Obnova kĺbovej chrupavky a rastové faktory v patogenéze osteoartrózy

Vďaka pokroku v biotechnológii, najmä v klonovacej technológii, sa v poslednom čase intenzívne rozširuje zoznam rastových faktorov, ktoré ako anabolické faktory zohrávajú dôležitú, ale nie úplne pochopenú úlohu v patogenéze osteoartrózy.

Prvou skupinou rastových faktorov, o ktorých sa bude diskutovať nižšie, sú IGF. Nachádzajú sa vo veľkom množstve v krvnom sére a majú množstvo spoločných vlastností s inzulínom. IGF-2 je typickejší pre embryonálne štádium vývoja, zatiaľ čo IGF-1 je dominantným zástupcom tejto skupiny u dospelých. Obaja zástupcovia tejto skupiny pôsobia väzbou na receptory IGF typu I. Zatiaľ čo funkcia IGF-2 zostáva neznáma, význam IGF-1 už bol stanovený - je schopný stimulovať syntézu proteoglykánov chondrocytmi a významne inhibovať katabolické procesy v kĺbovej chrupavke. IGF-1 je hlavným anabolickým stimulom pre syntézu proteoglykánov chondrocytmi, ktoré sú prítomné v krvnom sére a synoviálnej tekutine. IGF-1 je dôležitým faktorom pre kultiváciu chondrocytov v experimentálnych modeloch osteoartrózy in vitro. Predpokladá sa, že IGF-1 vstupuje do synoviálnej tekutiny z krvnej plazmy. Okrem toho normálne chondrocyty produkujú oba faktory - expresia IGF-1 a IGF-2 bola zistená v synoviálnej membráne a chrupavke pacientov s osteoartrózou. V normálnej chrupavke nemá IGF-1 mitogénne vlastnosti, ale je schopný stimulovať proliferáciu buniek v poškodenej matrici, čo naznačuje účasť na reparačných procesoch.

Biologicky aktívne látky, ktoré stimulujú reparáciu a inhibujú degradáciu kĺbovej chrupavky

• Inzulín
• Gama interferón
• Somatotropný hormón, androgény
• Somatomedíny (IPF-1 a -2)
• TGF-beta (tkanivový rastový faktor)
• Rastový faktor odvodený z krvných doštičiek
• Základný rastový faktor fibroblastov
• EFR
• Antagonista receptora IL-1
• Proteíny viažuce TNF-a
• Tkanivové inhibítory metaloproteináz
• a2 makroglobulín
• AI-antitrypsín
• RG-makroglobulín
• Rg-antichymotrypsín

Pôsobenie IGF-1 a IGF-2 je riadené rôznymi proteínmi viažucimi IGF (IGF-BP), ktoré sú tiež produkované chondrocytmi. IGF-BP môže pôsobiť ako nosič a má tiež aktivitu blokujúcu IGF. Bunky izolované z kĺbovej chrupavky pacientov s osteoartrózou produkujú nadmerné množstvo IGF-BP, čo naznačuje, že blokujú účinky IGF. J. Martel-Pelletier a kol. (1998) ukázali, že hoci sa syntéza IGF-1 v chrupavke pri osteoartróze zvyšuje, chondrocyty reagujú na stimuláciu IGF-1 slabo. Ukázalo sa, že tento jav je spojený (aspoň čiastočne) so zvýšením hladiny IGF-BP. IGF-BP má vysokú afinitu k IGF a je dôležitým biomodulátorom jeho aktivity. Doteraz bolo študovaných sedem typov IGF-BP a dysregulácia IGF-BP-3 a IGF-BP-4 hrá dôležitú úlohu pri osteoartróze.

Ďalšou kategóriou rastových faktorov, ktoré vykazujú rôzne účinky na chondrocyty, je rastový faktor odvodený z krvných doštičiek (PDGF), FGF a TGF-beta. Tieto faktory produkujú nielen chondrocyty, ale aj aktivované synovocyty. FGF má anabolické aj katabolické vlastnosti v závislosti od koncentrácie a stavu kĺbovej chrupavky. PDGF sa podieľa na udržiavaní homeostázy mimocelulárnej hmoty kĺbovej chrupavky bez toho, aby mal zjavné mitogénne vlastnosti. Je známe, že tento rastový faktor zvyšuje syntézu proteoglykánov a znižuje ich degradáciu.

