Osteoartróza: ako je usporiadaná kĺbová chrupavka?

Normálna kĺbová chrupavka plní dve hlavné funkcie: absorbuje tlak deformáciou počas mechanického zaťaženia a zabezpečuje hladkosť kĺbových povrchov, čo umožňuje minimalizovať trenie počas pohybov kĺbov. Toto je zabezpečené jedinečnou štruktúrou kĺbovej chrupavky, ktorá pozostáva z chondroitínov ponorených do extracelulárnej matrice (ECM).

Normálna dospelá kĺbová chrupavka sa dá rozdeliť do niekoľkých vrstiev alebo zón: povrchová alebo tangenciálna zóna, prechodná zóna, hlboká alebo radiálna zóna a kalcifikovaná zóna. Vrstva medzi povrchovou a prechodnou zónou a najmä medzi prechodnou a hlbokou zónou nemá jasné hranice. Spojenie medzi nekalcifikovanou a kalcifikovanou kĺbovou chrupavkou sa nazýva „vlnitý okraj“ – čiara viditeľná pri farbení odkalcifikovaného tkaniva. Kalcifikovaná zóna chrupavky tvorí relatívne konštantný podiel (6 – 8 %) z celkovej výšky prierezu chrupavky. Celková hrúbka kĺbovej chrupavky vrátane kalcifikovanej chrupavkovej zóny sa mení v závislosti od zaťaženia konkrétnej oblasti kĺbového povrchu a od typu kĺbu. Prerušovaný hydrostatický tlak v subchondrálnej kosti hrá dôležitú úlohu pri udržiavaní normálnej štruktúry chrupavky spomalením osifikácie.

Chondrocyty tvoria približne 2-3% celkovej hmotnosti tkaniva; v povrchovej (tangenciálnej) zóne sú umiestnené pozdĺž a v hlbokej (radiálnej) zóne - kolmo na povrch chrupavky; v prechodovej zóne tvoria chondrocyty skupiny 2-4 buniek roztrúsených po celej matrici. V závislosti od zóny kĺbovej chrupavky sa hustota chondrocytov líši - najvyššia hustota buniek je v povrchovej zóne, najnižšia - v kalcifikovanej zóne. Okrem toho sa hustota rozloženia buniek líši od kĺbu ku kĺbu, je nepriamo úmerná hrúbke chrupavky a zaťaženiu zodpovedajúcej oblasti.

Najpovrchnejšie umiestnené chondrocyty sú diskovité a tvoria niekoľko vrstiev buniek v tangenciálnej zóne nachádzajúcej sa pod úzkym pásom matrice; hlbšie umiestnené bunky tejto zóny majú tendenciu mať nerovnejšie kontúry. V prechodnej zóne sú chondrocyty guľovité, niekedy sa spájajú do malých skupín roztrúsených v matrici. Chondrocyty hlbokej zóny majú prevažne elipsoidný tvar, zoskupené do radiálne umiestnených reťazcov 2-6 buniek. V kalcifikovanej zóne sú rozmiestnené ešte riedšie; niektoré z nich sú nekrotické, hoci väčšina je životaschopná. Bunky sú obklopené nekalcifikovanou matricou, medzibunkový priestor je kalcifikovaný.

Ľudská kĺbová chrupavka teda pozostáva z hydratovanej extracelulárnej hmoty (ECM) a buniek v nej ponorených, ktoré tvoria 2 – 3 % celkového objemu tkaniva. Keďže chrupavkové tkanivo nemá krvné ani lymfatické cievy, interakcia medzi bunkami, dodávanie živín do nich a odstraňovanie metabolických produktov sa uskutočňuje difúziou cez ECM. Napriek tomu, že chondrocyty sú metabolicky veľmi aktívne, u dospelých sa bežne nedelia. Chondrocyty existujú v prostredí bez kyslíka a predpokladá sa, že ich metabolizmus je prevažne anaeróbny.

Každý chondrocyt sa považuje za samostatnú metabolickú jednotku chrupavky, izolovanú od susedných buniek, ale zodpovednú za produkciu prvkov ECM v bezprostrednej blízkosti darovanej bunky a za udržiavanie jej zloženia.

ECM je rozdelená do troch častí, z ktorých každá má jedinečnú morfologickú štruktúru a špecifické biochemické zloženie. ECM bezprostredne susediaca s bazálnou membránou chondrocytov sa nazýva pericelulárna alebo lakunárna matrica. Je charakterizovaná vysokým obsahom proteoglykánových agregátov spojených s bunkou interakciou kyseliny hyalurónovej s receptormi podobnými CD44 a relatívnou absenciou organizovaných kolagénových fibríl. Priamo susediaca s pericelulárnou matricou je teritoriálna alebo kapsulárna matrica, ktorá pozostáva zo siete pretínajúcich sa fibrilárnych kolagénov, ktoré obaľujú jednotlivé bunky alebo (niekedy) skupiny buniek, tvoria chondron a pravdepodobne poskytujú bunkám špecializovanú mechanickú oporu. Kontakt chondrocytov s kapsulárnou matricou sa dosahuje prostredníctvom početných cytoplazmatických procesov bohatých na mikrofilamenty, ako aj prostredníctvom špecifických molekúl matrice, ako sú ancorín a receptory podobné CD44. Najväčšou a najvzdialenejšou časťou ECM od bazálnej membrány chondrocytov je interteritoriálna matrica, ktorá obsahuje najväčší počet kolagénových fibríl a proteoglykánov.

Rozdelenie extracelulárneho chrupavkového tkaniva (ECM) na kompartmenty je v dospelej kĺbovej chrupavke jasnejšie definované ako v nezrelej kĺbovej chrupavke. Relatívna veľkosť každého kompartmentu sa líši nielen medzi kĺbmi, ale aj v rámci tej istej chrupavky. Každý chondrocyt produkuje matricu, ktorá ho obklopuje. Podľa výskumu chondrocyty zrelého chrupavkového tkaniva vykonávajú aktívnu metabolickú kontrolu nad svojimi pericelulárnymi a teritoriálnymi matricami a menej aktívnu kontrolu nad interteritoriálnou matricou, ktorá môže byť metabolicky „inertná“.

Ako už bolo spomenuté, kĺbová chrupavka pozostáva prevažne z rozsiahlej extracelulárnej hmoty (ECM) syntetizovanej a regulovanej chondrocytmi. Tkanivové makromolekuly a ich koncentrácie sa počas života menia v súlade s meniacimi sa funkčnými potrebami. