamej mikroskopie, keď sa náter pripraví priamo z diagnostického materiálu;
• metóda mikroskopie sedimentu pripraveného z materiálu ošetreného dekontaminantmi na kultúrny výskum.

Prvá metóda sa používa v laboratóriách, kde sa vykonávajú iba mikroskopické štúdie (klinické diagnostické laboratóriá všeobecnej lekárskej siete).

Najlepšie výsledky mikroskopického vyšetrenia sa dosiahnu koncentrovaním diagnostického materiálu (napríklad centrifugáciou).

Aby sa s 50 % pravdepodobnosťou mikroskopicky zistila Mycobacterium tuberculosis, musí 1 ml spúta obsahovať viac ako 5 000 mikrobiálnych buniek. Spúto pacientov s pľúcnymi formami tuberkulózy zvyčajne obsahuje značný počet acidorezistentných baktérií, čo umožňuje ich spoľahlivú detekciu bakterioskopiou. Diagnostickú citlivosť tejto metódy možno zvýšiť vyšetrením viacerých vzoriek spúta od jedného pacienta. Negatívny výsledok bakterioskopického vyšetrenia nevylučuje diagnózu tuberkulózy, pretože spúto niektorých pacientov obsahuje menej Mycobacterium, ako je možné zistiť mikroskopiou. Príčinou negatívneho výsledku bakterioskopického vyšetrenia môže byť aj zlá príprava náterov spúta.

Najbežnejšou metódou na detekciu acidorezistentných mykobaktérií v nátere je farbenie Ziehl-Neelsen. Metóda je založená na prenikaní karbolfuchsínu do mikrobiálnej bunky cez membránu, ktorá obsahuje voskovo-lipidovú vrstvu, za súčasného účinku zahrievania a silného leptania fenolu. Následné odfarbenie náteru 25 % roztokom kyseliny sírovej alebo 3 % chlorovodíkovým alkoholom vedie k odfarbeniu všetkých štruktúr, ktoré nie sú acidorezistentné. Odfarbené prvky náteru sa farbia 0,3 % roztokom metylénovej modrej. Mykobaktérie nevnímajú bežné anilínové farbivá, v dôsledku čoho sa acidorezistentné mykobaktérie farbia na malinovočerveno a ostatné mikróby a bunkové prvky sa farbia na modro.

Na vyšetrenie náterov zafarbených podľa Ziehl-Neelsena sa používa svetelný binokulárny mikroskop s imerzným objektívom (90- alebo 100-násobné zväčšenie) a okulárom so 7- alebo 10-násobným zväčšením. Vyšetruje sa 100 zorných polí, čo je dostatočné na detekciu jednotlivých mykobaktérií v nátere. Ak je výsledok takéhoto vyšetrenia negatívny, odporúča sa na potvrdenie vyšetriť ďalších 200 zorných polí. Výsledky sa zaznamenajú s uvedením počtu detegovaných acidorezistentných mykobaktérií (AFB).

Okrem tejto metódy sa pri luminiscenčnej mikroskopii používa fluorochrómové farbenie, ktoré umožňuje dosiahnuť najlepšie výsledky. Použitie tejto metódy zvyšuje účinnosť mikroskopie o 10 – 15 %. Keď sú mykobaktérie ošetrené luminiscenčnými farbivami (auramín, rodamín atď.), tieto látky sa tiež viažu na voskovité štruktúry mikrobiálnej bunky. Keď sú zafarbené bunky ožiarené excitačným zdrojom svetla (určité spektrum ultrafialového žiarenia), začnú žiariť oranžovo alebo jasne červeno na čiernom alebo tmavozelenom pozadí. Vďaka vysokému jasu a kontrastu viditeľného obrazu je možné celkové zväčšenie mikroskopu znížiť 4 – 10-krát, čo rozširuje zorné pole a skracuje čas pozorovania preparátu. Spolu s tým je možné vďaka výrazne väčšej hĺbke ostrosti zvýšiť komfort štúdie.

Pri použití fluorescenčnej mikroskopie trvá pozorovanie tej istej oblasti náteru výrazne kratšie ako svetelná mikroskopia náterov zafarbených podľa Ziehl-Neelsena. Ak mikroskopista počas pracovného dňa prezrie približne 20 – 25 takýchto náterov, potom s pomocou fluorescenčnej mikroskopie dokáže za rovnaký čas vyšetriť viac ako 60 – 80 vzoriek. Skúsení mikroskopisti vedia, že farbenie buniek zmesou auramínu a rodamínu je určitým spôsobom špecifické pre acidorezistentné mykobaktérie, ktoré v tomto prípade majú vzhľad zlatých tyčiniek. Saprofyty sa farbia nazeleno.

Ďalšou dôležitou výhodou metódy fluorescenčnej mikroskopie je schopnosť detegovať zmenené mykobaktérie, ktoré stratili svoje vlastnosti odolné voči kyselinám pod vplyvom mnohých nepriaznivých faktorov, najmä intenzívnej chemoterapie, a preto ich nie je možné detegovať farbením Ziehl-Neelsen.

Nevýhodou metódy fluorescenčnej mikroskopie sú relatívne vysoké náklady na mikroskop a jeho prevádzku. V centralizovaných alebo iných veľkých laboratóriách, kde pracovná záťaž presahuje normu troch laboratórnych technikov pracujúcich s tromi konvenčnými mikroskopmi, je však lacnejšie použiť jeden fluorescenčný mikroskop.

Bakterioskopické metódy majú pomerne vysokú špecificitu (89-100%). Približne 97 % pozitívnych výsledkov získaných akoukoľvek mikroskopickou metódou je jasne potvrdených výsledkami výsevu.

Treba poznamenať, že mikroskopické vyšetrenie náteru patologického materiálu neumožňuje určiť druh zistených kyselinorezistentných mykobaktérií. Mikroskopická metóda umožňuje vyvodiť záver iba o prítomnosti alebo neprítomnosti kyselinorezistentných mikroorganizmov v prípravku, čo sa vysvetľuje existenciou veľkého počtu netuberkulóznych kyselinorezistentných mikroorganizmov v prírode, ktoré sú morfologicky podobné mykobaktériám tuberkulózneho komplexu.

Vyhodnotenie výsledkov mikroskopie sa vykonáva v semikvantitatívnych jednotkách.

Aby bolo možné porovnať výsledky rôznych mikroskopických metód, zavádzajú sa empirické koeficienty. Napríklad na porovnanie výsledkov náteru zafarbeného fluorescenčnými farbivami s údajmi zo svetelnej mikroskopie (1000-násobné zväčšenie) je potrebné vydeliť počet acidorezistentných mykobaktérií detegovaných pomocou fluorescenčného mikroskopu zodpovedajúcim koeficientom: pri 250-násobnom zväčšení mikroskopu - 10, pri 450-násobnom zväčšení - 4, pri 630-násobnom zväčšení - 2.

Charakteristiky mikroskopie pri extrapulmonálnej tuberkulóze

Vykonáva sa priama mikroskopia, ako aj mikroskopia náterov pripravených po obohatení s následným farbením podľa Ziehl-Neelsena alebo fluorescenčnými farbivami. Priama mikroskopia náterov je neúčinná kvôli nízkej koncentrácii mykobaktérií v materiáli, a preto je racionálnejšie použiť metódy obohacovania. Najúčinnejšia je centrifugácia. Ak je biologický materiál viskózny, používa sa centrifugácia so súčasnou homogenizáciou a skvapalnením materiálu, ktorá sa vykonáva pomocou vysokorýchlostných centrifúg s centrifugačnou silou 3000 g a roztokov chlórnanu. Iné metódy obohacovania, ako napríklad mikroflotácia, sa v súčasnosti nepoužívajú kvôli tvorbe biologicky nebezpečných aerosólov.

[ 37 ]

Kultivačná metóda na diagnostiku tuberkulózy

Metóda očkovania alebo kultivačná metóda je citlivejšia ako mikroskopia náteru a má oproti nej množstvo výhod. Umožňuje detegovať niekoľko desiatok životaschopných mykobaktérií v skúmanom materiáli a má vysokú diagnostickú hodnotu. To je obzvlášť dôležité pri skúmaní materiálu od novodiagnostikovaných alebo liečených pacientov, ktorí vylučujú malé množstvo mykobaktérií.

V porovnaní s mikroskopiou umožňuje kultivačný výskum zvýšiť počet zistených pacientov s tuberkulózou o viac ako 15 – 25 %, ako aj overiť tuberkulózu v skorších štádiách, keď je ochorenie ešte ľahko liečiteľné. Za veľmi dôležitú výhodu kultivačného výskumu sa považuje možnosť získať kultúru patogénu, ktorú je možné identifikovať a študovať vo vzťahu k citlivosti na lieky, virulencii a iným biologickým vlastnostiam.

Medzi nevýhody kultivačných metód patrí ich trvanie (čakacia doba na materiály dosahuje 10 týždňov), vyššie náklady a zložitosť spracovania diagnostického materiálu.

Zásady predsejbovej úpravy diagnostického materiálu

Konvenčné mikrobiologické metódy sa nedajú použiť na vykonávanie testov na tuberkulózu. Je to spôsobené tým, že mykobaktérie tuberkulózy rastú veľmi pomaly a väčšina klinických vzoriek obsahuje rýchlo rastúce pyogénne a hnilobné mikroorganizmy a huby. Ich rýchly rast na bohatých živných médiách narúša vývoj mykobaktérií a neumožňuje izoláciu patogénu tuberkulózy, preto je potrebné diagnostický materiál pred výsevom predupraviť. Okrem toho sú mykobaktérie uvoľnené z dýchacích ciest pacienta zvyčajne obklopené veľkým množstvom hlienu, čo sťažuje ich koncentráciu. V tomto ohľade je potrebné spúta a iné podobné materiály pred výsevom skvapalniť a dekontaminovať.

Všetky detergenty a dekontaminanty majú viac či menej výrazný toxický účinok na mykobaktérie. V dôsledku ošetrenia môže uhynúť až 90 % mykobaktérií. Aby sa zachovala dostatočná časť mykobakteriálnej populácie, je potrebné používať šetrné metódy ošetrenia, ktoré umožňujú na jednej strane potlačiť rýchlo rastúce pyogénne a hnilobné mikroorganizmy a na druhej strane maximálne zachovať životaschopnosť mykobaktérií prítomných v materiáli.

V závislosti od materiálu, jeho homogenity a úrovne kontaminácie sa na predosiate ošetrenie používajú rôzne dekontaminanty: na spúta - 4 % roztok hydroxidu sodného, 10 % roztoky trisodného fosforečnanu, benzalkóniumchlorid, trisodný fosforečnan, NALC-NaOH (N-acetyl-L-cysteín-hydroxid sodný) s konečnou koncentráciou NaOH 1 %, na moč a iné tekuté materiály - 3 % roztok kyseliny sírovej, na kontaminované vzorky, materiály obsahujúce tuk - roztok kyseliny šťaveľovej do 5 %. Okrem toho sa v niektorých prípadoch používajú enzýmy a povrchovo aktívne látky (detergenty). Použitie Tweenu a niektorých ďalších detergentov je sprevádzané menšou smrťou mykobakteriálnych buniek (prežíva 40 – 50 %). Môžu sa však použiť iba na tekuté materiály. NALC-NaOH, vyrábaný v súpravách, je na svete najpoužívanejší. Táto metóda umožňuje izolovať viac ako 85 % populácie mykobakteriálnych buniek. Dekontaminácia pevných materiálov obsahujúcich tkanivá je náročnejšia, pretože je ťažké odhadnúť stupeň disperzie materiálu počas homogenizácie. Napríklad spracovanie biopsií lymfatických uzlín je často sprevádzané zvýšenou frekvenciou kontaminácie cudzou flórou. V tomto prípade sa môže použiť 1% etonium.

Nehomogénny materiál sa homogenizuje pomocou sklenených guľôčok za prítomnosti dekontaminantov. Kvapalné materiály sa predcentrifugujú a spracováva sa iba sediment.

Technika siatia a inkubácie

Po predbežnom spracovaní sa materiál centrifuguje, čím sa vyzrážajú mykobaktérie a zvyšuje sa ich obsah v sedimente („obohatenie sedimentu“). Výsledný sediment sa neutralizuje a inokuluje na povrch hustých živných médií alebo skúmaviek s kvapalnými (polokvapalnými) médiami. Zo zvyšného sedimentu sa pripravujú nátery na mikroskopické vyšetrenie. Technika očkovania musí zabrániť krížovej kontaminácii diagnostického materiálu.

Pre spoľahlivú klinickú interpretáciu výsledkov mikrobiologického výskumu je potrebné dodržiavať toto pravidlo: mikroskopické a kultúrne štúdie sa musia vykonávať paralelne z tej istej vzorky diagnostického materiálu.

Naočkované skúmavky sa umiestnia na 2 dni do termostatu pri teplote 37 ^° C v horizontálnej polohe. Tým sa zabezpečí rovnomernejšie vstrebávanie materiálu do živného média. Po 2 dňoch sa skúmavky premiestnia do vertikálnej polohy a hermeticky sa utesnia gumenými alebo silikónovými zátkami, aby sa zabránilo vysychaniu naočkovaného média.

Plodiny sa uchovávajú v termostate pri teplote 37 ^° C počas 10 – 12 týždňov s pravidelnou týždennou kontrolou. Pri každej kontrolnej prehliadke sa zaznamenávajú nasledujúce parametre:

• obdobie vizuálne pozorovateľného rastu od dňa siatia;
• rýchlosť rastu (počet CFU);
• kontaminácia kultúry cudzou mikrobiálnou flórou alebo hubami (takéto skúmavky sa odstránia);
• žiadny viditeľný rast. Trubice sa ponechajú v termostate až do ďalšej kontroly.

Živné médiá

Na kultiváciu mykobaktérií sa používajú rôzne živné médiá: pevné, polokvapalné, kvapalné. Žiadne zo známych živných médií však nemá vlastnosti, ktoré by zabezpečili rast všetkých mykobakteriálnych buniek. V tomto ohľade sa na zlepšenie účinnosti odporúča súčasne používať 2 – 3 živné médiá rôzneho zloženia.

Ako štandardné médium na primárnu izoláciu patogénu tuberkulózy a stanovenie jeho citlivosti na lieky WHO odporúča Lowenstein-Jensenovo médium. Ide o husté vaječné médium, na ktorom sa rast mykobaktérií dosahuje 20. – 25. deň po zasiatí bakterioskopicky pozitívneho materiálu. Zasiatie bakterioskopicky negatívneho materiálu si vyžaduje dlhšiu inkubačnú dobu (až 10 – 12 týždňov).

V našej krajine sa rozšírilo vaječné médium Finn-II, ktoré navrhol E. R. Finn. Líši sa tým, že namiesto L-asparagínu používa glutaman sodný, ktorý spúšťa iné dráhy syntézy aminokyselín v mykobaktériách. Rast sa na tomto médiu objavuje o niečo skôr a frekvencia izolácie mykobaktérií je o 6 – 8 % vyššia ako na médiu Lowenstein-Jensen.

Pre zvýšenie účinnosti bakteriologickej diagnostiky extrapulmonálnej tuberkulózy je vhodné do komplexu živných médií zahrnúť modifikované médium Finn-II. Pre urýchlenie rastu sa do živného média Finn-II dodatočne zavádza 0,05 % tioglykolátu sodného, čo znižuje koncentráciu kyslíka. Na ochranu enzýmových systémov mykobaktérií pred toxickými produktmi lipidovej peroxidácie sa do živného média Finn-II zavádza antioxidant α-tokoferolacetát v koncentrácii 0,001 μg/ml. Diagnostický materiál sa vysieva štandardnou metódou.

V laboratóriách proti tuberkulóze v Rusku sa používajú aj iné modifikácie hustých živných médií: živné médium „Novaya“ navrhnuté G. G. Mordovským, živné médiá A-6 a A-9 vyvinuté V. Anikinom atď.

Vzhľadom na to, že počas chemoterapie dochádza k poškodeniu rôznych metabolických systémov mikrobiálnej bunky, časť mykobakteriálnej populácie stráca schopnosť normálne sa vyvíjať na konvenčných živných médiách a vyžaduje osmoticky vyvážené (polokvapalné alebo kvapalné) živné médiá.

Vyhodnotenie a zaznamenávanie výsledkov diagnostickej materiálovej kultúry

Niektoré kmene a druhy mykobaktérií rastú pomaly, rast sa môže objaviť už do 90. dňa. Počet takýchto kultúr je malý, ale to núti výsev uchovávať v termostate 2,5-3 mesiace.

Virulentné kultúry Mycobacterium tuberculosis zvyčajne rastú na pevných vaječných médiách ako R-formy kolónie rôznej veľkosti a vzhľadu. Kolónie sú suché, zvráskavené, slonovinovej farby a mierne pigmentované. Na iných médiách môžu byť kolónie Mycobacterium tuberculosis vlhkejšie. Po chemoterapii alebo počas liečby sa môžu izolovať hladké kolónie s vlhkým rastom (S-formy).

Pri izolácii kultúr sa používa súbor špeciálnych štúdií na rozlíšenie tuberkulóznych mykobaktérií od netuberkulóznych mykobaktérií a acidorezistentných saprofytov.

Pozitívna odpoveď sa poskytne po povinnom mikroskopickom vyšetrení náteru z vypestovaných kolónií zafarbených podľa Ziehl-Neelsena. V prípade rastu mykobaktérií sa v náteroch nachádzajú jasne červené tyčinky, ležiace jednotlivo alebo v skupinách a tvoriace zhluky vo forme plsti alebo vrkočov. V mladých kultúrach, najmä v tých, ktoré sú izolované od pacientov dlhodobo liečených chemoterapiou, sa mykobaktérie vyznačujú výrazným polymorfizmom, až po prítomnosť krátkych, takmer kokoidných alebo predĺžených variantov pripomínajúcich hubové mycélium, spolu s tyčinkovitými formami.

Intenzita rastu mykobaktérií sa určuje podľa nasledujúcej schémy: (+) - 1-20 CFU v skúmavke (nízke vylučovanie baktérií); (++) - 20-100 CFU v skúmavke (stredné vylučovanie baktérií); (+++) - >100 CFU v skúmavke (hojné vylučovanie baktérií). V laboratórnej diagnostike tuberkulózy nestačí len uviesť, či boli mykobaktérie konkrétnou metódou detegované alebo nie. Je tiež potrebné mať podrobnú predstavu o objeme a povahe mykobaktériovej populácie, jej zložení a vlastnostiach. Práve tieto údaje umožňujú správne interpretovať stav procesu, naplánovať taktiku a včas upraviť liečbu.

V posledných rokoch boli na urýchlenie rastu mykobaktérií navrhnuté živné médiá na báze agaru s rôznymi rastovými prísadami a použitím špeciálnej zmesi plynov. Na dosiahnutie rastu mykobaktérií na týchto médiách sa počas kultivácie vytvára atmosféra so zvýšeným obsahom oxidu uhličitého (4 – 7 %). Na tento účel sa používajú špeciálne CO2 inkubátory _. Najväčší rozvoj však zaznamenali automatizované systémy kultivácie mykobaktérií: MGIT-BACTEC-960 a MB/Bact.

Jedným z takýchto systémov je systém MGIT (mycobacteria growth indicating tubercule), ktorý je high-tech vývojom a je určený na zrýchlenú bakteriologickú diagnostiku tuberkulózy a stanovenie citlivosti mykobaktérií na lieky prvej voľby a niektoré lieky druhej voľby. MGIT je určený na použitie ako súčasť zariadenia VASTEC-960. Mikroorganizmy sa kultivujú v špeciálnych skúmavkách s tekutým živným médiom na báze modifikovaného média Middlebrook-7H9. Na stimuláciu rastu mykobaktérií a potlačenie rastu cudzej mikroflóry sa používa rastový doplnok MGIT a zmes antibakteriálnych liečiv PANTA.

Rast mikroorganizmov sa registruje opticky. Je založený na fluorescencii, ktorá vzniká, keď mykobaktérie počas rastu spotrebúvajú kyslík. Na dne špeciálnej skúmavky sa nachádza fluorochrómové farbivo závislé od kyslíka, ktoré je pokryté vrstvou silikónu. Rozmnožovanie mykobaktérií vedie k zníženiu množstva kyslíka v skúmavke a zníženiu jeho koncentrácie, čo spôsobuje zvýšenie fluorescencie, ktorá sa stáva viditeľnou po ožiarení skúmavky ultrafialovým svetlom a je automaticky registrovaná fotosenzormi zabudovanými v zariadení VASTES-960. Intenzita luminiscencie sa registruje v rastových jednotkách (GU). Údaje o raste sa automaticky zadávajú do počítača, kde ich možno uložiť. Počítačová analýza rastových kriviek môže poskytnúť informácie o prítomnosti rôznych skupín mykobaktérií vrátane netuberkulóznych a tiež pomáha vyhodnotiť rastové vlastnosti mykobaktérií.