TGF-beta je obzvlášť zaujímavý pre svoju úlohu v patogenéze osteoartrózy. Je členom veľkej superrodiny TGF a zdieľa funkčné a signálne vlastnosti s nedávno objavenými rastovými faktormi BMP (kostný morfogenetický proteín).

TGF-beta je pleiotropný faktor: na jednej strane má imunosupresívne vlastnosti, na druhej strane je chemotaktickým faktorom a silným stimulátorom proliferácie fibroblastov. Jedinečnými vlastnosťami TGF-beta sú schopnosť inhibovať uvoľňovanie enzýmov z rôznych buniek a významne zvyšovať produkciu inhibítorov enzýmov (napríklad TIMP). TGF-beta sa považuje za dôležitý regulátor poškodenia tkaniva v dôsledku zápalu. V tkanive kĺbovej chrupavky teda TGF-beta významne stimuluje produkciu matrice chondrocytmi, najmä po predchádzajúcom vystavení tomuto faktoru. Normálna chrupavka je necitlivá na TGF-beta. U pacientov s osteoartritídou TGF-β stimuluje produkciu agrekánu a malých proteoglykánov v kĺbovej chrupavke.

TGF-beta je produkovaný mnohými bunkami, najmä chondrocytmi. Uvoľňuje sa v latentnej forme viazaný na špeciálny proteín nazývaný latentne asociovaný proteín (LAP). Disociáciu z tohto proteínu zabezpečujú proteázy, ktoré sa produkujú vo veľkých množstvách v zapálených tkanivách. Okrem TGF-beta, ktorý produkujú aktivované bunky, sú zásoby latentnej formy tohto faktora dôležitým prvkom reaktivity TGF-beta v tkanive po lokálnom poranení. TGF-beta je prítomný vo významných množstvách v synoviálnej tekutine, synoviálnej membráne a chrupavke kĺbu postihnutého osteoartrózou. V oblastiach poškodeného tkaniva so zápalovými infiltrátmi sa zisťuje koexpresia TNF a IL-1, zatiaľ čo v oblastiach s fibrózou sa zisťuje iba expresia TGF-beta.

Inkubácia kultivovaných chondrocytov od pacientov s osteoartrózou s TGF-beta spôsobuje významné zvýšenie syntézy proteoglykánov týmito bunkami. Stimulácia normálnych chondrocytov pomocou TGF-beta spôsobuje zvýšenie syntézy proteoglykánov až po mnohých dňoch inkubácie. Možno je tento čas potrebný na zmenu bunkového fenotypu pod vplyvom TGF-beta (napríklad na zmenu tzv. kompartmentalizácie proteoglykánov: novovytvorené proteoglykány sú lokalizované iba okolo chondrocytov).

Je známe, že aktivácia syntézy rastových faktorov, najmä TGF-beta, je dôležitým článkom v patogenéze renálnej a hepatálnej fibrózy a tvorby jaziev počas hojenia rán. Zvýšené zaťaženie chondrocytov in vitro vedie k hyperprodukcii TGF-beta, zatiaľ čo znížená syntéza proteoglykánov po imobilizácii končatiny môže byť vyrovnaná pomocou TGF-beta. TGF-beta indukuje tvorbu osteofytov v marginálnej zóne kĺbov ako mechanizmus adaptácie na zmeny zaťaženia. IL-1, ktorý spôsobuje mierny zápalový proces v synovii v reakcii na poškodenie kĺbu, podporuje tvorbu chondrocytov so zmeneným fenotypom, ktoré ich produkujú v nadmernom množstve.

Opakované lokálne injekcie rekombinantného TGF-beta vo vysokých koncentráciách viedli u myší C57B1 k rozvoju osteoartrózy – tvorbe osteofytov, ktorá je charakteristická pre ľudskú osteoartrózu, a k významnej strate proteoglykánov v zóne „vlnitého okraja“.

