Laboratórna diagnostika tuberkulózy

Tuberkulóza je choroba, ktorú možno ľahko diagnostikovať v moderných podmienkach a vedeckých úspechoch. Laboratórna diagnostika tuberkulózy je ústredná pre iné diagnostické metódy, druhá len pre röntgenové metódy výskumu.

[1], [2], [3], [4],

Klinický krvný test

U pacientov s tuberkulózou nie sú zmeny vo všeobecnej analýze krvi patognomické. S ohľadom na obmedzené a inaktívnych foriem tuberkulózy hypochromia charakteristiku erytrocytov v normálne množstvo. Keď masívne infiltráty alebo kazeózna pneumónie, zatiaľ čo prevalencia kazeózna lymfadenitída špecifických črevných lézií, rovnako ako pre veľké pľúcne alebo pooperačného krvácania a poznámka erythropenia mikrocytózy, oligohromaziyu, polihromaziyu. Makrocytóza, a ešte poikilocytóza oveľa vzácnejšie, zvyčajne s ťažkou anémiou. Počet retikulocytov v kroku tuberkulózy kompenzovaná v rozmedzí od 0,1 do 0,6%, s subcompensated - od 0,6 do 1,0% a 1% je charakterizovaná dekompenzovaných retikulocytov.

Keď tuberkulóza v niektorých prípadoch môže byť mierny leukocytóza (až 15 tisíc leukocytov.), Menej žiarenia, ktoré sa vyskytujú v 2-7% pacientov s obmedzenými a ľahko foriem procesu sa vyskytujúce a v 12,5% - deštruktívne a progresívne pľúcnej tuberkulózy ,

Najčastejšie posuny sa vyskytujú vo vzorci leukocytov. Označte relatívnu a absolútnu neutrofiliu, mierny posun leukocytového vzorca doľava pred promyelocytmi. Myelocyty sú veľmi zriedkavé v prípade nekomplikovanej tuberkulózy. Zvýšenie počtu neutrofilov s abnormálne zrna u pacientov krvného obrazu TB vždy udáva dĺžku procesu: u pacientov s ťažkou tuberkulózou takmer všetky neutrofily obsahujú abnormálne obilia. Po skončení vypuknutia tuberkulózy sa jadrový posun pomerne rýchlo približuje normálu. Patologická granularita neutrofilov zvyčajne pretrváva dlhšie ako iné zmeny na hemograme.

Obsah eozinofilov v periférnej krvi sa tiež líši v závislosti od fázy procesu a alergického stavu organizmu. Ich počet sa znižuje až do aneozinofiliya na ťažkú a dlhodobú ohniská nákazy a naopak sa zvyšuje, ako sa resorpcia infiltrátmi a pleurálny výpotok, ako aj skoré formy primárnej tuberkulózy.

Väčšina foriem primárnej tuberkulózy sprevádza lymfopénia, ktorá sa niekedy pozoruje už niekoľko rokov, dokonca aj po zjazvení špecifických zmien. Sekundárna tuberkulóza vo fáze exacerbácie môže v závislosti od závažnosti procesu sprevádzať buď normálny počet lymfocytov, alebo lymfopénia.

To zaujíma osobitné miesto určujúci rýchlosť sedimentácie erytrocytov Ďalšie testy pre vyhodnotenie tuberkulóznej proces (ESR), ktorý má hodnotu v hodnotení procesu tuberkulózy toku a identifikáciu jeho aktívnej formy. Zvýšenie ESR indikuje prítomnosť patologického procesu (infekčné protizápalové, hnisavé septický, hemoblastózy, Hodgkinovho a kol.), A svedčí o jeho závažnosti, ale normálne hladiny ESR nie vždy ukazujú neprítomnosť patológie. Zrýchlenie sedimentácie erytrocytov je uľahčené zvýšením obsahu globulínov, fibrinogénu, cholesterolu v krvi a zníženia viskozity krvi. Spomalenie sedimentácie erytrocytov je charakteristické pre stavy spojené s hemokoncentráciou, zvýšenie obsahu albumínov a žlčových kyselín.

Hemogram u pacientov s tuberkulózou sa mení počas liečby. Hematologické posuny zmiznú rýchlejšie, čím úspešnejšia je terapeutická intervencia. Treba však mať na pamäti vplyv rôznych antibakteriálnych liekov na hemopoézu. Často spôsobujú eozinofíliu, v niektorých prípadoch leukocytózu a častejšiu leukopéniu až po agranulocytózu a reakciu lymfoidného retikulárneho systému. Systémová hematologická kontrola a správna analýza získaných údajov sú nevyhnutné pre posúdenie klinického stavu pacienta, dynamiky procesu a účinnosti liečby.

[5], [6], [7], [8], [9],

Klinická analýza moču

Pri tuberkulóze močového systému je analýza moču hlavnou laboratórnou diagnostickou metódou. Môžete pozorovať leukocyturia, erytrocytúria, proteinúriu, hypoizostenúriu, tuberkulózu mykobaktériu, nešpecifickú bakteriúriu.

Leukocytúria - najčastejším príznakom tuberkulózy močového systému pred chemoterapiou a neexistuje žiadna špecifická len vo výnimočných prípadoch, ako je napríklad kompletná obliteráciu lumen močovodu. Nechyporenko test (stanovenie počtu leukocytov v 1 ml moču) pomáha objektívnejšie posúdiť stupeň leukocytúria nefrotuberkuloze s, a v niektorých prípadoch ju určiť normálnu vyšetrenie moču. Musí sa však brať do úvahy, že sa môže vyskytnúť leukocytúria pri akútnej a chronickej pyelonefritíde, cystitíde, uretritíde, obličkách a močovodoch.

Eritrotsiturii. Ako aj leukocyturia. Sú považované za jeden z najčastejších laboratórnych príznakov tuberkulózy močovej sústavy. Frekvencia hematúrie závisí od rozšírenia procesu, zvyšuje sa v dôsledku vývoja deštruktívnej tuberkulózy v obličkách. Erytrocytúria bez leukocytúrie je typickejšia v počiatočných štádiách tuberkulózy obličiek. Hematúria, ktorá prevažuje nad leukocytúriou, je dôležitým argumentom v prospech tuberkulózy obličiek v jej diferenciácii s nešpecifickou pyelonefritídou.

[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16],

Biochemický krvný test

Pri tuberkulóze závisia zmeny v niektorých biochemických parametroch predovšetkým od fázy procesu, komplikácií a rôznych sprievodných ochorení. U pacientov s inaktívnou tuberkulózou pľúc a iných orgánov sa celkové proteínové a proteínové frakcie krvného séra nezmenili a určili ich normálny obsah.

Pri akútnych formách ochorenia, ako aj pri exacerbácii a progresii chronických foriem tuberkulózy sa znižuje koeficient albumín-globulín.

Esenciálne v posúdení funkčného stavu organického poškodenia a pečene u tuberkulózy a jej komplikácií je stanovenie celkového sérového a priameho bilirubínu, AST (ACT), alanínaminotransferázy (ALT). Dynamické stanovenie hladiny aminotransferáz. Bilirubínu pri liečbe pacientov s tuberkulózou, najmä v ťažkých formách, je povinnou zložkou biochemického vyšetrenia pacientov s tuberkulózou a vykonáva sa raz mesačne.

Hodnotenie funkčného stavu obličiek zahŕňa stanovenie sérového kreatinínu a výpočet rýchlosti glomerulárnej filtrácie podľa vzorca Cockcroft-Gault. Výpočet rýchlosti glomerulárnej filtrácie pomocou Reberovej vzorky poskytuje menej presné výsledky.

Hlavným cieľom dynamických biochemických štúdií pacientov s tuberkulózou je sledovanie priebehu procesu, včasná detekcia vedľajších účinkov liekov a adekvátna korekcia výsledných homeostatických porúch.

[17], [18], [19]

Aplikácia biochemických metód vyšetrenia pri extrapulmonárnej tuberkulóze

Najvýznamnejším ukazovateľom je obsah kyseliny tuberkulostearovej v biologických kvapalinách, ale jeho definícia súvisí s technickými ťažkosťami (potreba plynovej chromatografie a hmotnostnej spektrometrie).

Potenciálne meranie aktivity adenozín deaminázy - enzýmu určeného v kvapalinách: synoviálna, perikardiálna, ascitická alebo spinálna. Hlavnými výrobcami adenozín deaminázy sú lymfocyty a monocyty. Stanovenie adenozín deamináza aktivity v biologických tekutinách uľahčuje diagnózu tuberkulóznej synovitída, tuberkulóza lymfatických uzlín, tuberkulózne meningitídy, tuberkulózne serozity.

Niektoré biochemické indikátory kvôli ich nespecificite sa určujú iba v biologických tekutinách, ktoré sú blízko k zameraniu lézií. Zmerajte úroveň indikátorov ako reakciu na subkutánnu alebo intradermálnu injekciu tuberkulínu (zvyčajne pred a 48 a 72 hodín po nej). Potom sa vypočíta stupeň zvýšenia úrovne markerov (v%) vzhľadom na počiatočnú úroveň.

Optimálne stanovenie aktivity orgánovo špecifického enzýmu transamidázy v moči, ktorého výskyt sa zaznamená, keď sú ovplyvnené obličky rôznej povahy. Štúdium transamidázy je odôvodnené len za podmienok subkutánnej injekcie tuberkulínu, aby sa exacerboval lokálny zápalový proces. Určite aktivitu transamidínu v moči na začiatku a 24-72 hodín po zavedení 50 TE tuberkulínu. Rozšírenie fermentácie dvakrát a viac umožňuje v 82% prípadov rozlíšiť aktívnu tuberkulózu obličiek od exacerbácie chronickej pyelonefritídy.

Pri tuberkulóze ženských pohlavných orgánov sa v podmienkach provokatického tuberkulínového testu určujú koncentrácie haptoglobínu a malónového dialdehydu v krvi. Subkutánne injikovaný tuberkulín v dávke 50 TE a po 72 hodinách vykonal druhú biochemickú štúdiu. V prípade etiológie tuberkulózy nie je stupeň zvýšenia hladiny haptoglobínu nižší ako 28% a úroveň malondialdehydu je 39% alebo viac. Určuje sa aj aktivita adenozín deaminázy v peritoneálnej tekutine získanej z priestoru Douglas. Prúžok sa znovu preskúma 72 hodín po intradermálnej injekcii tuberkulínu v dávkach 0,1 TE a 0,01 TE do projekcie vnútorných pohlavných orgánov na prednej brušnej stene. V prospech tuberkulózneho procesu je zvýšenie aktivity adenozín deaminázy o 10% alebo viac v porovnaní s pôvodnou.

Keď je postihnuté oko, skúma sa ohniská reakcia, ktorá sa vyskytuje v oku v reakcii na antigénnu stimuláciu. Je nežiaduce vyvinúť výraznú odpoveď sprevádzanú znížením vizuálnych funkcií. Vzhľadom k tomu, hodnotenie minimálna ohniskových účinkov sú často ťažké odporučiť uzavretie objektivizácie je orientovaná rovnobežne s, a na stupni zvýšenie sérového haptoglobín, alebo adenozín deamináza.

Všetky biochemické štúdie by sa mali vykonať v spojení s inými metódami.

[20], [21], [22], [23],

Výskum v systéme zrážania krvi

Význam stave výskumu tohto systému zrážania krvi TBC je spôsobená prítomnosťou radu pacientov s pľúcnou tuberkulózy hemoptýzou alebo pľúcne krvácanie, rovnako ako hemokoagulačných komplikácií v chirurgickej liečbe tuberkulózy. Navyše latentný tok intravaskulárnej hemokoagulácie, ktorý prirodzene sprevádza tuberkulózu, ovplyvňuje priebeh ochorenia a účinnosť chemoterapie.

U pacientov s pľúcnou TBC prevalencia exsudatívne zápaly zložky dochádza k poklesu krvného antikoagulačnej aktivity. U pacientov s nízkou prevalenciou konkrétne lézií v pľúcach s prevahou produktívny hemokoagulácie intravaskulárnej zápalovú zložkou mierne exprimovaný. U pacientov s pľúcnou tuberkulózy s hemoptysis a pľúcneho krvácania štátneho systému zrážania krvi sa líši: u pacientov s nízkou stratou krvi vo výške gemoptoe alebo bezprostredne po jeho skončení je k prudkému nárastu v krvnej koagulačnej schopnosti v dôsledku závažnej intenzifikácii trombinoobrazovaniya pri zachovaní zvýšenej "konštrukčná" zrážanie krvi. U pacientov s masívnou straty krvi pozorované zníženie zrážanlivosti potenciál na úkor zníženie koncentrácie fibrinogénu. Aktivita faktora XIII, počet krvných doštičiek. Vo fáze chirurgickej liečby u pacientov s obmedzenými formami pľúcnej tuberkulózy s významnými porušeniu dochádza systém homeostázu. Pacienti s rozšíreným spôsobom pri výkone pnevmon- alebo plevropnevmonektomii často vyvinúť DIC, ktorá môže mať podobu "druhého choroby."

Pre sledovanie stavu zrážanie krvi u pacientov s pľúcnou tuberkulóza by malo byť vykonané stanovenie aktivovaného parciálneho tromboplastínového času (aPTT), fibrinogén, trombín, čas, index protrombínového a času krvácania a čas zrážania.

[24], [25], [26], [27], [28]

Hormonálny výskum

Moderné experimentálne a klinické pozorovania naznačujú prítomnosť zmien v hormonálnom stave v špecifickom tuberkulóznom zápal pľúc. Je dokázané, že korekcia dysfunkciou hypofýzy, nadobličiek, hypofýzy, štítnej žľazy systémov a pankreatické funkcie v spojení s anti-TB terapia prispievať k aktivácii fibrogeneze a opravy v určitom zápalu lokuse.

Funkčný stav hypofýzy, štítnej žľazy systému sa hodnotí podľa obsahu v krvnom sére trijodtyroninu (T ₃ ), tyroxín (T ₄ ), hypofýzy hormón stimulujúci štítnu žľazu (TSH). Bolo zistené, že subklinického hypotyreóza je detekovaná v 38-45% pacientov s pľúcnou tuberkulózy, a najčastejšie je diagnostikovaný s rozšírenou a Fibre-kavernózna formy procesu. Za rovnakých foriem väčšina výrazne zníženej hladiny ako T ₃ a T ₄, a tam je nerovnováha týchto hormónov vo forme zvýšenia pomeru T ₄ / T _s.

Adrenokortikálna funkcia je hodnotená z úrovne kortizolu v krvnom sére, a endokrinné funkcie pankreasu - koncentrácie imuno-reaktívne inzulínu. V akútnej fáze infekčného ochorenia sa zvyšuje potreba endogénneho kortizolu a inzulínu. Hyperinzulinémia tiež svedčí o inzulínovej rezistencii telesných tkanív, ktorá je typická pre akýkoľvek aktívny zápalový proces, obzvlášť špecifický. Stanovenie funkcie glukokortikoidov nadobličiek s aktívnou pľúcnou tuberkulózou umožňuje pre väčšinu pacientov odhaliť prítomnosť hyperkorticizie. Normálne hladiny kortizolu koncentrácia v krvi u pacienta s infekčného zápalu, v akútnej fáze je potrebné považovať za relatívna zlyhanie glukokortikoidy funkcie kôry nadobličiek, ktorý môže slúžiť ako základ pre držanie dávky adekvátne substitúcie glukokortikoidov.

Takmer tretina pacientov s pľúcnou tuberkulózou môže zistiť, že hladina inzulínémie v nich je dosť nízka a približuje sa k dolnej hranici normy, zatiaľ čo 13-20% pozoruje významný hyperinzulinizmus. Relatívny hypo- a hyperinzulinizmus sú vysokými rizikovými faktormi pre vývoj porúch metabolizmu sacharidov v rôznych stupňoch. Tieto zmeny funkčnej aktivity B buniek pankreasu vyžadujú pravidelné monitorovanie glykémie u pacientov s tuberkulózou a včasnú prevenciu diabetes mellitus. Okrem toho. To slúži ako dodatočné zdôvodnenie účelnosti použitia fyziologických dávok inzulínu pri komplexnej terapii tuberkulózy.

Všeobecne platí, že nižšie hladiny hormónov štítnej žľazy a ich nerovnováhy hypercortisolemia a hyperinzulinismus najväčší dosah u pacientov s ťažším priebehom tuberkulóznej proces, s rozsiahlym poškodením pľúc a závažné príznaky tuberkulózy intoxikácie.

Mikrobiologická diagnostika tuberkulózy

Mikrobiologické štúdie sú potrebné na identifikáciu pacientov s tuberkulózou, overenie diagnózy, monitorovanie a korekciu chemoterapia hodnotiacich liečebný výsledok, inými slovami, pretože zápis tuberkulózy pacienta pred vybratím z registra.

Všetky epidemiologické programy a projekty sú založené na hodnotení počtu bakteriálnych exkretorov, ktoré sa nedajú vykonať bez použitia laboratórnych metód na detekciu tuberkulózy mykobaktérií. V prieskume tzv. Neorganizovanej populácie percento bakteriálnych útočníkov dosahuje 70 alebo viac, čo spôsobuje, že laboratórne metódy sú dostatočne efektívnym prostriedkom identifikácie pacientov s tuberkulózou v tejto populácii.

Tradičné mikrobiologické metódy na diagnostiku tuberkulózy sú bakterioskopické a kultúrne štúdie. Moderné metódy zvažujú kultiváciu mycobacterium tuberculosis v automatizovaných systémoch, nastavenie PCR. Všetky tieto metódy sa však nevyhnutne spájajú s klasickými bakteriologickými metódami.

Zbierka diagnostického materiálu

Účinnosť laboratórnych štúdií závisí vo veľkej miere od kvality diagnostického materiálu. Dodržiavanie pravidiel pre zber, skladovanie a prepravu diagnostického materiálu a presná implementácia algoritmu posudzovania pacienta priamo ovplyvňuje výsledok a zabezpečuje biologickú bezpečnosť.

Na testovanie tuberkulózy sa používa množstvo materiálov. Vzhľadom na to, že TB logkih- najbežnejšia forma tuberkulóznymi lézie je základným materiálom pre výskum považovať spúta a iných druhov oddeliteľnou Tracheobronchiálny: sekrécia horných dýchacích ciest, získané po inhalácii aerosólov: bronchiálna premývanie; bronchoalveolárne oplachy; materiál získaný bronchoskopia, a intrapulmonární transtracheální biopsia z bronchiálnych vdychovanie, hrtanu sterov, exsudáty z rany a stery al.

Účinnosť výskumu sa zvyšuje, ak sa vykonáva kontrolovaná zbierka materiálu od pacienta. Na tento účel je pridelená špeciálne vybavená miestnosť alebo zakúpené špeciálne kabíny. Zhromažďovanie materiálu je nebezpečným postupom, preto je potrebné zbierať materiál na výskum, dodržiavať pravidlá infekčnej bezpečnosti.

Materiál na testovanie na mycobacterium tuberculosis sa zhromažďuje v sterilných fľašiach s tesne naskrutkovanými uzávermi, aby sa zabránilo kontaminácii životného prostredia a chránený materiál pred kontamináciou.

Lahvičky na odber diagnostického materiálu musia spĺňať nasledujúce požiadavky:

• musia byť vyrobené z materiálu odolného voči nárazom;
• by sa mali ľahko roztaviť počas autoklávovania;
• dostatočný objem (40 - 50 ml):
• mať široký otvor na zber spúta (priemer najmenej 30 mm);
• ľahko manipulovateľné, priehľadné alebo priesvitné, aby ste mohli posúdiť množstvo a kvalitu odobratej vzorky bez otvorenia veka.

Na dosiahnutie optimálnych výsledkov výskumu je potrebné dodržať nasledujúce podmienky:

• Zozbierajte materiál pred začiatkom chemoterapie;
• materiál na štúdium sa musí zhromaždiť pred ranným príjmom potravín a liekov;
• pre výskum je žiaduce zhromaždiť aspoň 3 vzorky ranného hlienu. Zozbierajte spút po dobu troch po sebe idúcich dní;
• zozbieraný materiál musí byť čo najskôr dodaný do laboratória:
• v prípade, že je okamžite nemožné dodať materiál do laboratória, je uskladnený v chladničke pri teplote vzduchu 4 ° C najviac 48 hodín;
• Pri preprave materiálu je potrebné pozorne sledovať integritu liekoviek.

Správne zozbieraný spút je mukózny alebo mukopurulantný. Optimálny objem testovaného spúta je 3-5 ml.

Spúta sa zhromažďuje pod dohľadom lekára. Osoby zodpovedné za zber spúta by mali nasledovať implementáciu určitých pravidiel:

• je potrebné pacientovi vysvetliť účel štúdie a potrebu vykašliavať nie slín alebo nasofaryngeálny hlien, ale obsah hlbokého dýchacieho traktu. To sa dá dosiahnuť v dôsledku produktívneho kašľa, ku ktorému dochádza po niekoľkých (2 - 3) hlbokých nádychoch. Treba tiež upozorniť pacienta, že musí najprv vypláchnuť ústa prevarenou vodou, aby sa odstránila väčšina živoriť ústnej mikroflóry a zvyšky jedla, ktoré bránia hlien;
• zdravotnícky pracovník, ktorý sa podieľa na zbere spúta, musí okrem županu a klobúka nosiť masku, gumené rukavice a gumovú zástera;
• stojaci za pacientom sa odporúča, aby fľašu udržal čo najbližšie k jeho perám a hneď sa oddelí do hlienu, pretože kašľa a musí byť zabezpečené, že tok vzduchu je odvádzaný od zdravotníckeho pracovníka:
• Po dokončení zberu spúta by zdravotnícky pracovník starostlivo uzavrel injekčnú liekovku viečkom a zhodnotil množstvo a kvalitu zozbieraného spúta. Potom je fľaša označená a umiestnená do špeciálnej nádoby na prepravu do laboratória.

Alebo aplikovať dráždi inhaláciou pomocou zariadenia, inštalované v miestnosti zbierať - v prípade, že pacient nemá pred skoro ráno v deň odberu materiálu potrebného mu dať vykašliavanie:. Výťažok získavaný z koreňov marshmallow (mukaltin), bromhexínu, ambroxol, atď. Produkujú hlien, noc spútum. Zozbieraný materiál nie je predmetom ochrany a mal by sa skontrolovať v deň zberu. Aby sa zabránilo jeho "utratenie" v laboratóriu v smere by mal mať osobitnú známku.

Ak sa v tomto zariadení nevykonajú mikrobiologické štúdie, zozbieraný diagnostický materiál by mal byť centrálne dodaný do laboratória za predpokladu, že sa materiál zachováva v intervaloch medzi dodávkami v chladničke alebo konzervačnými prostriedkami. Dodajte materiál do laboratória v prepravných boxoch, ktoré sa dajú ľahko dezinfikovať. Každá vzorka by mala byť vybavená príslušným štítkom a celá dávka by mala byť vyplnená sprievodným formulárom.

[29], [30], [31],

Spôsoby a frekvencia vyšetrenia pacientov

Pri počiatočnom takzvanom diagnostickom vyšetrení pacienta na tuberkulózu je potrebné vyšetriť aspoň 3 časti spúta po dobu 2 až 3 dní. Zozbierané pod dohľadom zdravotníckeho personálu, čo zvyšuje účinnosť mikroskopu.

Primárne skríningy tuberkulózy by mali vykonávať všetky lekárske diagnostické inštitúcie systému zdravotnej starostlivosti. Nedávno boli na základe klinických diagnostických laboratórií zorganizované tzv. Centrá mikroskopu vybavené modernými mikroskopmi a zariadeniami na epidemiologickú bezpečnosť, aby sa zlepšila účinnosť počiatočného vyšetrenia.

V zariadeniach proti tuberkulóze sa používa skríningový test, ktorý zahŕňa vyšetrenie na spúte alebo iný diagnostický materiál najmenej trikrát počas 3 dní. Počas liečby sa mikrobiologické štúdie vykonávajú pravidelne aspoň raz mesačne počas intenzívnej fázy chemoterapie. Pri prechode na fázu liečby sa štúdie vykonávajú menej často - s intervalom 2-3 mesiacov, zatiaľ čo frekvencia štúdie sa zníži na dve.

Vlastnosti zbierky diagnostického materiálu pre extrapulmonárnu tuberkulózu

Feature patologický materiál s mimopľúcna formy tuberkulózy - Mycobacterium tuberculosis nízkej koncentrácii v ňom, čo vyžaduje viac citlivé spôsoby mikrobiologických štúdií, a to predovšetkým na sejacie techniky médiu.

Pri tuberkulóze močovej sústavy je moč najdostupnejším študijným materiálom. Zber moču by mal vykonávať špeciálne vyškolená sestra.

Externé genitálie sa premyjú vodou mydlom alebo slabým roztokom manganistanu draselného. Vonkajší otvor močovej rúry je starostlivo ošetrený. V sterilnej liekovke sa zhromažďuje priemerná časť ranného moču: u mužov prirodzene u žien s použitím katétra. Moč z obličkovej panvy sa zhromažďuje v sterilných skúmavkách s katetrizáciou jednej alebo dvoch obličiek, v druhom prípade - nutne oddelene od každej obličky. Malé množstvo tejto moče sa centrifuguje, sediment sa skúma.

U mužov, spermií, bodkovaných semien je tajomstvo prostaty podrobené odstredeniu, aby sa získala zrazenina. Pri akejkoľvek lokalizácii špecifického procesu v genitálnej oblasti u mužov môže masáž prostaty podporiť sekréciu sekrécií obsahujúcich mycobacterium tuberculosis.

Menštruačná krv u žien sa zhromažďuje odsávaním alebo použitím krytu Kafka. Získaný materiál sa zbaví červených krviniek, premyje sa destilovanou vodou a potom sa centrifuguje. Precipitát sa skúma.

Pridelenia z cervikálneho kanálika maternice sa zhromažďujú v niektorých kapacitách Kafka alebo v uzávere, to znamená, že je žiaduce akumulovať 1-2 ml patologického materiálu.

Materiál získaný z operatívnych zákrokov na obličkách, pohlavných orgánoch. S biopsiami, šrotmi z endometria, homogenizovať. K tomu je umiestnený v sterilnej malte a dôkladne rozdrvený sterilnými nožnicami. K tejto suspenzii bol pridaný sterilný riečneho piesku v množstve, ktoré zodpovedá jeho hmotnosti, a potom doplniť s 0,5-1.0 ml izotonického roztoku chloridu sodného a všetko sa rozotrie až pastovitej hmoty s prídavkom izotonického roztoku chloridu sodného (4-5 ml). Potom sa hmotnosť nechá usadiť 1 až 1,5 minúty, supernatant sa skúma.

Tuberkulóza kostí a kĺbov. Punkta (hnis z abscesov) získaná so sterilnou striekačkou sa umiestni do sterilných misiek a ihneď sa do laboratória vloží. Sterilná pipeta, ktorá bola predtým navlhčená sterilným izotonickým roztokom chloridu sodného, vezme 2-5 ml hnisu, prenesie sa do fľaše s guľôčkami a pridá sa ďalších 2 až 3 ml izotonického roztoku chloridu sodného. Fľaša je uzatvorená korokom a pretrepávaná v žiarovkovom prístroji počas 8 až 10 minút. Homogenizovaná suspenzia sa skúma.

V fistulóznych formách osteoartikulárnej tuberkulózy sa odoberá hnis z fistuly. Veľký výtok sa zhromažďuje priamo do skúmavky. V prípadoch, štíhle pyorrhea fistuly premyje sterilným fyziologickým roztokom, a po premytí boli zhromaždené do skúmavky, alebo kus tampónu impregnovaného hnisom zaslané na analýzu.

Chirurgický materiál, získaný v priebehu chirurgického zákroku na kosti a kĺby sa môžu skladať z hnisavé-nekrotických hmôt, granuláciou, jazvy, kostného tkaniva synoviálnych membránach a iných substrátov. Jeho liečba sa vykonáva tak ako pri tuberkulóze obličiek.

Mikrobiologické vyšetrenie synoviálnej tekutiny v 3% roztoku citrátu sodného (pomer 1: 1) na prevenciu koagulácie sa uskutoční okamžite po punkcii.

Tuberkulóza lymfatických uzlín. Odhaľuje sa aj hnis, extrahovaný počas punkcie lymfatických uzlín. Ako hnis z abscesov. Tkanivá lymfatických uzlín získané počas chirurgických zákrokov, biopsie, sa skúmajú rovnako ako u iných foriem tuberkulózy.

Štúdia o hmotnosti stolice na mycobacterium tuberculosis je extrémne zriedkavá kvôli takmer úplnému nedostatku pozitívnych výsledkov.

[32], [33], [34], [35], [36],

Mycobacterium microscopy

Sputová mikroskopia je pomerne rýchla, jednoduchá a lacná metóda, ktorá sa má použiť vo všetkých prípadoch s podozrením na tuberkulózu. Okrem toho sa táto štúdia uskutočňuje s cieľom vyhodnotiť účinnosť chemoterapie a zistiť, či nie je použitý žiadny kultúrny test.

Používajú sa dve metódy mikroskopického vyšetrenia:

• metóda priamej mikroskopie, keď sa preparát pripravuje priamo z diagnostického materiálu;
• metóda mikroskopie sedimentu pripraveného z materiálu ošetreného dekontaminantom pre kultúru.

Prvá metóda sa používa v laboratóriách, kde sa vykonávajú len mikroskopické štúdie (klinické a diagnostické laboratóriá všeobecnej zdravotníckej siete).

Najlepšie výsledky mikroskopického vyšetrenia sa získajú koncentráciou diagnostického materiálu (napríklad centrifugáciou).

Na detekciu mykobakteriálnej tuberkulózy s pravdepodobnosťou 50% pri vykonávaní mikroskopie by malo 1 ml spúta obsahovať viac ako 5000 mikrobiálnych buniek. Sputum pacientov s pľúcnymi formami tuberkulózy zvyčajne obsahuje významné množstvo kyselinovzdorných baktérií, čo im umožňuje spoľahlivo zistiť pomocou bakterioskopie. Diagnostická citlivosť tejto metódy sa môže zlepšiť vyšetrením niekoľkých vzoriek spúta od jedného pacienta. Negatívny výsledok bakterioskopického vyšetrenia nevylučuje diagnózu tuberkulózy, pretože niektoré pacientky majú v spúte menej mykobaktérií, ako je možné zistiť pomocou mikroskopie. Nesprávna príprava rozteru spúta môže tiež spôsobiť negatívny výsledok bakterioskopického vyšetrenia.

Najčastejšou metódou na detekciu kyslých rýchlych mykobaktérií v nátere je farba podľa Tsiol-Nelsena. Spôsob je založený na penetrácii karbolického fuchsinu do mikrobiálnej bunky cez membránu, ktorá obsahuje vrstvu voskovitých lipidov za súčasného zahrievania a silného leptania fenolu. Následné sfarbenie náteru s 25% roztokom kyseliny sírovej alebo 3% kyseliny chlorovodíkovej vedie k odfarbeniu všetkých nekyslo-rýchlych štruktúr. Zafarbené prvky náteru sú farbené 0,3% roztokom metylénovej modrej. Mykobaktérie neberú obyčajné anilínové farby, čo má za následok acidorezistentné bacily sú sfarbené karmínovo červenú farbu, a iné choroboplodné zárodky a bunkové elementy - modro.

Pre náteroch zafarbených Ziehl-Nelsen pomocou svetelného binokulárneho mikroskopu s olejovým objektívom (90- alebo 100-násobné zvýšenie) a okulárom na zväčšenie 7- alebo 10-násobné. Preskúmajte 100 zorných polí, čo stačí na identifikáciu jednotlivých mykobaktérií v škvrnám. V prípade, že výsledok takejto štúdie je negatívny, na potvrdenie sa odporúča zobraziť ďalších 200 zorných polí. Zaznamenajte výsledky a uveďte počet zistených kyslých rýchlych bacilov (KUM).

Okrem tejto techniky sa na luminiscenčnú mikroskopiu používajú aj farebné farbivá, ktoré umožňujú dosiahnuť najlepšie výsledky. Použitie tejto metódy zvyšuje účinnosť mikroskopu o 10-15%. Pri liečbe mykobaktérií luminiscenčnými farbivami (auramín, rodamín atď.) Sa tieto látky tiež viažu na voskovité štruktúry mikrobiálnej bunky. Pri ožarovaní farebných buniek s vzrušujúcim svetelným zdrojom (určité spektrum ultrafialového žiarenia) začínajú svietiť oranžovým alebo jasne červeným svetlom na čiernom alebo tmavozelenom pozadí. Vďaka vysokému jasu a kontrastu viditeľného obrazu môže byť celkové zväčšenie mikroskopu znížené 4 až 10 krát, zorné pole sa rozširuje a čas strávený sledovaním liečiva klesá. Spolu s tým, vzhľadom na oveľa väčšiu hĺbku poľa, môžete zvýšiť pohodlie štúdie.

Ak sa použije fluorescenčná mikroskopia na zobrazenie rovnakej oblasti, roztieranie vynakladá výrazne menej času ako pri svetelnej mikroskopii farbenia Tsiol-Nelsen. Ak za jeden pracovný deň mikroskop skúma asi 20 až 25 takýchto škvŕn, potom pomocou fluorescenčnej mikroskopie môže skúmať viac ako 60-80 vzoriek súčasne. Skúsení mikroskopisti vedia, že sfarbenie buniek so zmesou auramínu a rodamínu je nejakým spôsobom špecifické pre kyselinovzdorné bacily, ktoré v tomto prípade vyzerajú ako zlaté tyčinky. Saprofyty sú maľované nazelenalou farbou.

Ďalšou dôležitou výhodou spôsobu fluorescenčné mikroskopia - schopnosť detekovať zmenené Mycobacterium, stratil pod vplyvom nepriaznivých faktorov, vrátane intenzívny chemoterapia, kislotousotoychivosti majetku a v súvislosti s týmto farbením Ziehl-Nelsen nie je detekovaný.

Nevýhody metódy fluorescenčnej mikroskopie zahŕňajú relatívne vysoké náklady na mikroskop a jeho prevádzku. Avšak v centralizovaných alebo iných veľkých laboratóriách, kde zaťaženie presahuje normu 3 laboratórnych technikov pracujúcich s tromi bežnými mikroskopmi, je lacnejšie použiť namiesto toho jeden fluorescenčný mikroskop.

Bakterioskopické metódy majú pomerne vysokú špecifickosť (89 - 100%). Približne 97% pozitívnych výsledkov získaných akoukoľvek mikroskopickou metódou jednoznačne potvrdzuje výsledky siatia.

Treba poznamenať, že pri mikroskopickom vyšetrení náteru patologického materiálu nie je možné určiť druhy patriace identifikovaným kyslým rýchlym mykobaktériám. Spôsob mikroskopia umožňuje, aby sa vyjadril iba na prítomnosti alebo neprítomnosti kyseliny v príprave mikroorganizmov, čo sa dá vysvetliť existenciou v prírode z veľkého počtu morfologicky podobné tuberkulózou mykobaktérií komplexné mikroorganizmov rezistentných kyselín nontubercular.

Výsledky mikroskopie sa vyhodnocujú v semikvantitatívnych jednotkách.

Aby sme mohli porovnať výsledky rôznych metód mikroskopie, predstavíme empirické koeficienty. Napríklad, porovnať výsledky náteroch zafarbených s fluorescenčnými farbivami, dáta výskum svetelný mikroskop (1000 násobné zväčšenie), je nutné rozdeliť počet acidorezistentné bacily detekovaná fluorescenčným mikroskopom, zodpovedajúce koeficient pri 250-násobnom zväčšení, - až 10, 450-krát - na 4, 630-krát - na 2.

Vlastnosti mikroskopie pre extrapulmonárnu tuberkulózu

Vykoná sa priama mikroskopia, ako aj mikroskopia škvŕn pripravených po obohatení, po ktorých nasleduje farbenie Tsiol-Nelsen alebo luminiscenčné farbivá. Priama mikroskopia škvŕn je neúčinná kvôli nízkej koncentrácii mykobaktérií v materiáli, a preto je racionálnejšie používať metódy obohacovania. Najefektívnejšie je odstreďovanie. V prípade, že biologický materiál je viskózny, centrifugácia sa nanáša súčasným skvapalňovanie a homogenizácia materiálu, ktorý sa vykonáva za použitia vysokorýchlostných odstrediviek s odstredivou silou 3000 g a roztoky chlórnanu. Iné spôsoby obohacovania, ako napríklad mikro flotácia, sa v súčasnosti nepoužívajú z dôvodu tvorby biologicky nebezpečných aerosólov.

[37], [38],

Kultúrna metóda diagnostiky tuberkulózy

Spôsob výsevu alebo metóda kultivácie je citlivejšia ako mikroskopia na rozmazanie a má niekoľko výhod oproti zmrzlinovej mikroskopii. Umožňuje zistiť niekoľko desiatok životaschopných mykobaktérií v testovacom materiáli a má veľkú diagnostickú hodnotu. To je obzvlášť dôležité pri skúmaní materiálu od novodiagnostikovaných alebo liečených pacientov, ktorí uvoľňujú malé množstvo mykobaktérií.

V porovnaní s mikroskopom umožňuje výskum v oblasti kultúry zvýšenie počtu pacientov s TBC diagnostikovaných o viac ako 15-25%, ako aj overenie tuberkulózy v skorších štádiách, keď je choroba stále liečebná. Veľmi dôležitou výhodou kultivačného testu je možnosť získať kultúru excitátora, ktorá môže byť identifikovaná a študovaná s ohľadom na citlivosť na liek, virulenciu a iné biologické vlastnosti.

Nevýhody spôsobov kultivácie zahŕňajú ich trvanie (čakacia doba materiálov dosahuje 10 týždňov). Vyššie náklady, zložitosť spracovania diagnostického materiálu.

Princípy predbežnej liečby diagnostického materiálu

Bežné mikrobiologické metódy sa nemôžu použiť pri uskutočňovaní štúdií o tuberkulóze. Je to kvôli tomu. že mycobacterium tuberculosis rastie veľmi pomaly a väčšina klinických vzoriek obsahuje rýchlo rastúce pyogénne a hnilobné mikroorganizmy, huby. Ich rýchly rast na bohatých živných médiách zasahuje do vývoja mykobaktérií a neumožňuje izoláciu pôvodcu tuberkulózy, takže diagnostický materiál musí byť pred zaočkovaním predbežne ošetrený. Navyše mykobaktérie uvoľnené z dýchacích ciest pacienta sú zvyčajne obklopené veľkým množstvom hlienu, čo znemožňuje ich koncentráciu. V tomto ohľade, pred výsadbou spúta a iných podobných materiálov, ich skvapalnením, je potrebná dekontaminácia.

Všetky detergenty a dekontamíny majú viac alebo menej výrazný toxický účinok na mykobaktérie. V dôsledku spracovania môže umierať až 90% mykobaktérií. Pre udržanie dostatočného množstva mykobakteriálne populácie, šetriace potrebu použitia techník spracovania, ktoré umožňujú, na jednej strane, k potlačeniu rýchlo rastúce pyogénne baktérie a skazený, a na druhej strane - aby sa zachovala životaschopnosť mykobaktérií prítomných v materiáli.

V závislosti od materiálu, jeho stupeň homogenity a znečistenia pre predspracovanie pomocou rôznych dekontaminačné: spútum - 4% roztoku hydroxidu sodného, roztoky trohzameschonnogo fosforečnan sodný 10%, benzalkóniumchlorid, fosforečnan sodný, Nalco-NaOH (N-acetyl-L-cysteínu hydroxidu sodného) v konečnej koncentrácii 1% roztoku hydroxidu sodného, v moči a iných kvapalných látok - roztoku kyseliny sírovej 3%, pre kontaminované vzorky, materiály obsahujúce tuk - roztok kyseliny šťavelovej, pričom sa 5%. Okrem toho sa v niektorých prípadoch používajú enzýmy, povrchovo aktívne látky (detergenty). Aplikačné Tween detergenty a iné mykobakteriálna smrť sprevádza menej bunkách (40-50% prežiť). Môžu sa však použiť iba na kvapalné materiály. Najväčšou distribúciou na svete bola NALC-NaOH. Vyrobené v súpravách. Táto metóda umožňuje vyčleniť viac ako 85% populácie mykobakteriálnych buniek. Dekontaminačné tkanesoderzhaschih pevné látky ťažšie odhadnúť, pretože stupeň disperzie materiálu počas homogenizácie ťažké. Napríklad biopsia liečba lymfatických uzlín je často sprevádzaná zvýšenou frekvenciou kontaminácie cudzími flóry. V tomto prípade sa môže použiť 1% etonia.

Nehomogénny materiál sa homogenizuje so sklenenými guľôčkami v prítomnosti dekontaminujúcich látok. Kvapalné materiály sa predcentrifugujú a spracuje sa len zrazenina.

Techniky výsevu a inkubácie

Po predbežnom spracovaní sa materiál centrifuguje, čím sa zrážajú mykobaktérie a zvyšuje ich obsah v sedimente ("obohatenie kalu"). Výsledná zrazenina sa neutralizuje a inokuluje (zaočkuje sa) hustým živným médiom alebo skúmavkami s kvapalným (semikvapalným) médiom. Zo zvyšku sedimentu sa pripravia škvrny na mikroskopické vyšetrenie. Technológia očkovania by mala zabrániť krížovej kontaminácii diagnostického materiálu.

Pre spoľahlivú klinickú interpretáciu výsledkov mikrobiologickej štúdie sa musí dodržať nasledovné pravidlo: mikroskopické štúdie a štúdie o kultúre sa musia vykonať paralelne z tej istej vzorky diagnostického materiálu.

Inokulované trubice sa umiestnia do termostatu pri teplote 37 ^° C počas 2 dní v horizontálnej polohe. Tým sa zabezpečí rovnomernejšia absorpcia materiálu do kultivačného média. Po 2 dňoch sa skúmavky prenesú do vertikálnej polohy a hermeticky utesnia gumovými alebo silikónovými zátkami, aby sa zabránilo vysychaniu zasiateho média.

Plodiny sa inkubujú pri 37 ° C ^o C počas 10-12 týždňov s pravidelným týždenným zobrazenia. Pre každý náhľad sú zaznamenané nasledujúce parametre:

• obdobie vizuálne pozorované odo dňa výsevu;
• miera rastu (počet CFU);
• kontamináciu plodiny vonkajšou mikrobiálnou flórou alebo hubami (takéto rúrky sa odstránia);
• nedostatok viditeľného rastu. Rúrky zostanú v termostate, až kým sa neskončí ďalší pohľad.

Živné médiá

Na kultiváciu mykobaktérií sa používajú rôzne živné médiá; hustá, polotekutá, tekutá. Avšak žiadne známe živné médium nemá vlastnosti, ktoré zabezpečujú rast všetkých mykobakteriálnych buniek. V súvislosti s tým sa odporúča používať 2-3 živné médiá rôzneho zloženia, aby sa zvýšila ich účinnosť.

WHO odporúča prostredie Levenstein-Jensen ako štandardné médium na primárnu izoláciu pôvodcu tuberkulózy a na určenie jej citlivosti na liek. Toto je husté vaječné prostredie, na ktorom sa rast mykobaktérií dosiahne 20. Až 25. Deň po naočkovaní bakterioskopicky pozitívneho materiálu. Plodiny bakterioskopicky negatívneho materiálu vyžadujú dlhšiu inkubačnú dobu (do 10-12 týždňov).

V našej krajine navrhovaná E.R. Finské vaječné prostredie Finn-II. To sa líši tým, že namiesto L-asparagínu používa glutamát sodný, ktorý spúšťa iné spôsoby syntézy aminokyselín mykobaktérií. Rast sa objavuje na tomto médiu o niečo skôr a frekvencia rozdelenia mykobaktérií je o 6-8% vyššia ako v médiu Lowenstein-Jensen.

Na zlepšenie účinnosti bakteriologickej diagnostiky extrapulmonálnej tuberkulózy je vhodné zahrnúť modifikované médium Finn-II do komplexu živných médií. Na urýchlenie rastu sa dodatočne pridáva do živného média Finn-II tioglykolát sodný 0,05%, ktorý znižuje koncentráciu kyslíka. Pre ochranu enzýmu z Mycobacterium systémov toxických produktov peroxidácie lipidov v živnom médiu Finn-II podávať antioxidačné α-tokoferol acetátu v koncentrácii 0,001 ug / ml. Zaočkovanie diagnostického materiálu sa uskutočňuje štandardným postupom.

V ruských laboratóriách proti tuberkulóze sa používajú iné modifikácie hustých živín; navrhol G.G. Mordovské živné médium "nové", vyvinuté V.A. Anické živné média A-6 a A-9 atď.

Vzhľadom k tomu, že v procese chemoterapie je poškodenie na rôzne metabolické systémy mikrobiálnych buniek, niektoré mykobakteriálne populácie stráca schopnosť vyvinúť normálne v bežnom živnom médiu a vyžaduje osmoticky vyvážené (alebo polotekutej) kultivačného média.

Posúdenie a zaznamenávanie výsledkov diagnostiky očkovacích látok

Niektoré kmene a druhy mykobaktérií rastú pomaly, rast sa môže objaviť až do 90. Dňa. Počet takýchto plodín je malý, ale umožňuje to odolávať plodinám v termostate na 2,5-3 mesiacov.

Virulentné kultúry mycobacterium tuberculosis obvykle rastú v prostredí s hustým vajíčkom vo forme R-kolónií rôznych veľkostí a druhov. Kolónie suché, vrásčité, slonovinovo, mierne pigmentované. V iných médiách môže byť kolónia mycobacterium tuberculosis vlhšia. Po ukončení chemoterapie alebo počas liečby sa môžu priradiť hladké kolónie s vlhkým rastom (S-formy).

Pri izolácii plodín sa používa súbor špeciálnych štúdií na rozlíšenie mycobacterium tuberculosis od netuberkulóznych mykobaktérií a kyselinovzdorných saprofytov.

Pozitívna odpoveď je poskytnutá po povinnom mikroskopickom vyšetrení zafarbených odtieňov Tsiol-Nelsen z pestovaných kolónií. V prípade rastu mykobaktérií v nátere detekovať jasne červenej tyčinky ležiace jednotlivo alebo v skupinách, tvoriť zhluky vo forme plsti alebo opletenie. U mladých kultúrach, najmä izolovaných z dlhodobej liečby pacientov s chemoterapiou, mykobaktérie líšia exprimovaný polymorfizmus, až prítomnosti tyče v tvare, spolu s krátkymi, takmer kokovitý alebo predĺžených verzií, ktoré sa podobajú mycélium.

Rýchlosť rastu mykobaktérií je indikovaná nasledujúcou schémou: (+) - 1-20 cfu in vitro (málo vylučované baktérie); (++) - 20-100 CFU in vitro (mierne vylučovanie baktériami); (+++) -> 100 CFU in vitro (bohaté vylučovanie baktériami). Pri laboratórnej diagnostike tuberkulózy nestačí odpovedať, či je mykobaktérium detegované jednou alebo inou metódou. Mať podrobné pochopenie rozsahu a charakteru mykobakteriálnej populácie, jej zloženia a vlastností. Práve tieto údaje nám umožňujú správne interpretovať stav procesu, plánovať taktiku a včas upravovať liečbu.

V posledných rokoch bolo navrhnuté urýchliť rast mykobaktérií, navrhli sa živné médiá na báze agaru s rôznymi rastovými prísadami a použitie špeciálnej zmesi plynov. Na získanie rastu mykobaktérií na týchto médiách počas kultivácie vzniká atmosféra s vysokým obsahom oxidu uhličitého (4-7%). Na tento účel sa používajú špeciálne inkubátory CO ₂. Avšak najrozvinutejšie automatizované systémy na kultiváciu mykobaktérií: MGIT-BACTEC-960 a MB / Bact.

Jeden takýto systém - MGIT systém (rast mykobaktérií označujúce trúbka), ktorý sa odvoláva na vývoj špičkových technológií a je určený pre rýchlu bakteriologickú diagnostiku tuberkulózy a Mycobacterium náchylnosti k prvej línie liekov, a niektoré lieky druhého radu. MGIT je zameraný na použitie ako súčasť zariadenia VASTES-960. Mikroorganizmy sa kultivujú v špeciálnych skúmavkách s kvapalným živným médiom založeným na modifikovanom médiu Middlebrook-7H9. Na stimuláciu rastu mykobaktérií a potlačenie rastu vonkajšej mikroflóry sa používa MGIT rastový doplnok a zmes antibakteriálnych liečiv PANTA.

Rast mikroorganizmov sa zaznamenáva opticky. Je založená na fluorescencii, ku ktorej dochádza pri spotrebovaní kyslíka mykobaktériami počas rastu. Fluorescenčné farbivo závislé od kyslíka sa nachádza na dne špeciálnej skúmavky a je pokryté vrstvou silikónu. Reprodukcia mykobaktérie vedie k zníženiu množstva kyslíka v trubici a zníženie koncentrácie, ktorá spôsobuje zvýšenie fluorescencie, ktorá sa stáva viditeľný za ožarovanie ultrafialovým svetlom rúrky a automaticky registrovaný fotosenzor vstavaný spotrebič VASTES-960. Intenzita luminiscencie sa zaznamenáva v jednotkách rastu (jednotky GU-rastu). Údaje o raste sa zaznamenávajú v počítači, kde sa dajú automaticky uložiť. Počítačová analýza rastových kriviek môže poskytnúť informácie o prítomnosti rôznych Mycobacterium bazénov, vrátane nontubercular, a tiež pomáha vyhodnotiť vlastnosti rastu mykobaktérií.

V dôsledku doby výskytu takýchto systémov mykobakteriálne rast sa výrazne znižuje, v priemere 11 dní VASTES-960 a 19 dni na MB / Bacto na 33 dní na štandardnom pevnom živnom médiu. Treba poznamenať, že tieto systémy vyžadujú vysoko kvalifikovaný personál. Očkovacie materiál pre kvapalné médiá bude vyvedený sejbou na Lowenstein-Jensen médiá, hrajú úlohu záskok v prípadoch, keď iné nosiče Mycobacterium tuberculosis nedovoľujú rásť.

[39], [40], [41], [42], [43], [44],

Stanovenie citlivosti mykobaktérií na liečivo

Stanovenie spektra a stupňa citlivosti mykobaktérií na lieky proti tuberkulóze má veľký klinický význam, ako aj epidemiologické hodnotenie šírenia tuberkulózy s rezistenciou na liek. Okrem toho monitorovanie rezistencie voči liekom umožňuje posúdiť účinnosť programu tuberkulózy ako celku a je neoddeliteľným ukazovateľom účinnosti všetkých zložiek činností proti tuberkulóze.

Viacnásobnosť a načasovanie citlivosti na liek:

• pred začiatkom liečby raz na určenie stratégie a taktiky liečby:
• ak sú izolované z chorých kultúr z rôznych materiálov (spút, tekutina BAL, moč, výpotky, tekutina atď.), všetky izolované kmene sa skúmajú:
• na konci intenzívnej fázy liečby bez klinickej a rádiologickej dynamiky:
• ak je potrebné zmeniť režim liečby v nasledujúcich prípadoch:
  • neprítomnosť nánosu spúta;
  • reizolácia kultúry po negatívnom štiepení na spúte;
  • drastické zvýšenie počtu CMB v tampóne po prvom poklese. Je dobre známe, že kmene mycobacterium tuberculosis, ktoré sú heterogénne z hľadiska citlivosti na liek, sú izolované z materiálu od pacienta s tuberkulózou. Citlivosť kmeňov na lieky proti tuberkulóze sa môže líšiť v spektre liekov, stupňa, frekvencie a miery výskytu rezistencie.

Stupeň liekovej rezistencie Mycobacterium tuberculosis bola stanovená v súlade so stanovenými kritériami, ktoré sú zamerané na klinický význam a stabilita závisí od aktivity anti-TB lieku, jeho farmakokinetiku, koncentrácia v léziu. Maximálna terapeutická dávka atď.

Stanovenie citlivosti mykobaktérií na liečivo sa v súčasnosti vykonáva mikrobiologickými metódami:

• Absolútne koncentrácie (metóda riedenia na hustom alebo kvapalnom živnom médiu),
• proporcie,
• koeficient odporu.

Obvykle stabilita prejavuje vizuálne pozorovateľný rast kolónií Mycobacterium tuberculosis, ale existujú techniky, ktoré indukujú skorá štádia rastu v deliacich sa bunkách Mycobacterium vo forme farebnej reakcie. Tieto metódy skracujú čas od 3 do 4 týždňov.

Ako je zjednotená v Rusku bola predĺžená, odporúča chemoterapia metódou WHO výboru absolútnych koncentrácií, čo je z metodického hľadiska, je najjednoduchšie, ale vyžaduje vysokú presnosť a štandardizácie laboratórnych postupov. Test na citlivosť na liek pozostáva zo súboru skúmaviek so živným médiom modifikovaným anti-TB liekmi. Súprava sa skladá z 2-3 rúrok s rôznymi koncentráciami každého z liečiv používa, jedna riadiace rúrky bez lieku na životné prostredie a jedna skúmavka obsahujúca 1000 mcg / ml sodného Sali tsilovokislogo alebo 500 ug / ml paranitrobenzoynoy kyselina nontubercular pre detekciu rastu mykobaktérií.

Na prípravu sady médií s prípravkami sa použije modifikované médium Levenstein-Jensen (bez škrobu), ktoré sa naleje do baniek. V každej banke sa pridá špecifický objem vhodného zriedenia antituberkulózneho prípravku. Obsah banky sa dôkladne premieša, vleje sa do skúmaviek a skladá sa v naklonenej polohe počas 40 minút pri teplote 85 ° C. Odporúča sa, aby sa médium stočilo v elektrickom revízore s automatickou reguláciou teploty. V stredu s drogami proti TBC

1. Séria sa môže skladovať v chladničke pri 2-4 ° C počas 1 mesiaca, pričom prípravky druhého radu - nie viac ako 2 týždne. Skladovanie médií s prípravkami pri izbovej teplote je neprijateľné. Pri príprave roztokov liekov proti tuberkulóze sa berie do úvahy ich aktivita, výpočet koncentrácie upravenej na základe molekulovej hmotnosti nešpecifickej časti prípravku, čistoty atď. Na stanovenie citlivosti na liek sa používajú iba chemicky čisté látky.

Princípom metódy je určenie koncentrácie antituberkulózneho liečiva, ktoré inhibuje rast významnej časti mykobakteriálnej populácie. Ak sa to urobí správne, má táto metóda dobrú spoľahlivosť.

Pred testom je potrebné dbať na to, aby izolovaná kultúra mycobacterium tuberculosis neobsahovala ďalšiu mikroflóru. Z kultúry mykobaktérií v 0,9% roztoku chloridu sodného sa pripraví homogénna suspenzia obsahujúca 500 miliónov mikrobiálnych teliesok na ml (štandard optickej zákalu 5 jednotiek). Výsledná kaša sa zriedi 0,9% roztokom chloridu sodného (1:10) a 0,2 ml suspenzie sa pridá do každej skúmavky sady kultivačného média. Očkované Skúmavky boli umiestnené do inkubátora pri teplote 37 ° C a udržiava sa vo vodorovnej polohe po dobu 2-3 dní na šikmej ploche médiá boli rovnomerne naočkujú suspenziou Mycobacterium tuberculosis. Skúmavky sa potom prenesú do zvislej polohy a inkubujú sa 3-4 týždne. Výsledky sa zaznamenávajú po 3-4 týždňoch.

Vzhľadom k tomu, načasovanie uvoľňovanie látky z klinického materiálu na živnom médiu tvorí najmenej 1-1,5 mesiaca liekovej citlivosti môžu byť získané týmto spôsobom, je nie skôr ako po 2-2,5 mesiaca po očkovacieho materiálu. Toto je jedna z hlavných nevýhod tejto metódy.