V dôsledku zavedenia takýchto systémov sa výrazne skrátil čas rastu mykobaktérií, v priemere 11 dní na VASTEC-960 a 19 dní na MB/Bact oproti 33 dňom na štandardnom hustom živnom médiu. Treba poznamenať, že tieto systémy vyžadujú vysoko kvalifikovaný personál. Výsev materiálu na tekuté médiá je nevyhnutne sprevádzaný výsevom na Lowenstein-Jensen médium, ktoré zohráva úlohu zálohy v prípadoch, keď tuberkulózne mykobaktérie nerastú na iných médiách.

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

Stanovenie citlivosti mykobaktérií na lieky

Stanovenie spektra a stupňa citlivosti mykobaktérií na antituberkulózne lieky má veľký klinický význam, ako aj pre epidemiologické hodnotenie šírenia tuberkulózy rezistentnej na lieky. Okrem toho nám monitorovanie rezistencie na lieky umožňuje posúdiť účinnosť antituberkulózneho programu ako celku a je neoddeliteľným ukazovateľom práce všetkých zložiek antituberkulóznych opatrení.

Frekvencia a načasovanie testovania citlivosti na lieky:

• pred začiatkom liečby, raz na určenie stratégie a taktiky liečby:
• Pri izolácii kultúr z rôznych materiálov od pacienta (spútum, BAL, moč, exsudáty, mozgovomiechový mok atď.) sa vyšetrujú všetky izolované kmene:
• na konci intenzívnej fázy liečby pri absencii klinickej a rádiologickej dynamiky:
• ak je potrebné zmeniť liečebný režim v prípade:
  • absencia negativity spúta;
  • rekultivácia po negatívnom teste na spúto;
  • prudký nárast množstva AFB v nátere po počiatočnom poklese. Je dobre známe, že z materiálu od pacienta s tuberkulózou sa izolujú kmene Mycobacterium tuberculosis s rôznou citlivosťou na lieky. Citlivosť kmeňov na antituberkulózne lieky sa môže líšiť v spektre liekov, stupni, frekvencii a rýchlosti vývoja rezistencie.

Stupeň rezistencie Mycobacterium tuberculosis na liečivá sa určuje v súlade so stanovenými kritériami, ktoré sú zamerané na klinický význam rezistencie a závisia od antituberkulóznej aktivity lieku, jeho farmakokinetiky, koncentrácie v lézii, maximálnej terapeutickej dávky atď.

Stanovenie citlivosti mykobaktérií na lieky sa v súčasnosti vykonáva pomocou mikrobiologických metód:

• absolútne koncentrácie (metóda riedenia na pevných alebo kvapalných živných médiách),
• proporcie,
• koeficient odporu.

Rezistencia sa zvyčajne prejavuje vo forme vizuálne pozorovaného rastu kolónií mykobaktérií tuberculosis, existujú však metódy, ktoré indukujú rast v skorých štádiách delenia mykobaktérií vo forme farebných reakcií. Tieto metódy skracujú čas testovania z 3-4 na 2 týždne.

Metóda absolútnej koncentrácie odporúčaná chemoterapeutickým výborom WHO sa v Rusku rozšírila ako jednotná metóda. Z metodologického hľadiska je najjednoduchšia, ale vyžaduje si vysokú štandardizáciu a presnosť laboratórnych postupov. Test citlivosti na liečivá pozostáva zo sady skúmaviek s živným médiom modifikovaným antituberkulóznymi liekmi. Súprava pozostáva z 2-3 skúmaviek s rôznymi koncentráciami každého z použitých liečiv, jednej kontrolnej skúmavky s médiom bez liečiva a jednej skúmavky obsahujúcej 1000 μg/ml salicylátu sodného alebo 500 μg/ml kyseliny paranitrobenzoovej na detekciu rastu netuberkulóznych mykobaktérií.

Na prípravu sady médií s preparátmi sa používa modifikované Lowenstein-Jensenovo médium (bez škrobu), ktoré sa naleje do baniek. Do každej banky sa pridá určitý objem zodpovedajúceho riedenia antituberkulózneho lieku. Obsah baniek sa dôkladne premieša, naleje do skúmaviek a koaguluje sa v naklonenej polohe 40 minút pri teplote 85 °C. Odporúča sa koagulovať médium v elektrickom koagulátore s automatickou reguláciou teploty. Médium s antituberkulóznymi liekmi

1. rad sa môže skladovať v chladničke pri teplote 2 – 4 °C počas 1 mesiaca, s liekmi 2. radu – nie dlhšie ako 2 týždne. Skladovanie médií s liekmi pri izbovej teplote je neprijateľné. Pri príprave roztokov antituberkulóznych liekov sa berie do úvahy ich aktivita, pričom sa koncentrácia vypočíta s úpravou na molekulovú hmotnosť nešpecifickej časti lieku, čistotu atď. Na stanovenie citlivosti na liek sa používajú iba chemicky čisté látky.

Princípom metódy je stanovenie koncentrácie antituberkulózneho lieku, ktorá potláča rast významnej časti populácie mykobaktérií. Pri správnom vykonaní má táto metóda dobrú spoľahlivosť.

Pred vykonaním testu je potrebné sa uistiť, že izolovaná kultúra Mycobacterium tuberculosis neobsahuje cudziu mikroflóru. Z kultúry mykobaktérií v 0,9 % roztoku chloridu sodného sa pripraví homogénna suspenzia obsahujúca 500 miliónov mikrobiálnych teliesok v 1 ml (optický štandard zákalu 5 jednotiek). Výsledná suspenzia sa zriedi 0,9 % roztokom chloridu sodného (1:10) a do každej skúmavky súpravy živných médií sa pridá 0,2 ml suspenzie. Naočkované skúmavky sa umiestnia do termostatu pri teplote 37 °C a uchovávajú sa horizontálne 2 – 3 dni tak, aby sa šikmý povrch živného média rovnomerne naočkoval suspenziou Mycobacterium tuberculosis. Potom sa skúmavky premiestnia do vertikálnej polohy a inkubujú sa 3 – 4 týždne. Výsledky sa zaznamenajú po 3 – 4 týždňoch.

Keďže čas potrebný na izoláciu patogénu z klinického materiálu na živných médiách je najmenej 1 – 1,5 mesiaca, výsledky stanovenia citlivosti na liečivá pomocou tejto metódy je možné získať najskôr 2 – 2,5 mesiaca po zasiatí materiálu. Toto je jedna z hlavných nevýhod metódy.

Výsledky testovania citlivosti mykobakterií na liečivá sa interpretujú na základe určitých kritérií. Na pevných médiách sa kultúra považuje za citlivú na koncentráciu liečiva obsiahnutého v médiu, ak počet mykobakteriálnych kolónií vypestovaných v danej skúmavke s liečivom nepresiahne 20 s hojným rastom v kontrolnej skúmavke bez liečiv. Iba ak je viac ako 20 kolónií, kultúra sa považuje za rezistentnú na danú koncentráciu. V praxi, keď sa v skúmavkách dosiahnu výsledky rastu blízke 20 CFU, je potrebné informovať klinické oddelenie, že citlivosť alebo rezistencia je v tomto prípade hraničná, pretože to môže niekedy vysvetliť nejasnú dynamiku klinických ukazovateľov.

Pre rôzne prípravky sa stanovuje určitá koncentrácia, pri ktorej sa pozoruje reprodukcia kritického podielu mykobakteriálnej populácie. Tieto koncentrácie sa nazývajú „kritické“. Ako kritérium stability sa používa miera rastu mykobakteriálnej populácie na živnom médiu s prípravkom v kritickej koncentrácii.

V domácej ftizeologickej praxi sa pri určovaní liekovej rezistencie neobmedzujú len na stanovenie kritických koncentrácií. Je to spôsobené tým, že rozšírená definícia úrovne liekovej rezistencie patogénu umožňuje lekárovi presnejšie formulovať taktiku chemoterapie s využitím znalostí o potenciačnom účinku kombinácií liekov, predvídať skríženú rezistenciu alebo použiť účinnejšie lieky z použitej skupiny antituberkulóznych liekov.

Metóda absolútnej koncentrácie je najjednoduchšia, ale aj najcitlivejšia na chyby pri jej implementácii. Spoľahlivejšia, najmä pri určovaní citlivosti na lieky druhej voľby, a rozšírenejšia mimo Ruska je proporcionálna metóda. Zohľadňuje nedostatky metódy absolútnej koncentrácie, ale jej implementácia je náročnejšia na prácu.

Metóda je veľmi podobná metóde absolútnej koncentrácie. Príprava skúmaviek s liečivami je rovnaká ako pri metóde absolútnej koncentrácie. Iniciálna dávka suspenzie tuberkulóznych mykobaktérií sa však 10-krát zníži, čo eliminuje frekvenciu spontánnej rezistencie niektorých kmeňov tuberkulóznych mykobaktérií na liečivá, ako je etambutol, protionamid, kapreomycín. Ako kontroly sa používajú 2 alebo 3 skúmavky s iniciálnou dávkou rovnakou ako v skúmavkách, postupne zriedené 10 a 100-krát. Kritériom rezistencie je podiel vizuálne pozorovaného rastu tuberkulóznych mykobaktérií. Pre liečivá 1. línie je kritériom rezistencie nadmerný rast o 1 % počiatočnej populácie, pre liečivá 2. línie - rast o 1 alebo viac ako 10 % počiatočnej populácie v závislosti od zvolenej kritickej koncentrácie.

V roku 1997 pracovná skupina WHO a Medzinárodnej únie proti tuberkulóze pre detekciu rezistencie na antituberkulózne lieky upravila tieto kritériá a navrhla považovať mykobaktérie rastúce na hustom vaječnom médiu Lowenstein-Jensen pri nasledujúcich koncentráciách za rezistentné:

• dihydrostreptomycín - 4 μg/ml;
• izoniazid - 0,2 µg/ml:
• rifampicín - 40 mcg/ml:
• Etambutol - 2 mcg/ml.

V roku 2001 boli navrhnuté kritické koncentrácie pre nasledujúce lieky druhej voľby (pre kritický podiel 1 %):

• kapreomycín - 40 mcg/ml;
• protionamid - 40 mcg/ml;
• kanamycín - 30 μg/ml;
• viomycín - 30 μg/ml;
• cykloserín - 40 mcg/ml;
• kyselina aminosalicylová - 0,5 mcg/ml;
• ofloxacín - 2 mcg/ml.

Výsledky rastu sa hodnotia po 4 týždňoch ako predbežné a po 6 týždňoch kultivácie ako konečné.