Aby sme pochopili, ako nadbytok TGF-beta spôsobuje známe zmeny v chrupavke, je potrebné poznamenať, že expozícia TGF-β indukuje charakteristický chondrocytový fenotyp so zmenou v podtriede syntetizovaných proteoglykánov a narušením normálnej integrácie prvkov ECM. IGF-1 aj TGF-beta stimulujú syntézu proteoglykánov chondrocytmi kultivovanými v algináte, ale TGF-beta tiež indukuje tzv. kompartmentalizáciu proteoglykánov. Okrem toho sa zistilo, že TGF-beta zvyšuje hladinu kolagenázy-3 (MMP-13) v aktivovaných chondrocytoch, čo je v rozpore so všeobecnou predstavou o TGF-beta ako faktore, ktorý naopak znižuje uvoľňovanie deštruktívnych proteáz. Nie je však známe, či sa syntéza MMP-13 indukovaná TGF-beta podieľa na patogenéze osteoartrózy. TGF-beta nielen stimuluje syntézu proteoglykánov, ale tiež podporuje ich ukladanie vo väzoch a šľachách, čím zvyšuje tuhosť a znižuje rozsah pohybu v kĺboch.

BMP sú členmi nadrodiny TGF-beta. Niektoré z nich (BMP-2, BMP-7 a BMP-9) majú vlastnosť stimulovať syntézu proteoglykánov chondrocytmi. BMP uplatňujú svoje účinky väzbou na špecifické receptory na povrchu bunky; signálne dráhy TGF-beta a BMP sa mierne líšia. Podobne ako TGF-beta, aj BMP signalizujú prostredníctvom komplexu serín/treonínkinázových receptorov typu I a II. V tomto komplexe je receptor typu II transfosforylovaný a aktivuje receptor typu I, ktorý prenáša signál na signálne molekuly nazývané Smad. Po prijatí signálu sú Smad rýchlo fosforylované. V súčasnosti je známe, že v signálnej dráhe BMP sú fosforylované Smad-1, -5 a -8 a v signálnej dráhe TGF-beta sú fosforylované Smad-2 a Smad-3. Potom sa pomenované Smad asociujú so Smad-4, ktorý je spoločný pre signálne dráhy všetkých členov nadrodiny TGF-beta. Táto skutočnosť vysvetľuje prítomnosť skrížených funkcií u členov superrodiny TGF-beta, ako aj jav vzájomnej inhibície signálnych dráh TGF-beta a BMP súťažením o spoločné komponenty. Nedávno bola identifikovaná ďalšia trieda proteínov Smad, ktorú predstavujú Smad-6 a -7. Tieto molekuly pôsobia ako regulátory signálnych dráh TGF-beta a BMP.

Napriek tomu, že stimulačný účinok CMP na syntézu proteoglykánov je známy už dlho, ich úloha v regulácii funkcie kĺbovej chrupavky zostáva kontroverzná kvôli známej schopnosti CMP spôsobiť dediferenciáciu buniek, stimulovať kalcifikáciu a tvorbu kostného tkaniva. M. Enomoto-Iwamoto a kol. (1998) preukázali, že interakcia CMP s receptorom CMP typu II je nevyhnutná pre udržanie diferencovaného fenotypu chondrocytov, ako aj pre kontrolu ich proliferácie a hypertrofie. Podľa LZ Sailora a kol. (1996) CMP-2 udržiava fenotyp chondrocytov v kultúre počas 4 týždňov bez toho, aby spôsoboval ich hypertrofiu. CMP-7 (identický s osteogénnym proteínom-1) dlhodobo udržiava fenotyp zrelých chondrocytov kĺbovej chrupavky kultivovaných v algináte.

Podanie KMP-2 a -9 do kolenných kĺbov myší zvýšilo syntézu proteoglykánov o 300 %, čo je výrazne viac ako pri podaní TGF-beta. Stimulačný účinok bol však dočasný a po niekoľkých dňoch sa úroveň syntézy vrátila na pôvodnú úroveň. TGF-beta spôsobil dlhodobejšiu stimuláciu syntézy proteoglykánov, čo je pravdepodobne spôsobené autoindukciou TGF-beta a senzibilizáciou chondrocytov na tento faktor.

TGF-beta je zodpovedný za tvorbu chondrofytov, čo možno považovať za nežiaduci účinok jeho pôsobenia, KMP-2 tiež podporuje tvorbu chondrofytov, ale v inej oblasti kĺbového okraja (hlavne v oblasti rastovej platničky).

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Morfogenetické proteíny chrupavky

Morfogenetické proteíny chrupavky (CMP-1 a -2) sú ďalšími členmi superrodiny TGF-beta, ktoré sú nevyhnutné pre tvorbu chrupavkového tkaniva počas vývoja končatín. Mutácie v géne CMP-1 spôsobujú chondrodyspláziu. CMP môžu mať selektívnejší profil zameraný na chrupavku. Hoci TGF-beta a CMP môžu stimulovať chondrocyty, môžu pôsobiť aj na mnoho iných buniek, takže ich použitie na opravu chrupavky môže byť spojené s vedľajšími účinkami. Oba typy CMP sa nachádzajú v chrupavke zdravých a osteoartritických kĺbov a podporujú opravu extracelulárnej hmoty kĺbovej chrupavky po enzymatickej degradácii, pričom udržiavajú normálny fenotyp.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ]

Synergia rastových faktorov

Jeden rastový faktor je schopný indukovať sám seba, rovnako ako iné rastové faktory, táto interakcia je jemne regulovaná. Napríklad FGF spolu s ďalšími rastovými faktormi zabezpečuje účinnejšiu opravu kĺbovej chrupavky po traumatickom defekte. IGF-1 spolu s TGF-beta významne indukujú normálny fenotyp chondrocytov pri ich kultivácii in vitro. Bolo preukázané, že TGF-beta zabraňuje produkcii IGF-1 a IGF-BP a tiež defosforyluje receptor IGF-1, stimuluje väzbu IGF-1. V intaktnej myšej chrupavke sa zistil jav synergizmu IGF-1 s mnohými rastovými faktormi. Slabú odpoveď chondrocytov na IGF-1 však nemožno vyrovnať jeho použitím v kombinácii s inými rastovými faktormi.

Interakcia anabolických a deštruktívnych cytokínov

Rastové faktory vykazujú komplexné interakcie s IL-1. Napríklad preexpozícia chondrocytov FGF zvyšuje uvoľňovanie proteázy po expozícii IL-1, pravdepodobne prostredníctvom zvýšenej expresie receptora IL-1. PDGF tiež stimuluje uvoľňovanie proteázy závislé od IL-1, ale znižuje inhibíciu syntézy proteoglykánov sprostredkovanú IL-1. To môže naznačovať, že niektoré rastové faktory môžu súčasne stimulovať opravu chrupavky a podporovať jej deštrukciu. Iné rastové faktory, ako napríklad IGF-1 a TGF-β, stimulujú syntézu kĺbovej matrice a inhibujú deštrukciu kĺbovej chrupavky sprostredkovanú IL-1, čo naznačuje, že ich aktivita súvisí iba s opravou tkaniva. Táto interakcia je nezávislá od preexpozície chondrocytov IL-1. Je zaujímavé, že kinetika účinkov IL-1 a TGF-beta sa môže líšiť: schopnosť TGF-beta potlačiť degradáciu kĺbovej chrupavky je oslabená jeho pomalým pôsobením na mRNA TIMP. Na druhej strane sa pozoruje zvýšenie hladín hNOC a NO v neprítomnosti TGF-beta. Vzhľadom na závislosť supresívneho účinku IL-1 na syntézu proteoglykánov chondrocytmi od NO by to mohlo vysvetľovať, prečo pozorujeme výrazne silnejší protiúčinok TGF-beta voči inhibícii syntézy proteoglykánov závislej od IL-1 v porovnaní s degradáciou proteoglykánov in vivo.

V štúdii na myšiach, ktorým bol intraartikulárne injekčne podaný IL-1 a rastové faktory, sa preukázalo, že TGF-beta významne pôsobí proti inhibícii syntézy proteoglykánov kĺbovej chrupavky sprostredkovanej IL-1, zatiaľ čo CMP-2 nie je schopný takéhoto pôsobenia: jeho stimulačný potenciál bol úplne inhibovaný IL-1 aj pri vysokých koncentráciách CMP-2. Je pozoruhodné, že v neprítomnosti IL-1 CMP-2 stimuloval syntézu proteoglykánov oveľa intenzívnejšie ako TGF-beta.

Okrem svojho účinku na syntézu proteoglykánov, TGF-beta tiež významne ovplyvňuje IL-1-indukované zníženie obsahu proteoglykánov v chrupavke. Je možné, že obsah proteoglykánov klesá alebo sa zvyšuje v závislosti od relatívnej koncentrácie IL-1 a TGF-beta. Je zaujímavé, že vyššie opísaný protiúčinok IL-1 a TGF-beta bol pozorovaný v hrúbke chrupavky, ale tento jav nebol pozorovaný v blízkosti chondrofytov na okrajoch kĺbových povrchov. Tvorba chondrofytov je indukovaná TGF-β, ktorý ovplyvňuje chondrogénne bunky v perioste, čo spôsobuje vývoj chondroblastov a ukladanie proteoglykánov. Zdá sa, že tieto chondroblasty nie sú citlivé na IL-1.