Interpretujte výsledky stanovenia citlivosti mykobaktérií na lieky na základe určitých kritérií. Na pevnom kultivačnom médiu sa za citlivé na koncentráciu lieku, ktorý je obsiahnutý v médiu, v prípade, že počet kolónií mykobaktérií pestovaných in vitro s týmto liečivom nečiní viac než 20 s bohatým rastom v kontrolnej skúmavky bez liečiva. Iba v prítomnosti viac ako 20 kolónií je kultúra považovaná za odolnú voči tejto koncentrácii. V praxi pri získaní výsledkov rastu v skúmavkách blízke 20 cfu. Je potrebné oznámiť klinickej jednotke, že citlivosť alebo rezistencia je v tomto prípade hraničná, pretože niekedy môže vysvetliť fuzzy dynamiku klinických indikátorov.

Pri rôznych liečivách sa stanovuje určitá koncentrácia, pri ktorej sa pozoruje reprodukcia kritického podielu mykobakteriálnej populácie. Tieto koncentrácie sa nazývajú "kritické". Ako kritérium stability sa používa rast populácie mykobaktérií na živnom médiu s prípravkom v kritickej koncentrácii.

V domácej praxi TB pri určovaní rezistencie voči lieku nie sú obmedzené len na určenie len kritických koncentrácií. Je to kvôli tomu. že rozšírená úroveň definície liekovej rezistencie umožňuje lekár presnejšie polohy taktiku chemoterapie s použitím znalosti potenciácia účinku liekových kombinácií, krížom krážom očakávaný odpor alebo použiť účinnejšie lieky skupina použitá anti-TB liečivami.

Metóda absolútnej koncentrácie je najjednoduchšia, ale je aj najcitlivejšia na chyby, ktoré sa robia pri jej vykonávaní. Spoľahlivejšie, najmä pri určovaní citlivosti na lieky druhej línie a spoločné mimo Ruska je metóda proporcií. Zohľadňuje nedostatky metódy absolútnych koncentrácií, ale pri vykonávaní je viac namáhavé.

Metóda je veľmi podobná metóde absolútnej koncentrácie. Príprava skúmaviek s liekmi sa vykonáva rovnakým spôsobom. Ako v metóde absolútnej koncentrácie. Avšak dávka semien suspenzie mykobaktériovej tuberkulózy sa zníži o faktor 10. Ktorý eliminuje frekvenciu spontánnej rezistencie niektorých kmeňov mycobacterium tuberculosis na také liečivá ako Etambutol, protionamid, kapreomycín. Ako kontrola sa použili 2 alebo 3 skúmavky s rovnakou dávkou osiva v skúmavkách, postupne zriedené 10 a 100 krát. Kritériom stability je podiel vizuálne pozorovaného rastu mycobacterium tuberculosis. V prípade liekov 1. Série je kritériom stability prebytok rastu 1% počiatočnej populácie, pre lieky druhého radu - zvýšenie o 1 alebo viac ako 10% počiatočného, v závislosti od zvolenej kritickej koncentrácie.

V roku 1997 pracovná skupina Svetovej zdravotníckej organizácie a Medzinárodnej únie pre identifikáciu dobré tuberkulózy odporu TB drogy urobil úpravy týchto kritérií, ktoré ponúkajú za rezistentné mykobaktérie, ktoré nerastú na pevný vaječný médiá Lowenstein-Jensen v nasledujúcich koncentráciách:

• dihydrostreptomycín - 4 μg / ml;
• izoniazid 0,2 μg / ml:
• rifampicín 40 μg / ml:
• Ethambutol - 2 μg / ml.

V roku 2001 boli navrhnuté kritické koncentrácie pre nasledujúce lieky druhej línie (pre kritický podiel 1%):

• capreomycín - 40 μg / ml;
• protionamid - 40 mcg / ml;
• kanamycín - 30 μg / ml;
• viomycín - 30 μg / ml;
• cykloserín 40 μg / ml;
• kyselina aminosalicylová - 0,5 μg / ml;
• ofloxacínu - 2 μg / ml.

Výsledky rastu sa hodnotia po 4 týždňoch ako predbežná a po 6 týždňoch kultivácie - ako posledná.

Na stanovenie citlivosti na liek na pyrazínamid, ktorý sa v súčasnej chemoterapii používa pri tuberkulóze, odporúčaná kritická koncentrácia je 200 μg / ml. Avšak doteraz neexistuje všeobecne akceptovaná metóda na stanovenie rezistencie voči tomuto lieku na tuhé živné médium, pretože jeho antibakteriálna aktivita sa prejavuje iba v kyslom prostredí (pH <6), ktoré je technicky ťažké udržať. Navyše mnohé klinické kultúry tuberkulózy mykobaktérií neochotne rastú v prostredí vajec v kyslom prostredí.

Pre hodnotenie kvality výsledkov liek testovanie citlivosti Mycobacterium, odporúča, aby každá nová várka strednej LJ ovládať paralelný stanovenie citlivosti štandardné múzea kmeňa H37Rv. Okrem toho existujú určité mikrobiologické kritériá, ktoré musia byť zachované tak, aby tieto techniky dali dobre reprodukovateľný a správne interpretovaný výsledok. Medzi ne patrí životaschopnosť kultúry Mycobacterium tuberculosis, pravidlá pre získanie homogénna suspenzia a suspenzné kultúry výberových pravidiel Mycobacterium tuberculosis, reprezentatívnosti vybraného bakteriálne hmoty. Spoľahlivosť stanovenia rezistencie voči lieku sa znižuje pri mimoriadne obmedzenom uvoľnení baktérií.

Nedávno sa považuje za sľubný spôsob stanovenia citlivosti na liek pomocou automatizovaných systémov. Najlepšie v tejto oblasti sú vývojové riešenia založené na technológii VASTES MGIT-960. V tomto prípade sa citlivosť na mykobaktériu tuberkulózy stanovuje na základe modifikovanej metódy proporcií. V procese stanovenia sa porovnáva rýchlosť rastu mykobaktériovej tuberkulózy v kontrolnej skúmavke av skúmavkách s liekmi. Na stanovenie citlivosti na streptomycín sa používajú izoniazid, rifamp-picin a etambutol, doplnky na obohacovanie a antibiotiká zahrnuté v súprave SIRE. Na stanovenie citlivosti na pyrazínamid použite súpravu PZA. V priebehu Skúška suspenzie Mycobacterium tuberculosis naočkujú skúmavky s liekmi, ako aj kontrolných obrazoviek s rekonštituovanú suspenziou 100x pre všetky lieky okrem pyrazínamid, kde suspenzia je riedenie 10x. Kritériom stability je indikátor rastu mykobaktérií 100 GU, keď je rast dosiahnutý v kontrolnej skúmavke 400 GU (viď "Metódy kultivácie pre izoláciu mykobaktérií"). Účtovanie a interpretácia výsledkov sa vykonáva automaticky a sú nastavené vstupom alebo zvoleným programom.

Ako kritické koncentrácie sa konečné koncentrácie použijú v skúmavke s kvapalným živným médiom. V súčasnej dobe boli vyvinuté kritické koncentrácie pre liek prvej i druhej línie. Treba poznamenať, že citlivosť mykobaktérií tuberkulózy na cykloserín a kyselinu aminosalicylovú sa určuje len na živnom médiu.

Komplikované pracovný protokol popísaný systém umožňuje študovať citlivosti voči liečivám ako vyhradené kultúry (hustá živnom médiu), a pomocou primárneho Mycobacterium MGIT-rast in vitro. Druhá možnosť významne znižuje čas na kultúru, ktorá vám umožní získať úplné výsledky kultúry Mycobacterium tuberculosis (vrátane informácií o citlivosti na lieky) po 3 týždňoch od dátumu odberu materiálu, zatiaľ čo tradičné metóda je možné získať len tretí mesiac. Časom získané výsledky, keď je pacient v intenzívnej fáze liečby, môžu kompenzovať relatívne vysoké náklady na výskum.

[45], [46], [47], [48], [49], [50], [51],

Diferenciácia mykobaktérií

Berúc do úvahy, že použité živné médiá nie sú prísne selektívne. Následná diferenciácia izolovaných mykobaktérií sa považuje za povinnú. Potreba diferenciáciu mykobaktérií je vzhľadom na množstvo vlastností patologických procesov spôsobených rodu: odlišný priebeh a výsledok tuberkulózy a mykobakteriózy, prítomnosť rezistencie prírodné liečivá pre niektoré anti-TB liečivami.

Je známe, že primárna identifikácia Mycobacterium komplexu M. Tuberculosis nontubercular z mykobaktérií sa vykonáva pomocou nasledujúcich charakteristík: rýchlosť rastu na pevných živných médií, pigmentácie, morfológie kolónií, za prítomnosti kyslého rezistencie a teploty optimálny rast.

Súčasnosti neexistuje jediná metóda laboratórne spoľahlivo rozlíšiť komplexu M. Tuberculosis mykobaktérie z iných acidorezistentné bacily, však kombinácia vlastností popísaných vyššie s výsledkami uvedenými ďalej z radu biochemických testov umožňuje identifikáciu Mycobacterium tuberculosis komplex s M. Pravdepodobné, že 95%.

Pre odlíšenie Mycobacterium komplexu M. Tuberculosis (M. Tuberculosis, M. Bovis, M. BovisBCG, M. Africanum, M. MicroTech, M. Canettii a ďalšie) z pomaly rastúce mykobaktérie použité nontubercular základné biochemické testy, ktoré detekujú prítomnosť nasledujúcich príznakov:

• schopnosť vyrábať kyselinu nikotínovú (niacínový test):
• aktivita nitrátovej reduktázy;
• termostabilná kataláza;
• rast na médiu s salicylátom sodným (1 mg / ml).

Ako ďalšie testy sa môže tiež použiť rast na médiu obsahujúcom 500 ug / ml kyseliny paranitrobenzoovej alebo 5% chloridu sodného.

Mnohé bakteriologické laboratóriá identifikujú tieto mikroorganizmy len na úrovni komplexu, čo je spôsobené obmedzenými schopnosťami laboratórií a metodologickými schopnosťami špecialistov.

Vo väčšine prípadov sa však v praxi pre odlíšenie M. Tuberculosis a M. Bovis je dostatočná nasledujúce skúšky: niacín, na prítomnosť dusičnanov, registrácia prítomnosti a pirazinamidazy rastu v médiu obsahujúcom 2 ug / ml Hydrazidy tiofén-2-karboxylovej kyseliny. Berie sa do úvahy, že mykobaktérie komplexu M. Tuberculosis sú charakterizované nasledujúcim súborom znakov:

• pomalý rast (viac ako 3 týždne);
• rastová teplota v rozmedzí 35-37 ^o C;
• absencia pigmentácie (slonovina);
• značne kyslý-rýchla farba;
• pozitívny niacínový test;
• pozitívny test nitrátovej reduktázy;
• absencia termostabilnej katalázy (68 ^° C).
• Absencia rastu na médiu Levenstein-Jensen obsahujúca:
  • 1000 μg / ml salicylátu sodného,
  • 500 μg / ml kyseliny paranitrobenzoovej,
  • 5% chloridu sodného:
• rast v prítomnosti 1-5 ug / ml tiofén-2-karboxylovej kyseliny.

Význam diferenciácie izolovaných mykobaktérií sa výrazne zvýši so zvýšením frekvencie zaznamenávania prípadov HIV / AIDS súvisiacich s tuberkulózou alebo mykobakteriózou. V súčasnosti neexistuje absolútna istota pripravenosti praktických regionálnych laboratórií správne vykonávať tento objem práce.

[52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59]

Imunologická diagnostika tuberkulózy

Existuje celá rada univerzálnych javov, liekov a imunologických testov, ktoré sa pôvodne nachádzali presne pri tuberkulóze alebo na modeli imunitnej odpovede na mykobaktérie. Patrí medzi BCG tuberkulínu, taký jav ako kožné DTH (tuberkulínu - Pirquet a Mantoux reakcie), v reakcii na podkožnej tuberkulínových senzibilizovaných zvierat (Koch jav). Jedna z prvých protilátok pri infekčných ochoreniach bola tiež zistená pri tuberkulóze. Samozrejme, že hlbšie porozumenie dobré mechanizmy tuberkulózy imunitných a ich genetickej kontroly, tým väčšia môže byť použitie imunologických metód a liekov, ktoré majú vplyv na imunitný systém, riešiť praktické problémy TB.

Najdôležitejším a najťažším praktickým problémom sa v súčasnosti považuje detekcia tuberkulózy v procese masového skríningu populácie. Napriek početným hláseniam o "úspechoch" (na obmedzený materiál) neexistuje žiadna vhodná imunologická metóda (reprodukovateľná v "akejkoľvek zbrani") a lieku.

Imunologické metódy, najmä sérologické štúdie (stanovenie antigénov, protilátok) a tuberkulín vyvolávajúce testy sa v klinickej praxi veľmi používajú.

V prvom rade medzi imunologickými štúdiami používanými v diferenciálnej diagnostike existujú sérologické metódy - stanovenie antigénov a protilátok v rôznych prostrediach tela.

Špecifickosť protilátok proti tuberkulóze mykobaktérií závisí od antigénov použitých v imunoteste. Predpokladá sa významné množstvo antigénov, z ktorých prvý je tuberkulínový PPD:

• PAP a ďalších komplexných prípravkov z kultúrnej kvapaliny;
• ultrazvuková dezintegrácia;
• Extrakt z tritónu a ostatné komplexné prípravky bunkových stien;
• 5-antigén (Daniel);
• 60-antigén (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• koordinačný faktor (trehalóza-6,6-di-mykolát);
• fenolické a iné glykolipidy;
• lipopolysacharid;
• antigén viažuci fibronektín;
• proteíny (najčastejšie rekombinantné); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 CDA atď.