Na stanovenie citlivosti na pyrazínamid, ktorý sa široko používa v modernej chemoterapii tuberkulózy, je odporúčaná kritická koncentrácia 200 μg/ml. Stále však neexistuje všeobecne akceptovaná metóda na stanovenie rezistencie na tento liek na pevných živných médiách, pretože jeho antibakteriálna aktivita sa prejavuje iba v kyslom prostredí (pH < 6), ktoré je technicky náročné udržiavať. Okrem toho mnohé klinické kultúry Mycobacterium tuberculosis neradi rastú na vaječných médiách s kyslým prostredím.

Na posúdenie kvality výsledkov stanovenia citlivosti mykobaktérií na liečivá sa odporúča kontrolovať každú novú šaržu média Lowenstein-Jensen paralelným stanovením citlivosti štandardného múzejného kmeňa H37Rv. Okrem toho existujú určité mikrobiologické kritériá, ktoré musia byť splnené, aby metódy poskytli dobre reprodukovateľný a správne interpretovaný výsledok. Patria sem životaschopnosť kultúry tuberkulóznych mykobaktérií, pravidlá pre získanie homogénnej suspenzie a suspenzie, pravidlá pre výber kultúr tuberkulóznych mykobaktérií a reprezentatívnosť vybranej bakteriálnej hmoty. Spoľahlivosť stanovenia rezistencie na liečivá klesá pri extrémne slabom vylučovaní baktérií.

V poslednej dobe sa metóda stanovenia citlivosti na lieky pomocou automatizovaných systémov ukázala ako sľubná. Najpokročilejším v tejto oblasti je vývoj založený na VASTEC MGIT-960. V tomto prípade sa citlivosť mykobaktérií tuberkulózy na lieky určuje na základe modifikovanej proporcionálnej metódy. Počas stanovenia sa porovnáva rýchlosť rastu mykobaktérií tuberkulózy v kontrolnej skúmavke a v skúmavkách s liekmi. Na stanovenie citlivosti na streptomycín, izoniazid, rifampicín a etambutol sa používajú obohacujúce prísady a antibiotiká, ktoré sú súčasťou súpravy SIRE. Na stanovenie citlivosti na pyrazínamid sa používa súprava PZA. Počas testu sa skúmavky s liekmi inokulujú suspenziou mykobaktérií tuberkulózy, ako aj kontrolné skúmavky so 100-násobným riedením suspenzie pre všetky lieky, s výnimkou pyrazínamidu, kde je riedenie suspenzie 10-násobné. Kritériom stability je indikátor rastu mykobaktérií 100 GU, keď rast v kontrolnej skúmavke dosiahne 400 GU (pozri „Kultivačné metódy na izoláciu mykobaktérií“). Výsledky sa zaznamenávajú a interpretujú automaticky a nastavuje ich zadaný alebo zvolený program.

Konečné koncentrácie v skúmavke s tekutým živným médiom sa používajú ako kritické koncentrácie. V súčasnosti boli kritické koncentrácie vyvinuté pre lieky prvej voľby aj pre niektoré lieky druhej voľby. Treba poznamenať, že stanovenie citlivosti tuberkulóznych mykobaktérií na cykloserín a kyselinu aminosalicylovú sa vykonáva iba na vaječných živných médiách.

Podrobný protokol pre prácu s opísaným systémom umožňuje testovanie citlivosti na lieky na izolovanej kultúre (s hustým živným médiom) aj s použitím primárneho rastu mykobaktérií v skúmavke MGIT. Druhá možnosť výrazne skracuje čas potrebný na vykonanie kultivačných štúdií, čo umožňuje získať kompletné výsledky kultúry tuberkulóznych mykobaktérií (vrátane informácií o citlivosti na lieky) do 3 týždňov od odberu materiálu, zatiaľ čo tradičná metóda to dokáže poskytnúť až do 3. mesiaca. Včasné výsledky, keď je pacient v intenzívnej fáze liečby, môžu kompenzovať relatívne vysoké náklady na štúdie.

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

Diferenciácia mykobaktérií

Vzhľadom na to, že použité živné médiá nie sú striktne selektívne, následná diferenciácia izolovaných mykobaktérií sa považuje za povinnú. Potreba diferenciácie mykobaktérií je spôsobená množstvom charakteristík patologických procesov spôsobených zástupcami rodu: odlišný priebeh a výsledok tuberkulózy a mykobakteriózy, prítomnosť prirodzenej rezistencie na niektoré antituberkulózne lieky.

Je známe, že primárna identifikácia mykobaktérií komplexu M. tuberculosis od netuberkulóznych mykobaktérií sa vykonáva podľa nasledujúcich charakteristík: rýchlosť rastu na hustých živných médiách, tvorba pigmentu, morfológia kolónií, prítomnosť kyselinovej rezistencie a teplotné optimum pre rast.

Bohužiaľ, neexistuje jediná laboratórna metóda, ktorá by spoľahlivo rozlíšila mykobaktérie komplexu M. tuberculosis od iných acidorezistentných mykobaktérií; kombinácia vyššie opísaných znakov s výsledkami viacerých biochemických testov uvedených nižšie však umožňuje identifikáciu mykobaktérií komplexu M. tuberculosis s pravdepodobnosťou až 95 %.

Na rozlíšenie mykobaktérií komplexu M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii a ďalšie) od pomaly rastúcich netuberkulóznych mykobaktérií sa používajú základné biochemické testy na zistenie prítomnosti nasledujúcich znakov:

• schopnosť produkovať kyselinu nikotínovú (niacínový test):
• aktivita nitrátreduktázy;
• termostabilná kataláza;
• rast na médiu so salicylátom sodným (1 mg/ml).

Ako ďalší test sa môžu použiť aj rastové testy na médiu obsahujúcom 500 μg/ml kyseliny para-nitrobenzoovej alebo 5 % chloridu sodného.

Mnohé bakteriologické laboratóriá identifikujú tieto mikroorganizmy iba na komplexnej úrovni, čo je spôsobené obmedzenými možnosťami laboratórií a metodologickými schopnosťami špecialistov.

V praxi vo väčšine prípadov postačujú na rozlíšenie M. tuberculosis a M. bovis nasledujúce testy: niacín, nitrátreduktáza, pyrazínamidáza a registrácia rastu na médiu obsahujúcom 2 μg/ml hydrazidu kyseliny tiofén-2-karboxylovej. Berie sa do úvahy, že mykobaktérie komplexu M. tuberculosis sa vyznačujú nasledujúcim súborom znakov:

• pomalý rast (viac ako 3 týždne);
• teplota rastu v rozmedzí 35-37 ^° C;
• absencia pigmentácie (slonovinová farba);
• výrazné kyselinovo-stále sfarbenie;
• pozitívny test na niacín;
• pozitívny test na nitrátreduktázu;
• absencia termostabilnej katalázy (68 ^° C).
• nedostatok rastu na Lowenstein-Jensenovom médiu obsahujúcom:
  • 1000 µg/ml kyseliny salicylovej sodnej,
  • 500 mcg/ml kyseliny para-nitrobenzoovej,
  • 5 % chlorid sodný:
• rast v prítomnosti 1 – 5 μg/ml kyseliny tiofén-2-karboxylovej.

Relevantnosť diferenciácie izolovaných mykobaktérií sa výrazne zvýši s rastúcou frekvenciou registrácie prípadov HIV/AIDS spojených s tuberkulózou alebo mykobakteriózou. V súčasnosti neexistuje absolútna istota o pripravenosti praktických regionálnych laboratórií správne vykonávať tento objem práce.

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

Imunologická diagnostika tuberkulózy

Existuje množstvo univerzálnych javov, prípravkov a imunologických testov, ktoré boli pôvodne objavené špecificky pri tuberkulóze alebo v modeli imunitnej odpovede na mykobaktérie. Patria sem BCG a tuberkulín, javy ako kožné DST (tuberkulínové testy - Pirquetova a Mantouxova reakcia), reakcia na subkutánne podanie tuberkulínu senzibilizovaným zvieratám (Kochov fenomén). Niektoré z prvých protilátok pri infekčných ochoreniach boli tiež objavené pri tuberkulóze. Samozrejme, čím hlbšie je pochopenie mechanizmov antituberkulóznej imunity a ich genetickej kontroly, tým širšie môže byť využitie imunologických metód a prípravkov ovplyvňujúcich imunitu na riešenie praktických problémov ftizeológie.

Za najdôležitejší a najzložitejší praktický problém sa v súčasnosti považuje detekcia tuberkulózy v procese hromadného skríningu populácie. Napriek početným správam o „úspechoch“ (na obmedzenom materiáli) však neexistuje žiadna imunologická metóda (reprodukovateľná v „ľubovoľných rukách“) ani liek vhodný na tieto účely.

V klinickej praxi sa široko používajú imunologické metódy, najmä sérologické štúdie (stanovenie antigénov, protilátok) a tuberkulínové provokačné testy.

Sérologické metódy, ktoré stanovujú antigény a protilátky v rôznych prostrediach tela, sú na prvom mieste medzi imunologickými štúdiami používanými v diferenciálnej diagnostike.

Špecificita stanovenia protilátok proti mykobaktériám tuberculosis závisí od antigénov použitých v imunitnej analýze. Bol navrhnutý značný počet antigénov, z ktorých prvým je tuberkulín PPD:

• PPD a iné komplexné prípravky z kultivačnej tekutiny;
• ultrazvukový dezintegračný prostriedok;
• Extrakt z Tritónu a iné komplexné prípravky bunkových stien;
• 5-antigén (Daniel);
• 60-antigén (Coccito);
• lipoarabinomanán;
• kordový faktor (trehalóza-6,6-dimykolát);
• fenolové a iné glykolipidy;
• lipopolysacharidy;
• antigén viažuci fibronektín;
• proteíny (najčastejšie rekombinantné); 81, 65, 38, 34, 30, 19, 18, 16, 15,12 KDA atď.

V dôsledku dlhoročného výskumu ruských a zahraničných vedcov boli identifikované hlavné vzorce tvorby protilátok a účinnosť sérologickej diagnostiky tuberkulózy: čím komplexnejší antigén, tým vyššia je citlivosť a nižšia špecificita testov. Špecificita sa v rôznych krajinách líši v závislosti od infekcie populácie M. tuberculosis a netuberkulóznymi mykobaktériami, od očkovania BCG atď. U detí je informatívnosť sérodiagnostiky nižšia ako u dospelých. Pri primárnej tuberkulóze (častejšie u detí) je informatívnejšie stanovenie IgM; pri sekundárnej tuberkulóze - IgG. U HIV-infikovaných ľudí je informatívnosť sérodiagnostiky pri stanovovaní protilátok znížená. Účinnosť stanovenia protilátok závisí od viacerých „klinických momentov“: aktivity procesu (prítomnosť alebo neprítomnosť „izolácie“ mykobaktérií, prítomnosť kazových dutín, stupeň infiltrácie), prevalencie procesu, trvania jeho priebehu.