HL Glansbeek a kol. (1998) skúmali schopnosť TGF-beta a KMP-2 pôsobiť proti potlačeniu syntézy proteoglykánov v kĺboch myší s artritídou vyvolanou zymosanom (t. j. v modeli „čistého“ zápalu vyvolaného IL-1). Intraartikulárne podanie TGF-beta významne pôsobilo proti potlačeniu syntézy proteoglykánov spôsobenému zápalom, zatiaľ čo KMP-2 prakticky nedokázal pôsobiť proti tomuto procesu závislému od IL-1. Opakované injekcie TGF-β do kolenného kĺbu skúmaných zvierat významne stimulovali syntézu proteoglykánov chondrocytmi, prispeli k zachovaniu existujúcich proteoglykánov v chrupavke vyčerpanej zápalom, ale nepotlačili zápalový proces.

Pri štúdiu proteoglykán-syntetizujúcej funkcie chondrocytov s použitím experimentálnych modelov osteoartrózy u zvierat sa vždy pozoroval nárast obsahu a stimulácia syntézy proteoglykánov v skorých štádiách osteoartrózy, na rozdiel od zápalových modelov, v ktorých sa pozorovala významná inhibícia syntézy (proces závislý od IL-1). Zvýšená aktivita anabolických faktorov, najmä rastových faktorov, ktorá sa pozoruje pri osteoartróze, neutralizuje účinok takých supresorových cytokínov, ako je IL-1. Medzi rastovými faktormi má najväčší význam TGF-beta; KMP-2 pravdepodobne nehrá v tomto procese významnú úlohu. Hoci IGF-1 je schopný stimulovať syntézu proteoglykánov in vitro, táto vlastnosť sa in vivo nepozoruje pri lokálnej aplikácii IGF-1. To môže byť spôsobené tým, že endogénna hladina tohto rastového faktora je optimálna. V neskorších štádiách osteoartrózy sa objavujú známky inhibície syntézy proteoglykánov, čo pravdepodobne súvisí s dominantným účinkom IL-1 a neschopnosťou rastových faktorov pôsobiť proti nemu v dôsledku zníženej aktivity.

Analýza expresie rastových faktorov u myší STR/ORT so spontánnou osteoartrózou preukázala zvýšené hladiny mRNA TGF-β a IL-1 v poškodenej chrupavke. Treba poznamenať, že aktivácia TGF-β z latentnej formy je dôležitým prvkom opravy tkaniva. Pochopenie úlohy TGF-β je komplikované výsledkami štúdie expresie receptora TGF-β typu II u králikov s ACL. Bezprostredne po indukcii osteoartrózy boli zistené znížené hladiny týchto receptorov, čo naznačuje nedostatočnú signalizáciu TGF-β. Je zaujímavé, že myši s deficitom receptora TGF-β typu 11 vykazovali známky spontánnej osteoartrózy, čo tiež naznačuje dôležitú úlohu signalizácie TGF-β pri zhoršovaní opravy chrupavky a rozvoji osteoartrózy.

Absolútny obsah rastových faktorov v kĺboch pacientov s reumatoidnou artritídou alebo osteoartrózou môže naznačovať ich možnú úlohu v patogenéze týchto ochorení. Napriek tomu, že v kĺboch s osteoartrózou a reumatoidnou artritídou sa nachádzajú vysoké koncentrácie rastových faktorov, povaha degradačných a reparačných procesov pri oboch ochoreniach je úplne odlišná. Pravdepodobne existujú aj iné, zatiaľ neidentifikované faktory, ktoré zohrávajú hlavnú úlohu v patogenéze týchto ochorení, alebo iné aspekty študovaných javov určujú priebeh degradačných a reparačných procesov v kĺbových tkanivách (napríklad expresia určitých receptorov na povrchu chondrocytov, rozpustných receptorov, ktoré viažu proteíny, alebo nerovnováha anabolických a deštruktívnych faktorov).