V dôsledku rokov výskumu ruských a zahraničných vedcov odhalili základné zákony a účinnosť protilátky sérologickú diagnostiku tuberkulózy: zložitejšie antigénu je vyššia citlivosť a nižšiu špecificitu testu. Špecifickosť v rôznych krajinách, sa líši v závislosti od počtu obyvateľov infekcie M. Tuberculosis a nontubercular mykobaktérií z nesúci BCG vakcinácii a ďalšie. U detí, informačný obsah serodiagnosis je nižšia ako u dospelých. Pri primárnej tuberkulóze (častejšie u detí) je definícia IgM viac informatívna. So sekundárnym IgG. U HIV-infikovaných pacientov je informatívna hodnota sérologickej diagnostiky pri určovaní protilátok znížená. Stanovenie účinnosti protilátok je závislá na počte "klinických aspektov": Proces aktivita (prítomnosť alebo neprítomnosť "izolácia" mykobaktérií prítomnosť rozpadu dutín, je stupeň infiltrácia), prevalencia procesu, trvanie jeho toku.

Citlivosť metódy enzýmovej imunoanalýzy (ELISA) je približne 70%. Nedostatočná účinnosť štúdie je spôsobená nízkou špecifickosťou. Predtým sa zvážila možnosť použitia sérologického skríningu vo vysokorizikových skupinách, najmä u osôb s post-tuberkulóznymi zmenami v pľúcach.

Na zvýšenie špecifičnosti testu ELISA pokračujú vyhľadávania špecifických antigénov, vrátane tých, ktoré boli získané pomocou genetického inžinierstva: ESAT-6 atď. (Pozri vyššie). Použitie striktne špecifických antigénov (38 kDa, ESAT) zvyšuje špecifickosť. Ale výrazne znižuje citlivosť analýzy. Spolu s IFA (skúšobných systémov experimentálne laboratóriá. Napr Pathozyme ELISA kit) tiež poskytuje sady s bočným imunochromatografickým filtráciou (Mycodot), rovnako ako iné podobné testy (dot-analýza na membráne) s vizuálnym posúdenie výsledku testu. Počas týchto testov sa analýza uskutočňuje 10 až 30 minút; nevyžadujú špeciálne vybavenie, vyžadujú vizuálne vyhodnotenie výsledkov, ktoré súvisia s určitou subjektivitou. Tieto metódy majú približne rovnakú charakteristiku citlivosti a špecifickosti (70% a 90-93%) ako tradičná metóda ELISA.

Použitie metód imunitnej analýzy má určitú hodnotu ako ďalšiu, zohľadnenú v komplexe použitých metód, v diferenciálnej diagnostike tuberkulózy, najmä v diagnostike jej extrapulmonárnych foriem. Najúčinnejšou metódou ELISA je diagnostika tuberkulóznej meningitídy v štúdii mozgovomiechovej tekutiny. V tomto prípade je citlivosť analýzy 80-85% a špecifickosť je 97-98%. Existujú údaje o účinnosti detekcie protilátok proti tuberkulóze mykobaktérií v slznej tekutine pri diagnostike tuberkulóznej uveitídy.

Indukcia syntézy gama interferónu in vitro

Interferón gama (IFN-γ) je špecifický imunitný obranný faktor realizovaný aktiváciou enzýmových systémov makrofágov. Indukcia syntézy IFN-y senzibilizovanými T-lymfocytmi spôsobuje ich interakciu s antigénmi mykobaktérií.

Ako antigény používané ako tuberkulín PPD. A špecifické antigény, získaná genetickým inžinierstvom, najmä antigény ESAT-6 (skoré sekretovaný antigén o molekulovej hmotnosti 6 kDa) a CFP-10 (filtrát kultúry proteín 10 kDa). Genetické inžinierstvo alebo rekombinantné antigény chýbajú v bunkách vakcíny BCG a iných mykobaktériách. Pri použití tuberkulínu sú výsledky indukčného testu IFN-γ porovnateľné s výsledkami tuberkulínového kožného testu (priama korelácia). Pri použití geneticky upravených antigénov sú výsledky testov špecifickejšie a nezávisia od predchádzajúcej BCG vakcinácie. Pri testovaní očkovaných osôb, ktoré nemali kontakt s infekciou tuberkulózou, je špecifickosť testu 99%. Citlivosť testu u pacientov s tuberkulózou sa pohybuje od 81 do 89%.

Testy a diagnostické nástroje boli vyvinuté na základe krátkodobú kultiváciu buniek alebo mononukleárnych buniek plnej krvi, izolovaných z krvi s antigénmi Mycobacterium tuberculosis in vitro s následným stanovením koncentrácie IFN-y alebo spočítaním počtu T-lymfocytov, ktoré syntetizujú IFN-y v. Koncentrácia interferónu syntetizované in vitro bola stanovená pomocou ELISA za použitia monoklonálnych protilátok viažucich IFN-y. Potom sa kalibráciou štandardného IFN-y stanoví jeho koncentrácia v skúmavke alebo jamkách platne.

Pri vykonávaní Elispotovho testu bol počet T-limocytov syntetizujúcich IFN-y. Sa spočítajú na povrchu platne potiahnutej protilátkami proti IFN-y.

Vývojári diagnostiky na IFN-γ in vitro prostredníctvom indukcie, ktorý je schválený agentúrou pre liečivá a amerických produktov, tvrdí, že test je možné rozlišovať medzi latentné TBC z aktívnej tuberkulózy. Preto v regiónoch s vysokou úrovňou infekcie nie je test priamo diagnostikovaný. V našej krajine sa však môže použiť na odlíšenie infekcie tuberkulózy u detí po alergii po očkovaní a na posúdenie úrovne špecifickej imunity v procese liečby.

V súčasnosti sa skúma domáci testovací systém na určenie indukcie syntézy IFN-y špecifickými tuberkulóznymi antigénmi in vitro.

Imunitný stav a priebeh tuberkulózy, imunokorekcia

V procese liečenia tuberkulózy u ľudí dochádza k zmenám v antigénii a stave imunitného systému.

Údaje o zmenách v exsudátoch a tkanivách sú do značnej miery rozporuplné. Jediná vec, ktorú možno pozorovať s dobrým dôvodom, je to, že pri tuberkulárnych granulómoch sa zvyčajne zistí značný počet aktivovaných T-lymfocytov.

Je rozumné zamerať sa na ďalšie dve ustanovenia, ktoré sú potrebné na pochopenie úlohy imunologických mechanizmov pri liečbe tuberkulózy u ľudí:

• Pacienti s AIDS majú mimoriadne vysoký výskyt rezistencie na viaceré lieky;
• s mnohonásobnou rezistenciou na liek (a za neprítomnosti infekcie HIV) sú obzvlášť významné poruchy imunity (najmä spojenie T-buniek).

Keď tuberkulóza široko aplikovať rôzne metódy imunomoduláciu: ide najmä o lieky pôsobiace predovšetkým na imunity T-buniek a systém mononukleárnych fagocytov (týmusu hormóny, isoforon, likopid, polioksidony et al.). Ako aj celých (zoslabených) mykobaktérií a ich zložiek.

Molekulárno-biologická diagnostika tuberkulózy

Pre metódy molekulárnej biológie v diagnostike infekčných ochorení zahŕňajú, najmä, metódy založené na manipuláciu s genetický materiál bakteriálnych a vírusových patogénov k identifikácii špecifického genetického materiálu - DNA segmenty, ktoré majú nukleotidové sekvenciu, špecifickú pre konkrétnu kmene typu alebo patogén na analýzu špecifických Sekvencie DNA v génoch, ktoré určujú citlivosť patogénu na určité liečivé látky a tiež funkčnú analýzu aktivity určitých génov patogénu. Molekulárne biologické techniky boli široko vo vedeckom výskume a praktické aplikácie v diagnostike a monitorovaní rôznych bakteriálnych a vírusových infekcií po otvorení v roku 1985, Carrie Myullisom (víťaz Nobelova cena. 1989) polymerázovú reťazovú reakciou.

Princípy a možnosti metódy polymerázovej reťazovej reakcie

PCR umožňuje amplifikovať (rozmnožovať) in vitro nukleotidovú sekvenciu (DNA fragment patogénu) niekoľko hodín v miliónoch časoch. Reakcia v prítomnosti jednotlivých DNA reťazcov určuje mimoriadne vysokú citlivosť testu.

Nukleotidová sekvencia určitých oblastí v reťazci DNA určuje genetickú identitu mikroorganizmu, čo vysvetľuje vysokú špecifickosť PCR.

Hodnota tejto techniky na detekciu a vyšetrovanie vlastností spôsobené Mycobacterium tuberculosis biologické vlastnosti mikroorganizmu, ktoré majú veľmi pomalý rast: čas Mycobacterium tuberculosis DNA zdvojenie pri kultivácii je 12-24 hodín.

Princíp metódy PCR spočíva v amplifikácii - niekoľkonásobne, v mnohých prípadoch. Vynásobenie častí špecifickej DNA sekvencie v mikrovolume trubice počas cyklického opakovania nasledujúcich troch reakčných stupňov, z ktorých každý prechádza v inom teplotnom režime:

• Stupeň I - denaturácia dvojvláknovej DNA pri zahrievaní s divergenciou jej reťazcov;
• II stupeň - komplementárna väzba (hybridizácia) primérov (primárne oligonukleotidy) s terminálnymi úsekmi reťazcov prísne špecifických, vybraných pre násobenie fragmentu DNA;
• Stupeň III - dokončenie fragmentu reťazca DNA pomocou termostabilnej DNA polymerázy.

Na amplifikáciu in vitro musia byť molekuly matricovej DNA. štyri typy deoxynukleozidových trifosfátov (nukleotidov) obsahujúcich zodpovedajúce dusíkaté bázy: adenín (A), tymín (T), guanín (D), cytozín (C); umelo syntetizované primerové oligonukleotidy (priméry) pozostávajúce z párov 18 až 20 báz; termostabilná DNA polymeráza, ktorá má teplotné optimum 68-72 ^na C, a horečnatých iónov.

Špecifickosť PCR závisí od voľby DNA fragmentu. V súlade s tým sa syntetizujú oligonukleotidy bokového semena. Špecifickosť hybridizácie a kompletizácie reťazca DNA je spôsobená princípom komplementarity nasledujúcich dvojíc dusíkatých báz: adenín-tymín, guanín-cytozín.

Pre stanovenie genómovej tuberkulózne mykobaktérie komplex najúčinnejší cieľ amplifikácie vo väčšine testovacích systémov vybraných fragmentov DNA IS6110, ktorá vo väčšine kmeňov Mycobacterium tuberculosis genómu má významné množstvo (10-20) opakovanie, ktorá poskytuje, spoločne so špecifickosťou, vysokej citlivosti testu. V rovnakej dobe, kmene Mycobacterium tuberculosis je popísané s malým počtom opakovaní alebo žiadnu IS6110 fragmentu.

Izolácia molekúl DNA z biologickej vzorky

Na vykonanie PCR by molekuly DNA patogénu mali byť izolované z biologického materiálu v minimálnom objeme s minimálnym množstvom nešpecifickej DNA a rôznymi inhibítormi enzýmovej DNA-polymerázy.

Príprava vzoriek by sa mala uskutočňovať za podmienok, ktoré zabraňujú krížovej kontaminácii vzoriek izolovanými molekulami DNA. Pre dosiahnutie tohto cieľa je potrebné predbežné spracovanie miestnosti s ultrafialovým žiarením, podlahami a pracovnými povrchmi stolov a spotrebičov s roztokmi obsahujúcimi chlór. Tiež povinné používanie čistých rukavíc, jednorazových skúmaviek a hrotov na automatické pipety.

Pre izoláciu DNA Mycobacterium tuberculosis z klinických vzoriek (mozgovomiechový mok, bronchiálna umývanie) neobsahujúce veľké množstvo buniek, bunkový odpad, alebo ich solí, je dostatočné na centrifúgovať vzorku 3-4 tis. Otáčky za minútu, pridá sa do kalu 20-30 ul 2% roztoku triton X-100 a zahrievaná pri 90 ° C ^o C počas 30 minút.

Na prípravu vzoriek spúta musí byť efektívne skvapalňovanie, ktorý sa všeobecne používa pre 4% roztoku hydroxidu sodného a N-acetyl-L-cysteín (Nalco), v množstve 50-80 mg na vzorku - v závislosti na viskozite vzorke. Roztok NALC sa musí pripraviť ex tempore alebo prášok NALC môže byť pridaný priamo do vzorky. Po skvapalnení sa vzorky centrifugujú počas 15 minút pri 3000 až 3000 ot / min v 50 ml injekčných liekovkách so závitovými uzávermi, tj E. Za tých istých podmienok, ktoré sa odporúčajú na predbežnú prípravu hlienu.

Pre extrakciu DNA z metódy peliet sa použil najčastejšie založené na použití 5-6 M roztoku guanidínu izothiocyanátu lyzačný roztok, ako mikroporéznych častíc a oxidu kremičitého ( "kremeliny") sorbovať molekuly DNA. Nešpecifické látok, vrátane inhibítorov možné, potom sa premyje do 2,5 molárneho roztoku guanidinium izothiocyanátu a roztokom etanolu, načo sa molekula DNA desorbovanej vody, a tieto vzorky boli použité na vykonanie PCR. Na zjednodušenie technológie extrakcie DNA je "kremelina" často nahradená magnetickými mikročasticami pokrytými oxidom kremičitým. V tomto prípade sa namiesto odstreďovania použije špeciálny magnetický stojan pre mikrotubuly na vyzrážanie častíc.

V Rusku sa vyvinula pôvodná metóda imunomagnetického oddelenia mykobaktérií, po ktorej nasledovala extrakcia DNA patogénu. Pre Mycobacterium tuberculosis imunomagnetické separáciu pomocou ferroparticles veľkosti 3-5 um, potiahnuté oxidom kremičitým, s ktorými sú spojené pomocou chemických väzieb polyklonálne (králik) protilátky proti Mycobacterium tuberculosis. Vzorky spúta po alkalickej lýze sa neutralizujú kyslým roztokom tris-HCl a inkubujú sa s imunomagnetickým sorbentom. Potom sa imunoferópové častice zhromažďujú magnetickou tyčou s vymeniteľným hrotom, prenesú sa na mikrodutku a vysrážajú sa. Pridajte 20-30 ul 2% roztoku Tritonu X-100 a 30 minút zahrievajte na 90 ^° C. Supernatant sa používa ako DNA templát na PCR analýzu.