Citlivosť metódy enzýmového imunotestu (EIA) je približne 70 %. Nedostatočná účinnosť štúdie je spôsobená jej nízkou špecificitou. Predtým sa zvažovali možnosti využitia sérologického skríningu u vysoko rizikových skupín, najmä u ľudí s posttuberkulóznymi zmenami v pľúcach.

Na zvýšenie špecifickosti testu ELISA sa hľadajú špecifickejšie antigény, vrátane antigénov získaných genetickým inžinierstvom: ESAT-6 atď. (pozri vyššie). Použitie striktne špecifických antigénov (38 kDa, ESAT) zvyšuje špecificitu, ale výrazne znižuje citlivosť analýzy. Spolu s testom ELISA (experimentálne laboratórne testovacie systémy, ako napríklad Pathozyme ELISA kit) sa ponúkajú aj imunochromatografické súpravy s laterálnou filtráciou (Mycodot), ako aj ďalšie podobné testy (membránová bodková analýza) s vizuálnym hodnotením výsledku testu. Pri vykonávaní týchto testov trvá analýza 10 – 30 minút; nevyžadujú špeciálne vybavenie, vyžadujú si vizuálne hodnotenie výsledkov, čo je spojené s určitou subjektivitou. Tieto metódy majú približne rovnaké charakteristiky citlivosti a špecifickosti (70 % a 90 – 93 %) ako tradičný test ELISA.

Použitie metód imunologickej analýzy má určitú hodnotu ako doplnková metóda zohľadňovaná v komplexe metód používaných v diferenciálnej diagnostike tuberkulózy, najmä v diagnostike jej extrapulmonálnych foriem. Metóda ELISA je najúčinnejšia v diagnostike tuberkulóznej meningitídy pri vyšetrení mozgovomiechového moku. V tomto prípade je citlivosť analýzy 80 – 85 % a špecificita 97 – 98 %. Existujú informácie o účinnosti stanovenia protilátok proti Mycobacterium tuberculosis v slznej tekutine pri diagnostike tuberkulóznej uveitídy.

Indukcia syntézy gama interferónu in vitro

Gama interferón (IFN-γ) je faktor špecifickej imunitnej ochrany, ktorý sa realizuje aktiváciou enzýmových systémov makrofágov. Indukcia syntézy IFN-γ senzibilizovanými T-lymfocytmi je spôsobená ich interakciou s mykobakteriálnymi antigénmi.

Ako antigény sa používa tuberkulín PPD aj špecifické antigény získané genetickým inžinierstvom, najmä antigén ESAT-6 (skoro sekretovaný antigén s molekulovou hmotnosťou 6 kDa) a CFP-10 (proteín kultivačného filtrátu, 10 kDa). Geneticky upravené alebo rekombinantné antigény v bunkách BCG vakcíny a iných mykobaktérií chýbajú. Pri použití tuberkulínu sú výsledky indukčného testu IFN-γ porovnateľné s výsledkami tuberkulínového kožného testu (priama korelácia). Pri použití geneticky upravených antigénov sú výsledky testu špecifickejšie a nezávisia od predchádzajúceho očkovania BCG. Pri vyšetrení očkovaných jedincov, ktorí nemali kontakt s tuberkulóznou infekciou, je špecifickosť testu 99 %. Citlivosť testu u pacientov s tuberkulózou sa pohybuje od 81 do 89 %.

Boli vyvinuté testy a diagnostika založené na krátkodobej kultivácii celých krviniek alebo mononukleárnych buniek izolovaných z krvi s antigénmi tuberkulóznych mykobaktérií in vitro, po ktorej nasleduje stanovenie koncentrácie IFN-γ alebo počítanie počtu T-lymfocytov syntetizujúcich IFN-γ. Koncentrácia interferónu syntetizovaného v skúmavke sa stanovuje metódou ELISA s použitím monoklonálnych protilátok, ktoré viažu IFN-γ. Následne sa pomocou kalibrácie štandardného IFN-γ stanoví jeho koncentrácia v skúmavke alebo jamkách platne.

V Elispot teste sa počet T buniek syntetizujúcich IFN-γ počíta na povrchu misky potiahnutej protilátkami proti IFN-γ.

Vývojári in vitro diagnostiky s indukciou IFN-γ, ktorú schválil americký Úrad pre kontrolu potravín a liečiv (FDA), tvrdia, že test nedokáže rozlíšiť latentnú tuberkulóznu infekciu od aktívnej tuberkulózy. Preto v regiónoch s vysokou mierou infekcie nemá test priamu diagnostickú hodnotu. V našej krajine sa však môže použiť na rozlíšenie tuberkulóznej infekcie u detí od alergie po očkovaní, ako aj na posúdenie úrovne špecifickej imunity počas liečby.

V súčasnosti sa skúma domáci testovací systém na stanovenie indukcie syntézy IFN-γ špecifickými tuberkulóznymi antigénmi in vitro.

Imunitný stav a priebeh tuberkulózy, imunokorekcia

Počas liečby tuberkulózy sa u ľudí vyskytujú zmeny v antigémii a stave imunitného systému.

Údaje o zmenách v exsudátoch a tkanivách sú do značnej miery protichodné. Jediné, čo možno s plným opodstatnením poznamenať, je, že tuberkulózne granulómy spravidla obsahujú významný počet aktivovaných T-lymfocytov.

Je rozumné zamerať sa na ďalšie dva body, ktoré sú potrebné na pochopenie úlohy imunologických mechanizmov pri liečbe tuberkulózy u ľudí:

• Pacienti s AIDS majú obzvlášť vysoký výskyt vzniku viacnásobnej liekovej rezistencie;
• V prípade viacnásobnej liekovej rezistencie (a pri absencii HIV infekcie) sú obzvlášť významné poruchy imunity (predovšetkým T-bunkovej imunity).

Pri tuberkulóze sa široko používajú rôzne metódy imunokorekcie: v prvom rade ide o lieky, ktoré pôsobia hlavne na imunitu T-buniek a mononukleárny fagocytový systém (hormóny týmusu, izofón, likopid, polyoxidónium atď.), ako aj celé (oslabené) mykobaktérie a ich zložky.

Molekulárno-biologická diagnostika tuberkulózy

Metódy molekulárnej biológie v diagnostike infekčných chorôb zahŕňajú najmä metódy založené na manipulácii s genomickými materiálmi bakteriálnych a vírusových patogénov s cieľom identifikovať špecifický genetický materiál - úseky DNA s nukleotidovou sekvenciou špecifickou pre daný druh alebo kmeň patogénu, na analýzu špecifických sekvencií DNA v génoch, ktoré určujú citlivosť patogénu na určité lieky, ako aj na analýzu funkčnej aktivity určitých génov patogénu. Molekulárne biologické metódy sa rozšírili vo vedeckom výskume a praktickom uplatnení v diagnostike a monitorovaní rôznych bakteriálnych a vírusových infekcií po objavení polymerázovej reťazovej reakcie v roku 1985 Carrie Mullisovou (laureátkou Nobelovej ceny za rok 1989).

Princípy a možnosti metódy polymerázovej reťazovej reakcie

PCR umožňuje amplifikáciu (znásobenie) nukleotidovej sekvencie (fragmentu DNA patogénu) v skúmavke v priebehu niekoľkých hodín miliónkrát. Vykonávanie reakcie v prítomnosti jednotlivých reťazcov DNA určuje mimoriadne vysokú citlivosť analýzy.

Nukleotidová sekvencia určitých úsekov reťazca DNA určuje genetickú jedinečnosť mikroorganizmu, čo vysvetľuje vysokú špecificitu PCR.

Význam tejto metódy pre detekciu a štúdium charakteristík Mycobacterium tuberculosis je spôsobený biologickými vlastnosťami mikroorganizmu, ktorý má veľmi pomalý rast: doba zdvojnásobenia DNA Mycobacterium tuberculosis počas ich kultivácie je 12-24 hodín.

Princípom metódy PCR je amplifikácia - mnohonásobné, miliónnásobné znásobenie úsekov špecifickej sekvencie DNA v mikroobjeme skúmavky s cyklickým opakovaním nasledujúcich troch reakčných stupňov, z ktorých každý prebieha v inom teplotnom režime:

• Fáza I - denaturácia dvojvláknovej DNA pri zahrievaní s divergenciou jej reťazcov;
• Fáza II - komplementárna väzba (hybridizácia) primerov (primujúcich oligonukleotidov) s koncovými časťami reťazcov striktne špecifického fragmentu DNA vybraného na amplifikáciu;
• Fáza III – dokončenie reťazca fragmentov DNA pomocou termostabilnej DNA polymerázy.

Pre amplifikáciu musí skúmavka obsahovať molekuly matricovej DNA. Štyri typy deoxynukleozidtrifosfátov (nukleotidov) obsahujúcich zodpovedajúce dusíkaté bázy: adenín (A), tymín (T), guanín (G), cytozín (C); umelo syntetizované primingové oligonukleotidy (priméry) pozostávajúce z 18-20 párov báz; termostabilný enzým DNA polymeráza s teplotným optimom 68-72 ^° C a ióny horčíka.

Špecificita PCR závisí od výberu fragmentu DNA. V súlade s ním sa syntetizujú lemujúce priméry oligonukleotidov. Špecificita hybridizácie a dokončenie reťazca DNA je určená princípom komplementarity nasledujúcich párov dusíkatých báz: adenín-tymín, guanín-cytozín.

Na určenie genómu mykobaktérií tuberkulózneho komplexu je najúčinnejším cieľom amplifikácie vo väčšine testovacích systémov fragment DNA IS6110, ktorý má vo väčšine kmeňov mykobaktérií tuberkulózy významný počet (10-20) opakovaní v genóme, čo okrem špecifickosti zabezpečuje aj vysokú citlivosť analýzy. Zároveň boli opísané kmene mykobaktérií tuberkulózy s malým počtom opakovaní alebo absenciou fragmentu IS6110.

Extrakcia molekúl DNA z biologickej vzorky

Na vykonanie PCR je potrebné izolovať molekuly DNA patogénu z biologického materiálu v minimálnom objeme, s minimálnym množstvom nešpecifickej DNA a rôznych inhibítorov enzýmu - DNA polymerázy.