Zložitým problémom je izolácia DNA mycobacterium tuberculosis z bioptických vzoriek. V prípade biopsie enzýmu sa enzymatická proteináza K použije pri konečnej koncentrácii 200-500 mg / l pri teplote 56 ^° C cez noc. Ďalej sa používa jedna zo známych metód. Nadbytočná nešpecifická DNA v PCR analýze biopsií často spôsobuje inhibíciu reakcie, ktorá si vyžaduje opakovanú extrakciu DNA.

Metódy zisťovania výsledkov

Po ukončení reakcie sa amplifikované DNA fragmenty patogénu identifikujú rôznymi spôsobmi.

Metóda gélovej elektroforézy je dobre známa. Výsledný fragment DNA sa identifikuje pozitívnou kontrolou obsahujúcou požadovaný špecifický fragment DNA alebo podľa známej veľkosti (počet nukleotidových párov) fragmentu, ktorý sa stanoví použitím štandardného molekulárneho markeru.

V prítomnosti špecifického farbiva je do dvojvláknovej DNA zahrnutý etidiumbromid. Syntetizovaný fragment DNA je detegovaný ako pás svietivý pod pôsobením ultrafialového žiarenia.

Veľkosť fragmentu DNA, stanovená elektroforézou zo vzdialenosti od začiatku, musí zodpovedať známemu markeru molekulovej hmotnosti alebo pozitívnej kontrole.

Ďalšie spôsoby určovania výsledkov PCR založené na hybridizácii s jediným reťazcom produktmi PCR s oligonukleotidom, komplementárne k nej - DNA sondy značené biotínom, následnou detekciou pomocou enzymatických reakcií, napríklad väzbou na streptavidin-biotín alkalickou fosfatázou.

Na základe tohto typu detekcie boli vytvorené analyzátory PCR, v ktorých sa detekcia výsledkov PCR uskutočňuje automaticky ako výsledok čítania optickej hustoty vo vzorkách po prejave enzymatickej reakcie.

Nevýhody týchto metód sú možnosti intralaboratórnej kontaminácie pomerne krátkymi fragmentmi molekúl DNA. Keď molekuly vstupujú do nových vzoriek, stávajú sa matricou pre PCR a vedú k falošne pozitívnym výsledkom.

V tomto ohľade, aby sa zabránilo falošne pozitívnym výsledkom, sú zavedené prísne pravidlá pre separáciu a izoláciu priestorov: extrahovanie DNA z biologických vzoriek; priestory na zisťovanie výsledkov (elektroforézy) z čistej zóny. Tieto priestory sú oblasťou pravdepodobnej kontaminácie. Ďalšia izolovaná oblasť je čistá miestnosť na zavedenie vzoriek DNA, ktoré sa majú testovať v skúmavkách s reakčnou zmesou pre PCR. Napokon sa predpokladá, že hlavné zariadenie - zosilňovač DNA - by malo byť umiestnené v samostatnej, prípadne kancelárskej miestnosti.

Aby sa zabránilo kontaminácii produktov predchádzajúcich reakcií - niektoré testovací systém Likon-amp PCR namiesto dezoksinukleozidtimidina obsahujú dezoksinukleoziduridin, ktoré, ak sú súčasťou in vitro syntéza obvodu namiesto v správnej polohe, to znamená, Dusíková báza tymínu prítomná v natívnej DNA je nahradená uracilom. Uracil DNA glykosylázy sa pridá do reakčnej zmesi na analyt, zničí iba kontaminujúce fragmenty deoxyuridín, ale nie natívne DNA analyzovaná. (R). Následné zahrievanie pri 94 ^° C inaktivuje tento enzým a neinterferuje s amplifikáciou v PCR.

Existuje testovací systém založený na izotermickej amplifikácii rRNA, pre ktorý sa najprv uskutočňuje reverzná transkripcia a syntéza molekúl DNA. Ktorý je zase matricou pre následnú syntézu molekúl RNA. Amplióny RNA sa detegujú pomocou sondy DNA farbených akridínom, keď sa hybridizujú v roztoku reakčnej skúmavky. Táto metóda okrem vysokej citlivosti má tú výhodu, že sa analyzuje v jednej rúrke, ktorá zabraňuje kontaminácii. Podľa autorov citlivosť tejto metódy v respiračných vzorkách dosahuje 90% so špecificitou 99-100%.

Nové metódy detekcie sa implementujú v PCR v reálnom čase. Tieto metódy sa líšia primárne tým, že PCR a detekcia ich výsledkov sa vykonáva súčasne v jednej uzavretej skúmavke. To nielenže technologicky zjednodušuje techniku analýzy, ale tiež zabraňuje kontaminácii laboratórnych miestností a testovaných vzoriek produktmi predchádzajúcej PCR.

V reálnom čase výsledkov detekcie PCR je v dôsledku fluorescencie vznikajúce pri fluorogenické DNA hybridizácie sondy s amplifitsi Rui-PCR v priebehu špecifických fragmentov DNA. Štruktúra fluorogenické sondy DNA konštruované tak, že fluorescenčný marker je vydaná ako výsledok enzymatické reakcie alebo vzdialený od molekuly najúčinnejšie bojujú fluorescencie iba za špecifické hybridizácie s požadovanou molekulou DNA, ktorý má byť amplifikovaný v priebehu PCR. Ako sa počet molekúl sondy hybridizovaly s zvýšenie fluorescencie je úmerná zistené úrovne počtu molekúl amplifikovaného produktu. Vzhľadom k tomu, pri každom počte cyklov PCR fragment molekuly DNA sa násobí o polovicu, číslo cyklu, pri ktorej sa fluorescencie stanovená a zvyšuje nepriamo úmerný počtu molekúl DNA v počiatočnom vzorke. V prípade, že reakcia je predstaviť ako kalibrátora niekoľko rôznych známych koncentrácií molekúl zodpovedajúcich DNA fragment Mycobacterium tuberculosis, použitím počítačového programu môže byť vypočítaná a množstva genómovej DNA v testovanom materiáli.

Každá štandardná vzorka je duplikovaná. Kvantitatívnym kritériom je minimálny počet cyklov PCR potrebných na začiatok a rast určenej fluorescencie. Na súradnici - počet cyklov; súradnicou je hodnota fluorescencie. Koncentrácie DNA sú nepriamo úmerné počtu cyklov potrebných na výskyt fluorescencie. V pravom stĺpci (21-32) sú označené čísla cyklov pre príslušné koncentrácie. Rozdiely medzi 10-násobnými koncentráciami fragmentov DNA 10 ² -10 ⁶ ml - 3,2 až 3,4 cykly. Pre dvoch pacientov boli koncentrácie fragmentov IS6110 asi 10 ³ / ml a 10 ⁴ / ml. Vzhľadom k tomu, počet opakovaní (6-20) analyzovaných fragmentov do genómu Mycobacterium tuberculosis číslo mykobaktérií v klinických vzorkách - cca 100 až 1000 buniek, v danom poradí.

Použitie PCR pri diagnostike tuberkulózy

Metóda PCR sa najčastejšie používa na urýchlenie diagnostiky tuberkulózy - detekcia mycobacterium tuberculosis v klinických vzorkách: spúta. Bronchiálne zavlažovanie, pleurálny exsudát, moč, cerebrospinálna tekutina, bodkovaná osteolýza, aspiráty ženských pohlavných orgánov a rôzne vzorky biopsie. V štúdii v Holandsku boli študované asi 500 spúte a bronchiálna laváže vzoriek od 340 pacientov s potvrdenou diagnózou pľúcnej tuberkulózy porovnať citlivosť metódy PCR, mikroskopia a štúdie kultúra náteroch. Citlivosť analýzy bola 92,6,88,9 a 52,4%. Špecifickosť všetkých metód bola približne 99%.

Bola porovnávaná účinnosť detekcie mycobacterium tuberculosis mikroskopickou analýzou, očkovanie na médiu Levenstein-Jensen, testovací systém VASTES a analýza PCR. PCR ukázala citlivosť 74,4%, mikroskopia - 33,8%, očkovanie na hustom médiu - 48,9% a VASTES - 55,8%. Priemerný čas detekcie na očkovanie na médiu Levenstein-Jensen je 24 dní. VASTES - 13 dní, PCR - 1 deň.

Uvádzajú sa aj možnosti využitia PCR ako citlivej a rýchlej metódy monitorovania účinnosti liečby tuberkulózy.

Detekcia Mycobacterium tuberculosis DNA pomocou PCR s účinnej chemoterapie určí po dlhšiu dobu - v priemere 1,7 mesiaca v porovnaní s stere definovaným pod fluorescenčným mikroskopom, a od 2,5 mesiaca v porovnaní s bakteriologického vyšetrenia.

Diagnóza extrapulmonárnych foriem tuberkulózy

Hodnota ako citlivú metódou PCR je obzvlášť veľký pre mimopľúcna formy, pretože tvorí v týchto klinických a rádiografických metód obvyklých bakteriologické metódami stanovovania Mycobacterium tuberculosis v diagnostických materiálov neúčinné.

Pri skúmaní vzoriek moču PCR výsledky boli pozitívne v 16 z 17 pacientov s aktívnou tuberkulózou a negatívne močového 4 pacientov neaktívne obličiek tuberkulózy a 39 pacientov s močovou nontubercular ochorenia systém.

Účinnosť analýzy PCR v štúdii aspirátov kostnej drene u pacientov s horúčkou neznámeho pôvodu bola preukázaná v prípadoch podozrenia na tuberkulózu. Na diagnostiku tuberkulóznej lymfadenitídy bolo u detí skúmaných 102 odberov a biopsia vzorky 67 detí s podozrením na tuberkulóznu lymfadenitídu. Boli získané pozitívne výsledky: 71,6% PCR v reálnom čase. Fluorescenčná mikroskopia - 46,3%. Kultúrny výskum - 41,8%. V štúdii s 50 biopsiami lymfatických uzlín u pacientov s "škrabkou" boli všetky výsledky negatívne. Preukázala sa 100% špecificita PCR analýzy. V tej istej práci bola preukázaná možnosť detekcie M. Avium s punkčnou biopsií lymfatických uzlín.

Diagnóza tuberkulózy ženskej genitálnej oblasti neplodnosti, ako je známe, je jedným z najťažších problémov diagnostiky. Pri skúmaní PCR biopsie endometria, endometriálne vdychovanie kvapalných vzoriek od Douglas priestoru 14 (56%) z 25 vyšetrených pacientov laparoskopicky podozrenie na tuberkulózu, boli získané pozitívne výsledky. Pomocou mikroskopie a kultúry sa získali 1 a 2 výsledky. Tieto prípady boli tiež pozitívne na PCR. Väčšina PCR-pozitívnych výsledkov súvisí s prípadmi s charakteristickými príznakmi tuberkulózy podľa histologickej štúdie; menšie číslo - s podozrením na tuberkulózu podľa laparoskopických údajov. Pri absencii laparoskopických údajov o tuberkulóze sa získal len jeden pozitívny výsledok PCR analýzy.

Pri diagnostikovaní extrapulmonárnych foriem tuberkulózy majú klinickí lekári často otázku o možnosti zistenia patogénu pri testovaní krvných vzoriek metódou PCR. Z literárnych údajov vyplýva, že detekcia DNA z Mycobacterium tuberculosis z krvných vzoriek je možná s ďalekosiahlymi formami infekcie HIV. DNA mycobacterium tuberculosis bola detegovaná len so všeobecnou tuberkulózou rôznych orgánov u pacientov s transplantovanou obličkou a imunosupresiou.

[60], [61], [62], [63], [64], [65]

Identifikácia druhov mykobaktérií

Metóda PCR môže byť veľmi účinná pre rýchlu identifikáciu mykobaktérií z tuberculosis a niektorých druhov mykobaktérií nontubercular po obdržaní ich počiatočný rast. V tomto prípade môže použitie PCR ušetriť 7-10 dní, ktoré sú nevyhnutné pre následnú kultúrnu identifikáciu pozitívneho výsledku. Test PCR je technicky veľmi jednoduchý, pretože nevyžaduje komplikovanú prípravu vzorky klinického materiálu na dosiahnutie vysokej citlivosti. V štúdii 80 pozitívne v tomto testovacom systéme (firmy MB Vasto. Organon) všetky pozitívne kultúry PCR boli prísne špecifické a udržuje po dobu 1 dňa. Pre identifikáciu iných druhov mykobaktérií v príprave DNA patogénu kultúry hybridizované so špecifickými DNA sondami značenými akridín a kmene zistených vzhľadu chemiluminiscencie prostredníctvom chemiluminometru alebo nitrocelulózové prúžky s vizuálnym hodnotením po hybridizácii. S pomocou takéhoto súboru sa identifikuje obmedzený počet druhov: komplex mycobacterium tuberculosis. M. Avium, M. Avium komplex, M. Kansasii a M. Gordonae.

A.Telenti a kol. Tiež vyvinul relatívne jednoduchý a lacný spôsob identifikácie druhov klinicky významných druhov mykobaktérií pomocou PCR a následnou reakciou s dvoma reštrikčnými enzýmami (enzýmy, ktoré majú schopnosť znížiť molekulu DNA na špecifických miestach). Fragment DNA sa amplifikuje. Ktorý kóduje proteín tepelného šoku (65 kDa), a potom PCR fragment 439 nukleotidových párov produkovaných pomocou PCR sa spracuje oddelene dvoma enzýmami, Bste II a Nae III. Potom analyzované pomocou elektroforézy v agarosovém gélu získané dva produkty, určenie ich veľkosti (počet párov báz) pomocou štandardnej súbor fragmentov DNA (molekulová DNA markery) v dĺžke od 100 do 1000 párov báz. V každom z týchto špecifických typov (M. Tuberculosis, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansasii, M.fortuitum) detekovať dva alebo tri DNA fragmenty rôznej veľkosti pre každý reštrikčné enzým. Kombinácia rôznych veľkostí DNA fragmentov umožňuje rozlíšiť tieto druhy medzi sebou.

Technológia biologických DNA mikročlánkov sa vyvíja. čo pomôže identifikovať viac ako 100 druhov mykobaktérií v jednej štúdii.