Príprava vzoriek sa musí vykonávať za podmienok, ktoré zabraňujú krížovej kontaminácii skúmaných vzoriek izolovanými molekulami DNA. To si vyžaduje predbežné ošetrenie miestnosti ultrafialovým svetlom, podláh a pracovných plôch stolov a zariadení roztokmi obsahujúcimi chlór. Je tiež potrebné používať čisté rukavice, jednorazové skúmavky a špičky pre automatické pipety.

Na izoláciu DNA Mycobacterium tuberculosis z klinických vzoriek (mozgovomiechový mok, bronchiálna laváž), ktoré neobsahujú veľké množstvo leukocytov, bunkových zvyškov alebo solí, stačí vzorku centrifugovať pri 3 – 4 000 otáčkach za minútu, pridať do sedimentu 20 – 30 µl 2 % roztoku Tritonu X-100 a zahrievať pri teplote 90 ^° C počas 30 minút.

Príprava vzorky spúta vyžaduje účinné skvapalnenie, zvyčajne s použitím 4 % hydroxidu sodného a N-acetyl-L-cysteínu (NALC) v množstve 50 – 80 mg na vzorku, v závislosti od viskozity vzorky. Roztok NALC by sa mal pripraviť ex tempore alebo sa prášok NALC môže pridať suchý priamo do vzorky. Po skvapalnení by sa vzorky mali centrifugovať 15 minút pri 3 500 – 4 000 ot./min (3 000 g) v 50 ml skúmavkách so skrutkovacím uzáverom, t. j. za rovnakých podmienok, aké sa odporúčajú pre prípravu spúta pred kultiváciou.

Na extrakciu DNA zo sedimentu sa najčastejšie používa metóda založená na použití 5-6 molárneho roztoku guanidín-izotiokyanátu ako lyzačného činidla a mikroporéznych častíc oxidu kremičitého („diatomitová hlinka“), ktoré sorbujú molekuly DNA. Nešpecifické látky vrátane možných inhibítorov sa potom premyjú v 2,5 molárnom roztoku guanidín-izotiokyanátu a etanolovom roztoku, po čom sa molekuly DNA desorbujú vo vode a tieto vzorky sa používajú na vykonanie PCR. Pre zjednodušenie technológie extrakcie DNA sa „diatomitová hlinka“ často nahrádza magnetickými mikročasticami potiahnutými oxidom kremičitým. V tomto prípade sa na precipitáciu častíc namiesto centrifugácie používa špeciálny magnetický stojan na mikroskúmavky.

V Rusku bola vyvinutá originálna metóda imunomagnetickej separácie mykobaktérií s následnou extrakciou DNA patogénu. Na imunomagnetickú separáciu tuberkulóznych mykobaktérií sa používajú feročastice s veľkosťou 3-5 μm, potiahnuté oxidom kremičitým, na ktoré sú chemickou väzbou pripojené polyklonálne (králičie) protilátky proti tuberkulóznym mykobaktériám. Vzorky spúta sa po alkalickej lýze neutralizujú kyslým roztokom Tris-HCl a inkubujú sa s imunomagnetickým sorbentom. Potom sa imunoferočastice zozbierajú pomocou magnetickej tyčinky s vymeniteľným hrotom, prenesú sa do mikroskúmavky a precipitujú. Pridá sa 20-30 μl 2% roztoku Triton X-100 a zahrieva sa 30 minút pri teplote 90 ^° C. Supernatant sa použije ako DNA matrica pre PCR analýzu.

Náročným problémom je extrakcia DNA mykobaktérií tuberkulózy z bioptických vzoriek. Na lýzu biopsie sa používa enzým proteináza K v konečnej koncentrácii 200 – 500 mg/l pri teplote 56 ^° C cez noc. Potom sa extrahuje jednou zo známych metód. Nadbytok nešpecifickej DNA v PCR analýze bioptických vzoriek často spôsobuje inhibíciu reakcie, čo si vyžaduje opakovanú extrakciu DNA.

Metódy detekcie výsledkov

Po ukončení reakcie sa amplifikované fragmenty DNA patogénu identifikujú pomocou rôznych metód.

Metóda gélovej elektroforézy je dobre známa. V tomto prípade sa získaný fragment DNA identifikuje pozitívnou kontrolou obsahujúcou požadovaný špecifický fragment DNA alebo vopred známou veľkosťou (počet nukleotidových párov) fragmentu, ktorá sa určí pomocou štandardného molekulárneho markera.

V prítomnosti špecifického farbiva - etídiumbromidu, ktoré je súčasťou dvojvláknovej DNA, sa syntetizovaný fragment DNA prejaví ako pás, ktorý svieti pod vplyvom ultrafialového svetla.

Veľkosť fragmentu DNA, určená elektroforézou na základe prejdenej vzdialenosti od začiatku, musí zodpovedať známemu markeru molekulovej hmotnosti alebo pozitívnej kontrole.

Ďalšie metódy na stanovenie výsledkov PCR sú založené na hybridizácii jednovláknových PCR produktov s komplementárnym oligonukleotidom - DNA sondou značenou biotínom, po ktorej nasleduje detekcia pomocou enzymatickej reakcie, napríklad väzbou konjugátu streptavidín-alkalická fosfatáza na biotín.

Na základe tohto typu detekcie boli vytvorené PCR analyzátory, v ktorých sa detekcia výsledkov PCR vykonáva automaticky v dôsledku odčítania optickej hustoty vo vzorkách po enzymatickej reakcii.

Nevýhodou týchto metód je možnosť kontaminácie v laboratóriu pomerne krátkymi fragmentmi molekúl DNA. Keď sa tieto molekuly dostanú do novo testovaných vzoriek, stanú sa matricou pre PCR a vedú k falošne pozitívnym výsledkom.

V tejto súvislosti sa na zabránenie falošne pozitívnym výsledkom zavádzajú prísne pravidlá pre oddelenie a izoláciu miestností: na extrakciu DNA z biologických vzoriek; miestností na detekciu výsledkov (elektroforéza) od čistej zóny. Tieto miestnosti predstavujú zónu pravdepodobnej kontaminácie. Ďalšou izolovanou zónou je čistá miestnosť na zavádzanie skúmaných vzoriek DNA do skúmaviek s reakčnou zmesou pre PCR. A nakoniec sa predpokladá, že hlavné zariadenie – DNA amplifikátor – by malo byť prenesené do samostatnej, prípadne kancelárskej miestnosti.

Aby sa zabránilo kontaminácii produktmi predchádzajúcich reakcií – amplikónmi, niektoré PCR testovacie systémy obsahujú namiesto deoxynukleozidu tymidínu deoxynukleozid uridín, ktorý sa počas syntézy reťazca in vitro zabuduje do zodpovedajúcej pozície, t. j. dusíkatá báza tymín prítomná v natívnej DNA je nahradená uracilom. Uracil DNA glykozyláza pridaná do reakčnej zmesi analyzovaného materiálu ničí iba kontaminujúce fragmenty s deoxyuridínom, ale nie natívnu analyzovanú DNA obsahujúcu deoxytymidín. Následné zahriatie na 94 ^° C tento enzým inaktivuje a neinterferuje s amplifikáciou v PCR.

Existuje testovací systém založený na izotermickej amplifikácii rRNA, pri ktorom sa najprv vykoná reverzná transkripcia a syntéza molekúl DNA, ktoré následne slúžia ako matrica pre následnú syntézu molekúl RNA. Amplikóny RNA sa detegujú pomocou DNA sondy farbenej akridínom počas hybridizácie v roztoku v reakčnej skúmavke. Táto metóda má okrem vysokej citlivosti výhodu v tom, že sa analýza vykonáva v jednej skúmavke, čo zabraňuje kontaminácii. Podľa autorov dosahuje citlivosť tejto metódy vo vzorkách z dýchacích ciest 90 % so špecificitou 99 – 100 %.

V real-time PCR sa implementujú nové detekčné metódy. Tieto metódy sa líšia predovšetkým tým, že PCR a detekcia jej výsledkov sa vykonávajú súčasne v jednej uzavretej skúmavke. To nielen technologicky zjednodušuje metódu analýzy, ale tiež zabraňuje kontaminácii laboratórnych priestorov a vzoriek produktmi predchádzajúcej PCR.

V real-time PCR sa výsledky detegujú fluorescenciou vznikajúcou hybridizáciou fluorogénnej DNA sondy so špecifickým fragmentom DNA amplifikovaným počas PCR. Štruktúra fluorogénnych DNA sond je konštruovaná tak, že fluorescenčný marker sa uvoľňuje v dôsledku enzymatickej reakcie alebo sa dištancuje od molekuly zhášača fluorescencie až po špecifickej hybridizácii s požadovanou molekulou DNA amplifikovanou počas PCR. S rastúcim počtom molekúl hybridizovaných so sondou je zvýšenie fluorescencie na detekovateľnú úroveň úmerné počtu molekúl amplifikovaného produktu. Keďže počet molekúl fragmentu DNA sa počas každého cyklu PCR zdvojnásobí, číslo cyklu, od ktorého sa fluorescencia deteguje a zvyšuje, je nepriamo úmerné počtu molekúl DNA v pôvodnej vzorke. Ak sa do reakcie ako kalibrátor zavedie niekoľko rôznych známych koncentrácií molekúl zodpovedajúceho fragmentu DNA tuberculosis mycobacterium, potom je možné počet genómov DNA v študovanom materiáli vypočítať pomocou počítačového programu.

Každá štandardná vzorka sa duplikuje. Kvantitatívnym kritériom je minimálny počet cyklov PCR potrebných na nástup a rast detekovateľnej fluorescencie. Os x predstavuje počet cyklov; os ordinát predstavuje hodnotu fluorescencie. Koncentrácie DNA sú nepriamo úmerné počtu cyklov potrebných na objavenie sa fluorescencie. Okná v pravom stĺpci (21-32) zobrazujú čísla cyklov pre zodpovedajúce koncentrácie. Rozdiely medzi 10-násobnými koncentráciami fragmentov DNA 102 ^-106 ml sú 3,2-3,4 cyklov. U dvoch pacientov boli koncentrácie fragmentov IS6110 približne 103 ^/ ml a ^{104 /ml. Ak vezmeme doúvahy} počet opakovaní (6-20) analyzovaných fragmentov v genóme Mycobacterium tuberculosis, počet Mycobacterium tuberculosis v klinických vzorkách je približne 100 a 1000 buniek.

Aplikácia PCR v diagnostike tuberkulózy

Metóda PCR sa v najväčšej miere používa na rýchlu diagnostiku tuberkulózy - detekciu Mycobacterium tuberculosis v klinických vzorkách: spúto, bronchiálne výplachy, pleurálny exsudát, moč, mozgovomiechový mok, punkcie osteolýzy, aspiráty ženského genitálneho traktu a rôzne biopsie. V štúdii v Holandsku s približne 500 vzorkami spúta a bronchiálnych výplachov od 340 pacientok s potvrdenou diagnózou pľúcnej tuberkulózy sa skúmala porovnávacia citlivosť metód PCR, kultivačnej a sterovej mikroskopie. Citlivosť analýzy bola 92,6 %, 88,9 % a 52,4 %. Špecificita všetkých metód bola približne 99 %.

Bola porovnaná účinnosť detekcie Mycobacterium tuberculosis pomocou mikroskopie steru, výsevu na médium Lowenstein-Jensen, testovacieho systému VASTES a PCR analýzy. PCR preukázala senzitivitu 74,4 %, mikroskopia - 33,8 %, výsev na pevné médium - 48,9 % a VASTES - 55,8 %. Priemerný čas detekcie pri výseve na médium Lowenstein-Jensen je 24 dní, VASTES - 13 dní, PCR - 1 deň.

Diskutuje sa aj o potenciáli použitia PCR ako citlivej a rýchlej metódy na monitorovanie účinnosti liečby tuberkulózy.

Detekcia DNA Mycobacterium tuberculosis metódou PCR s účinnou chemoterapiou sa stanovuje počas dlhšieho časového obdobia - v priemere 1,7 mesiaca v porovnaní s bakteriálnym vylučovaním stanoveným fluorescenčnou mikroskopiou a 2,5 mesiaca v porovnaní s bakteriologickým vyšetrením.

Diagnostika extrapulmonálnych foriem tuberkulózy

Význam PCR ako citlivej metódy je obzvlášť veľký pre extrapulmonálne formy, pretože práve pri týchto formách sú klinické a rádiologické metódy a tradičné bakteriologické metódy na stanovenie Mycobacterium tuberculosis v diagnostických materiáloch neúčinné.

Pri vyšetrení vzoriek moču boli výsledky PCR analýzy pozitívne u 16 zo 17 pacientov s aktívnou tuberkulózou močového systému a negatívne u 4 pacientov s inaktívnou renálnou tuberkulózou a 39 pacientov s netuberkulóznymi ochoreniami močového systému.

Bola preukázaná účinnosť PCR analýzy pri štúdiu aspirátov kostnej drene u pacientov s horúčkou neznámeho pôvodu s podozrením na tuberkulóznu povahu ochorenia. Na diagnostiku tuberkulóznej lymfadenitídy u detí bolo študovaných 102 punkčných aspirátov a bioptických vzoriek od 67 detí s podozrením na tuberkulóznu lymfadenitídu. Pozitívne výsledky boli získané: pomocou PCR v reálnom čase - 71,6 %, fluorescenčnou mikroskopiou - 46,3 %, kultivačnou štúdiou - 41,8 %. V štúdii 50 biopsií lymfatických uzlín u pacientov s chorobou mačacieho škrabania boli všetky výsledky negatívne. Týmto spôsobom bola preukázaná 100 % špecificita PCR analýzy. V tej istej práci bola preukázaná možnosť detekcie M. avium pri punkčnej biopsii lymfatických uzlín.

Diagnóza tuberkulózy ženských pohlavných orgánov pri neplodnosti je jedným z najťažších diagnostických problémov. Pozitívne výsledky sa dosiahli v PCR štúdiách biopsií endometria, aspirátov endometria a vzoriek tekutiny z Douglasovho vaku u 14 (56 %) z 25 pacientok vyšetrených laparoskopicky s podozrením na tuberkulózu. Mikroskopické vyšetrenie sterom a kultivačné vyšetrenia priniesli 1 a 2 pozitívne výsledky. Tieto prípady boli tiež PCR pozitívne. Väčšina PCR pozitívnych výsledkov bola v prípadoch s charakteristickými znakmi tuberkulózy podľa histologického vyšetrenia; menší počet bol v prípadoch s podozrením na tuberkulózu podľa laparoskopie. Iba jeden pozitívny výsledok PCR bol získaný pri absencii laparoskopických údajov o tuberkulóze.

Pri diagnostikovaní extrapulmonálnych foriem tuberkulózy majú lekári často otázku o možnosti identifikácie patogénu pri vyšetrení vzoriek krvi pomocou metódy PCR. Údaje z literatúry naznačujú, že detekcia DNA Mycobacterium tuberculosis z vzoriek krvi je možná pri pokročilých formách infekcie HIV. DNA Mycobacterium tuberculosis bola detegovaná iba pri generalizovanej tuberkulóze rôznych orgánov u pacientov s transplantovanou obličkou a imunosupresiou.

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

Identifikácia druhov mykobaktérií

Metóda PCR môže byť pomerne účinná na rýchlu identifikáciu mykobaktérií tuberkulózneho komplexu a niektorých typov netuberkulóznych mykobaktérií po dosiahnutí ich primárneho rastu. V tomto prípade môže použitie PCR ušetriť 7-10 dní potrebných na následnú kultivačnú identifikáciu pozitívneho výsledku. PCR štúdia je technicky veľmi jednoduchá, pretože nevyžaduje zložitú prípravu vzorky klinického materiálu na dosiahnutie vysokej citlivosti. Pri skúmaní 80 pozitívnych kultúr v takomto testovacom systéme (MB BacT. od spoločnosti Organon) boli všetky pozitívne výsledky PCR analýzy prísne špecifické a boli vykonané do 1 dňa. Na identifikáciu iných typov mykobaktérií, keď sú získané v kultúre, sa DNA patogénu hybridizuje so špecifickými DNA sondami značenými akridínom a kmene sa detegujú podľa výskytu chemiluminiscencie pomocou chemiluminometra alebo na nitrocelulózových prúžkoch s vizuálnym posúdením po hybridizácii. Táto súprava identifikuje obmedzený počet druhov: Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, M. avium complex, M. kansasii a M. gordonae.

A. Telenti a kol. tiež vyvinuli relatívne jednoduchú a lacnú metódu na druhovú identifikáciu klinicky významných mykobaktérií založenú na PCR a následnom spracovaní dvoma reštrikčnými enzýmami (enzýmy, ktoré majú schopnosť štiepiť molekulu DNA v špecifických bodoch). V tomto prípade sa amplifikuje fragment DNA kódujúci proteín tepelného šoku (65 kDa), po čom sa fragment DNA získaný v PCR s veľkosťou 439 nukleotidových párov spracuje samostatne dvoma enzýmami - Bste II a Nae III. Následne sa pomocou elektroforézy na agarózovom géli analyzujú dva získané produkty, pričom sa určí ich veľkosť (počet nukleotidových párov) pomocou sady štandardných fragmentov DNA (molekulárnych markerov DNA) s dĺžkou od 100 do 1000 nukleotidových párov. V každom z definovaných druhov (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M.fortuitum) sa pre každý reštrikčný enzým nachádzajú 2 alebo 3 fragmenty DNA rôznych veľkostí. Kombinácia výsledných fragmentov DNA rôznych veľkostí umožňuje tieto druhy navzájom odlíšiť.

Vyvíja sa technológia biologických DNA mikročipov, ktorá pomôže identifikovať viac ako 100 druhov mykobaktérií v jednej štúdii.

Identifikáciu druhov je možné vykonať aj pomocou PCR amplifikácie variabilnej oblasti 16S rRNA, po ktorej nasleduje sekvenovanie amplikónov v porovnaní so zodpovedajúcou primárnou štruktúrou, čo umožňuje identifikáciu viac ako 40 druhov mykobaktérií.

PCR sa môže použiť aj na identifikáciu druhov v rámci komplexu tuberculosis mycobacterium, vrátane diferenciácie medzi M. bovis a M. bovis BCG. To sa dosahuje analýzou prítomnosti alebo neprítomnosti určitých génov v genomických oblastiach RD1, RD9 a RD10. RD1 chýba v M. bovis BCG, ale je prítomný u virulentných druhov vrátane M. bovis.

Stanovenie citlivosti Mycobacterium tuberculosis na lieky pomocou PCR

Úlohy molekulárno-genetických metód na stanovenie citlivosti alebo rezistencie Mycobacterium tuberculosis na liečivá sa redukujú na identifikáciu mutácií v určitých nukleotidových sekvenciách známych génov. Hlavné metódy sú založené buď na priamom čítaní (sekvenovaní) týchto sekvencií po amplifikácii, alebo na hybridizácii biotínom značených fragmentov DNA amplifikovaných počas PCR s DNA sondami. Obe možnosti zahŕňajú identifikáciu substitúcií v nukleotidových sekvenciách, ktoré pri použití DNA sond vedú k absencii alebo neúplnej hybridizácii na nitrocelulózovej membráne pomocou enzýmového konjugátu (streptavidín-alkalická fosfatáza) - metóda LIPA-Rif-TB.

Metóda merania fluorescencie v lokálne fixovaných DNA sondách na mikrooblastiach komplementárnych k známym mutáciám v PCR-amplifikovaných génových oblastiach zodpovedných za citlivosť alebo rezistenciu na liečivá sa nazýva metóda mikrobiočipov. Základný algoritmus na vykonanie tejto štúdie je nasledujúci. Po izolácii DNA z klinickej vzorky alebo mykobakteriálnej kultúry sa musí vykonať PCR na amplifikáciu zodpovedajúcich fragmentov génu groB zodpovedného za citlivosť na liečivo na rifampicín alebo génov katG a inhA kódujúcich mykobakteriálne proteíny zodpovedné za citlivosť na izoniazid. Výsledky PCR sa hodnotia pomocou elektroforézy na agarózovom géli, ktorá potvrdzuje príjem zodpovedajúcich fragmentov DNA požadovanej dĺžky. Potom sa vykoná druhé kolo PCR na zavedenie fluorescenčnej značky do DNA. Výsledky PCR sa opäť potvrdia gélovou elektroforézou. Potom sa vykoná hybridizácia (inkubácia cez noc) s následným premytím získaného materiálu na biočipe, čo je veľké množstvo krátkych reťazcov DNA (sond) fixovaných na malej sklenenej platni, komplementárnych k nukleotidovým sekvenciám liekmi citlivého typu tuberkulóznych mykobaktérií v miestach možných mutácií, ako aj k mutantným sekvenciám zodpovedným za rezistenciu na liečivá. Umiestnenie DNA sond na platni je presne definované a na určenie výsledku pomocou špeciálneho čítacieho zariadenia sa stanoví úroveň fluorescencie pozorovanej počas hybridizácie. V tomto ohľade sa výsledky analýzy určujú pomocou špeciálneho počítačového programu.