Identifikácia druhov sa môže tiež vykonávať pomocou PCR amplifikáciu variabilnej oblasti 16S rRNA nasleduje sekvenovanie amplikónov pri porovnaní so zodpovedajúcou primárnou štruktúre, ktorá umožňuje identifikáciu viac ako 40 druhov mykobaktérií.

Pomocou PCR sa môže uskutočniť aj identifikácia druhu v komplexe mycobacterium tuberculosis vrátane diferenciácie M. Bovis a M. Bovis BCG. Na tento účel sa analyzuje prítomnosť alebo neprítomnosť niektorých génov v genómových oblastiach RD1. RD9 a RD10. RD1 chýba v M. Bovis BCG, ale je prítomný v virulentných druhoch vrátane M. Bovis.

Stanovenie citlivosti lieku Mycobacterium tuberculosis na liečivo pomocou PCR

Ciele molekulárne genetických metód pre liekové vnímavosťou alebo odolnosťou Mycobacterium tuberculosis znížiť na identifikáciu mutácií v špecifických nukleotidových sekvencií známych génov. Základné metódy sú založené buď na priamom prochityvanii (sekvenovanie) týchto sekvencií po amplifikáciu a hybridizáciu DNA fragmentov biotínom značené amplifikovanej v PCR sond DNA. Obe alternatívy zahŕňajú identifikáciu substitúcie nukleotidov v sekvenciách, ktoré používajú sondy DNA vedú k neprítomnosti alebo neúplné hybridizácii na nitrocelulózové membránu s použitím enzýmového konjugátu (streptavidín-alkalická fosfatáza) - Metóda Lípa-Rif-TB.

Metóda pre meranie fluorescencie v miestne upevnený na mikrovýbrusů DNA sondami komplementárnym so známymi mutáciami v PCR amplifikovaných oblastí génu zodpovedné za rezistenciu alebo citlivosti na lieky, tzv mikrobiochipov metóda. Hlavný algoritmus na vykonanie tohto výskumu je nasledujúci. Po izolácii DNA z klinickej vzorky alebo kultúry mykobaktérií je nutné vykonať PCR amplifikáciu príslušných fragmentov rpoB génu zodpovedného za citlivosti na lieky na rifampicín alebo katG a inhA génov kódujúcich proteíny Mycobacterium sú zodpovedné za citlivosť na izoniazid. Výsledky PCR boli hodnotené pomocou elektroforézy v agarosovém gélu, v ktorej potvrdí príjem príslušných DNA fragmentov na požadovanú dĺžku. Potom sa uskutoční druhé kolo PCR, aby sa do DNA vložila fluorescenčná značka. Výsledky PCR sa opäť potvrdili gélovou elektroforézou. Potom, hybridizácia bola vykonávaná (inkubácie cez noc), s následným premytím výsledného materiálu na biočipu, ktorý je veľký počet pevných do malej sklenenej dosky krátkych reťazcov DNA (sond), ktoré sú komplementárne s nukleotidovej sekvencie typu Mycobacterium tuberculosis senzitívnym v miestach možných mutácií. Ako aj mutantných sekvencií zodpovedných za rezistenciu voči lieku. Umiestnenie DNA sond na tanieri - v pravom slova zmysle, a úroveň fluorescencie pozorované pri hybridizácii k určeniu výsledku pomocou špeciálneho čítacieho zariadenia je inštalovaný. V tejto súvislosti sú výsledky analýzy určené pomocou špeciálneho počítačového programu.

V posledných rokoch boli vyvinuté alternatívne metódy na stanovenie citlivosti na mykobaktériu tuberkulózy na základe technológie PCR v reálnom čase, ktoré umožňujú vykonať tieto štúdie v uzavretom skúmavke.

Na obr. 13-13 ukazuje výsledok analýzy klinických izolátov Mycobacterium tuberculosis pri určovaní odolnosti voči rifampicínu pomocou PCR v reálnom čase: 218 - kontrolná vzorka (citlivé na rifampicín); 93 - pozitívna kontrola pre mutáciu Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - pozitívna kontrola pre mutáciu Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - experimentálne vzorky. Výsledok výpočtu kinetických kriviek amplifikácie na 4 kanáloch: kanál 1: 393 - pozitívna kontrola pre mutáciu Ser-Trp TCG-TGG; kanál 2: 4482 - pozitívna kontrola pre mutáciu Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - experimentálne vzorky; kanál 4: kinetické krivky amplifikácie všetkých vzoriek zúčastňujúcich sa experimentu. Pozitívna kontrola amplifikačnej reakcie. Záver: Výsledky analýzy boli zistené nasledujúce mutácie, ktoré určujú odolnosť voči rifampicínu: vo vzorkách 162,163,172,295 - Ser-Leu-TCG TTG. Rovnaký princíp sa použil na stanovenie rezistencie voči izoniazidu voči génom katG a inhA, čo určuje najčastejšie mutácie.

[66], [67], [68], [69], [70], [71],

Identifikácia kmeňa mycobacterium tuberculosis

Najviac dôkladne študovaný spôsob identifikácie kmeňov Mycobacterium tuberculosis je technika tzv polymorfizmu dĺžky reštrikčných fragmentov (RFLP RFLP,., Alebo v anglickom znení), a ktorý je založený na fragmentirovanin (obmedzenia) z Mycobacterium tuberculosis DNA enzýmom PvuII a fragmenty získané následnú hybridizácii s určitými špecifickými sekvenciami na DNA jeho opakovaný prvok IS6110. Vnútrodruhová variabilita realizované rôznymi počty opakovaní IS6110 a ich umiestnenie na DNA. Ako aj rôznych vzdialeností medzi určitých miestach reštrikčné útok enzýmu (reštrikčné miesta) a prvok IS6110. Táto technológia je veľmi zložitá a časovo náročná. Po ošetrení DNA extrahované z kultúry Mycobacterium tuberculosis, gélová elektroforéza sa vykonáva s štiepenia enzýmom, a potom sa prenesie DNA fragmenty rôznej dĺžky na nitrocelulózové membránu, hybridizácia bola vykonávaná s fragmentmi IS6110 prvku a detekovaná pomocou enzymatické reakcie. Špecifické DNA prúžky výsledný vzor charakterizuje konkrétny kmeň Mycobacterium tuberculosis. Pomocou počítačovej analýzy sa zistí identita alebo príbuznosť kmeňov. Napriek skutočnosti, že metóda RFLP je naj diskriminačnejšia, t.j. Identifikuje najväčší počet rozdiely v analyzovaných kmeňov, je neúčinné pre malé množstvo (menej ako 5), IS6110-looping pozorované u niektorých kmeňov. Na obr. 13-14 znázorňuje výsledky RFLP-typovania kmeňov.

Alternatívou môže byť metóda spoligotypizácie - analýza polymorfizmu distančných DNA sekvencií - medzi medzi priamymi opakovaniami oblasti DR. Pri vykonávaní spolygotypovania kmeňov sa uskutočňuje PCR s primérmi ohraničujúcimi oblasť DR, po ktorej sa vytvoria fragmenty s rôznou dĺžkou, ktoré hybridizujú s variabilnými strednými oblasťami DNA. Analýza distančných sekvencií oblasti DR je prezentovaná. Podľa výskumníkov, jednoduchšie, produktívnejšie a vhodnejšie na primárne skríning kmeňov a predbežnú epidemiologickú analýzu, ako aj na priamy výskum klinického materiálu.

Je zrejmé, že účinnejšou a technologicky dostupnejšou metódou je VNTR (skratka anglických slov) alebo metóda určovania premenlivého počtu presných tandemových opakovaní v DNA mycobacterium tuberculosis. Táto metóda je založená iba na použití PCR a nevyžaduje dodatočnú manipuláciu. Pretože počet tandemových opakovaní v rôznych kmeňoch a rôznych miestach je odlišný, stanovia sa fragmenty rôznych veľkostí a analyzujú sa na výslednej elektroforéme PCR produktov. Podľa vedcov sa pomocou VNTR dosahuje väčší stupeň diskriminácie kmeňov ako pomocou metódy RFLP.

V posledných rokoch bola venovaná veľká pozornosť distribúcii kmeňov Mycobacterium tuberculosis z rodiny W-Beijing (niekedy nazývaných pekinským kmeňom), ktoré sú do značnej miery odolné voči drogám.

Základné požiadavky na kvalitu molekulárneho biologického výskumu

[72], [73], [74], [75],

Základné regulačné dokumenty pre PCR

Objednávky Ruské ministerstvo zdravotníctva: №45 od 02.07.2000 g .. číslo 109 z 21.03.2003 g .. číslo 64 z 21.02.2000, pokynov: 1.3.1888-04 "Organizácia práce v štúdiách s použitím PCR materiálu infikované patogénnym biologický činidlá skupiny III-IV patogénnosti "; 1.3.1794-03 "Organizácia práce pri štúdii PCR materiálu infikovaného mikroorganizmami patogénnych skupín I-II". 2003. 3.5.5.1034-01 "Dekontaminácia materiálu, infikované baktérie I-IV patogenity skupiny pri použití PCR," 2001 doplnku 11 k jednotnej pokyny pre mikrobiologické vyšetrovacie metódy v identifikácii, diagnostiku a liečbu tuberkulózy.

[76], [77], [78]

Zamestnanci

Prevedenie molekulárne biologickom výskume môže držať doktormi klinické laboratórne diagnostiky, lekári bacteriologists, virologists, lekári, biológovia, klinické diagnostické laboratóriá, rovnako ako špecialistov so stredným vzdelávanie lekárov, prešiel špecializáciu a pokročilý výcvik v predpísaným spôsobom.

Usporiadanie laboratórnych priestorov

Vyžadujú sa tieto laboratórne miestnosti:

• Oblasť spracovania vzoriek je laboratórium prispôsobené na prácu s infekčnými činidlami patogénnych skupín III-IV podľa metodických pokynov 13.1888-04.
• Zóna na prípravu reakčných zmesí PCR - laboratórna miestnosť, ktorá zabezpečuje ochranu pred vnútornou laboratórnou kontamináciou - "čistá" zóna.
• • Ak sa na analýzu produktov PCR používa elektroforéza alebo hybridizácia. Laboratórium miestnosť, v ktorej sú vynásobený fragmenty DNA sa extrahuje z trubiek a zosilnenie, v tomto poradí, sa môže dostať do životného prostredia, v súlade s požiadavkami na PCR laboratória (1.3.1794-03 pokyny, vedenie 1.3.1888-04) musia byť plne je izolovaný od priestorov uvedených v predchádzajúcich odsekoch. Malo by byť vylúčené z pohybu zóny k zónovej elektroforézy pre zaobchádzanie so vzorkou a "čistú" oblasti akéhokoľvek personálu, zariadení, použitých materiálov a predmetov, rovnako ako prenos vzduchu ventilačným systémom, alebo v dôsledku prievanu. Táto zóna sa nevyžaduje na fluorimetrickú detekciu PCR produktov.
• Miestnosť na dokumentáciu a spracovanie výsledkov je vybavená počítačmi a potrebným kancelárskym vybavením. Táto miestnosť môže obsahovať zariadenia, ktoré zabezpečujú detekciu produktov PCR bez otvorenia trubice. - fluorescenčné detektory PCR a tepelné cykly pre PCR v reálnom čase.

Sanitárne a epidemiologické požiadavky na primárnu liečbu spúta sú podobné štandardným mikrobiologickým požiadavkám na liečbu tuberkulózy mykobaktérií.

[79], [80], [81], [82],

Dokončenie laboratórneho zariadenia pre diagnostiku PCR

Laboratórium zahŕňa zariadenia pre nasledujúce miestnosti.

• miestnosť na prípravu vzoriek obsahuje nasledovné vybavenie: laminárna druhá trieda ochrany "SP-1.2": pevný termostat s vyhrievacím krytom pre skúmavky typu "Eppendorf"; mikrocentrifugácia pri 13 000 ot / min; odstredivka (vortex); Chladničky s teplotným rozsahu od -20 ^až C 10 do ^asi C; pipety s variabilným objemom radu "Rroline"; čerpadlo s odlučovačom OM-1; stativ na pipety; stacionárna pracovná stanica 200 x 0,5 ml; stativová pracovná stanica 50 x 1,5 ml; Stojany na uloženie skúmaviek 80x1,5 ml;
• Miesto na prípravu reakčnej zmesi: ochranná komora PCR-box ("Laminar-C, 110 cm); odstredivka - Vortex; Pipety s variabilným objemom série Proline; stativ na pipety; stacionárna pracovná stanica 200 x 0,2 ml; Stojany na uloženie skúmaviek 80x1,5 ml; Chladničky s teplotnom rozmedzí od -20 ^do C do + 10 ^o C;
• miestnosť na elektroforézu: kamera na horizontálnu elektroforézu; napájanie; transiluminátor;
• Zosilňovače DNA alebo analyzátory nukleových kyselín (PCR v reálnom čase) s počítačom a softvérom; môže byť umiestnená v ľubovoľnej voľnej miestnosti. Ak sa používa technológia PCR v reálnom čase. Miestnosť na elektroforézu nie je potrebná.

[83], [84], [85], [86]

Externá kontrola kvality

Aby boli laboratóriá dôveryhodné pri získavaní objektívne spoľahlivých výsledkov, mali by sa zapojiť do systému externého hodnotenia kvality laboratórneho výskumu.

Účastníci systému kontroly kvality dostávajú; 12 fľaštičiek lyofilizovaných bakteriálnych bunkových suspenzií, z ktorých dve obsahujú E. Coli E. Kokosové vlákno, 3 fľaštičky s Mycobacterium tuberculosis (avirulentní kmeň) v 10 ² / ml; 3 fľaše rovnakého kmeňa buniek v koncentrácii 10 ⁴ / ml; 2 ampulky nontubercular Mycobacterium avium-intracellulare M. A M. Kansasii v koncentrácii 10 ⁵ / ml.

Distribuované testy na externé hodnotenie kvality sú predbežne testované v dvoch nezávislých laboratóriách s rozsiahlymi skúsenosťami v tejto oblasti.

[87], [88]