V posledných rokoch boli vyvinuté alternatívne metódy na stanovenie citlivosti Mycobacterium tuberculosis na lieky založené na technológii PCR v reálnom čase, čo umožňuje vykonávať tieto štúdie v režime uzavretej skúmavky.

Obrázok 13-13 zobrazuje výsledok analýzy klinických kultúr Mycobacterium tuberculosis pri stanovení rezistencie na rifampicín pomocou real-time PCR: 218 - kontrolná vzorka (citlivá na rifampicín); 93 - pozitívna kontrola pre mutáciu Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - pozitívna kontrola pre mutáciu Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - experimentálne vzorky. Výsledok výpočtu kinetických kriviek amplifikácie pre 4 kanály: kanál 1: 393 - pozitívna kontrola pre mutáciu Ser-Trp TCG-TGG; kanál 2: 4482 - pozitívna kontrola pre mutáciu Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - experimentálne vzorky; kanál 4: kinetické krivky amplifikácie všetkých vzoriek zúčastnených na experimente. Pozitívna kontrola amplifikačnej reakcie. Závery: Analýza odhalila nasledujúce mutácie, ktoré určujú rezistenciu na rifampicín: vo vzorkách 162, 163, 172, 295 - Ser-Leu TCG-TTG. Rovnaký princíp bol použitý na stanovenie rezistencie na izoniazid pomocou génov katG a inhA, ktoré určujú najčastejšie mutácie.

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

Identifikácia kmeňa Mycobacterium tuberculosis

Najštudovanejšou metódou identifikácie kmeňa Mycobacterium tuberculosis je technológia nazývaná polymorfizmus dĺžky reštrikčných fragmentov (RFLP), ktorá je založená na fragmentácii (restrikcii) DNA Mycobacterium tuberculosis enzýmom Pvu II a následnej hybridizácii získaných fragmentov s určitými špecifickými sekvenciami na DNA jej opakujúceho sa prvku IS6110. Vnútrodruhová variabilita sa dosahuje vďaka rôznemu počtu opakovaní IS6110 a ich umiestneniu na DNA, ako aj rôznorodosti vzdialeností medzi určitými bodmi útoku reštrikčného enzýmu (reštrikčnými miestami) a prvkom IS6110. Táto technológia je veľmi zložitá a prácna. Po ošetrení DNA izolovanej z kultúry mykobaktérií tuberculosis reštrikčným enzýmom sa vykoná gélová elektroforéza, potom sa fragmenty DNA rôznych dĺžok prenesú na nitrocelulózovú membránu, hybridizujú sa s fragmentmi prvku IS6110 a výsledky sa detegujú pomocou enzymatickej reakcie. Výsledný špecifický pásový vzor charakterizuje DNA špecifického kmeňa mykobaktérií tuberculosis. Počítačová analýza odhaľuje identitu alebo príbuznosť kmeňov. Napriek tomu, že metóda RFLP je najdiskriminačnejšia, t. j. odhaľuje najväčší počet rozdielov v analyzovaných kmeňoch, je neúčinná s malým počtom (menej ako 5) opakovaní IS6110, ktoré boli pozorované u niektorých kmeňov. Obrázky 13-14 znázorňujú výsledky RFLP typizácie kmeňov.

Alternatívou môže byť metóda spoligotypizácie - analýza polymorfizmu medzerových sekvencií DNA - medziľahlých medzi priamymi opakovaniami oblasti DR. Pri spoligotypizácii kmeňov sa PCR vykonáva s primermi obmedzujúcimi oblasť DR, po ktorých sa tvoria fragmenty rôznych dĺžok, ktoré hybridizujú s variabilnými medziľahlými oblasťami DNA. Analýza medzerových sekvencií oblasti DR sa podľa výskumníkov javí ako jednoduchšia, produktívnejšia a vhodnejšia na primárny skríning kmeňov a predbežnú epidemiologickú analýzu, ako aj na priame štúdium klinického materiálu.

Je zrejmé, že efektívnejšou a technologicky dostupnejšou metódou je VNTR (skratka anglických slov) alebo metóda určenia variabilného počtu presných tandemových opakovaní v DNA Mycobacterium tuberculosis. Táto metóda je založená iba na použití PCR a nevyžaduje ďalšie manipulácie. Keďže počet tandemových opakovaní v rôznych kmeňoch a v rôznych lokusoch je odlišný, na výslednom elektroforegrame PCR produktov sa určujú a analyzujú fragmenty rôznych veľkostí. Podľa výskumníkov sa pomocou VNTR dosahuje vyšší stupeň diskriminácie kmeňov ako pri metóde RFLP.

V posledných rokoch sa venovala veľká pozornosť šíreniu kmeňov Mycobacterium tuberculosis z čeľade W-Beijing (niekedy nazývaných pekinský kmeň), ktoré sú do značnej miery rezistentné voči liekom.

Základné požiadavky na kvalitu molekulárno-biologického výskumu

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

Hlavné regulačné dokumenty pre vykonávanie PCR

Vyhlášky Ministerstva zdravotníctva Ruskej federácie: č. 45 zo 7. 2. 2000; č. 109 z 21. 3. 2003; č. 64 z 21. 2. 2000. Pokyny: 1.3.1888-04 „Organizácia práce počas PCR výskumu materiálu infikovaného patogénnymi biologickými agensmi skupín patogenity III-IV“; 1.3.1794-03 „Organizácia práce počas PCR výskumu materiálu infikovaného mikroorganizmami skupín patogenity I-II“. 2003; 3.5.5.1034-01 „Dezinfekcia testovaného materiálu infikovaného baktériami skupín patogenity I-IV pri práci metódou PCR“, 2001. Dodatok 11 k Pokynom o jednotných metódach mikrobiologického výskumu pri detekcii, diagnostike a liečbe tuberkulózy.

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

Zamestnanci

Molekulárne biologické štúdie môžu vykonávať lekári klinickej laboratórnej diagnostiky, bakteriológovia, virológovia, biológovia klinickej diagnostiky a laboratórií, ako aj špecialisti so stredoškolským lekárskym vzdelaním, ktorí absolvovali špecializáciu a ďalšie vzdelávanie stanoveným spôsobom.

Usporiadanie laboratórnych priestorov

Vyžaduje sa nasledujúce laboratórne vybavenie:

• Priestor na spracovanie vzoriek - laboratórium prispôsobené na prácu s infekčnými agensmi skupín patogenity III-IV v súlade s Metodickými pokynmi 13.1888-04.
• Priestorom na prípravu PCR reakčných zmesí je laboratórna miestnosť, ktorá poskytuje ochranu pred vnútornou kontamináciou laboratória – „čistá“ oblasť.
• • Ak sa na analýzu produktov PCR používa elektroforéza alebo hybridizácia, laboratórna miestnosť, v ktorej sa amplifikované fragmenty DNA extrahujú z amplifikačnej skúmavky a podľa toho sa môžu dostať do životného prostredia, musí byť v súlade s požiadavkami pre PCR laboratóriá (Metodické pokyny 1.3.1794-03, Metodické pokyny 1.3.1888-04) úplne izolovaná od miestností uvedených v predchádzajúcich odsekoch. Pohyb akéhokoľvek personálu, vybavenia, akýchkoľvek materiálov a predmetov z priestoru elektroforézy do priestoru spracovania vzoriek a „čistého“ priestoru, ako aj prenos vzduchu cez vetrací systém alebo v dôsledku prievanu, musí byť vylúčený. Táto oblasť nie je potrebná na fluorimetrickú detekciu produktov PCR.
• Miestnosť na dokumentáciu a spracovanie výsledkov je vybavená počítačmi a potrebným kancelárskym vybavením. Táto miestnosť môže obsahovať zariadenia, ktoré zabezpečujú detekciu PCR produktov bez otvorenia skúmavky. - fluorescenčné PCR detektory a termocyklery pre PCR v reálnom čase.

Hygienické a epidemiologické požiadavky na primárne spracovanie spúta sú podobné štandardným mikrobiologickým požiadavkám na prácu s Mycobacterium tuberculosis.

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

Kompletná sada laboratórneho vybavenia pre PCR diagnostiku

Laboratórna súprava obsahuje vybavenie pre nasledujúce miestnosti.

• miestnosť na prípravu vzoriek obsahuje nasledujúce vybavenie: laminárny digestor triedy ochrany II „SP-1.2“: polovodičový termostat s vyhrievaným vekom pre skúmavky Eppendorf; mikrocentrifúga pri 13 000 ot./min; centrifúga („Vortex“); chladnička s teplotným rozsahom od -20 ^° C do +10 ^° C; pipety s variabilným objemom série „Proline“; čerpadlo s odchytovou bankou OM-1; stojan na pipety; stojan na pracovnú stanicu 200x0,5 ml; stojan na pracovnú stanicu 50x1,5 ml; stojany na uloženie skúmaviek 80x1,5 ml;
• miestnosť na prípravu reakčnej zmesi: ochranná komora PCR box („Laminar-C. 110 cm); centrifúga „Vortex“; pipety s variabilným objemom série „Proline“; stojan na pipety; stojan na pracovnú stanicu 200x0,2 ml; stojany na uloženie skúmaviek 80x1,5 ml; chladnička s teplotným rozsahom od -20 ^° C do +10 ^° C;
• Elektroforetická miestnosť: horizontálna elektroforetická komora; zdroj energie; transiluminátor;
• DNA zosilňovač alebo analyzátor nukleových kyselín (real-time PCR) s počítačom a softvérom; možno umiestniť v akejkoľvek dostupnej miestnosti. Ak sa používa technológia real-time PCR, nie je potrebná elektroforézna miestnosť.

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

Externá kontrola kvality

Aby sa zabezpečilo získanie objektívne spoľahlivých výsledkov, laboratóriá sa musia zúčastňovať systému externého hodnotenia kvality laboratórneho výskumu.

Účastníci systému kontroly kvality dostanú: 12 ampuliek s lyofilizovanými suspenziami bakteriálnych buniek, z ktorých dve obsahujú E. coli, 3 ampulky s tuberkulóznymi mykobaktériami (avirulentný kmeň) v koncentrácii 10² ^/ ml; 3 ampulky s bunkami podobného kmeňa v koncentrácii 10² ^/ ml; 2 ampulky s netuberkulóznymi mykobaktériami M. avium-intracellulare a M. kansasii v koncentrácii 10³ ^/ ml.

Testy zasielané na externé hodnotenie kvality sú predbežne testované v dvoch nezávislých laboratóriách s rozsiahlymi skúsenosťami v tejto oblasti.

[ 85 ], [ 86 ]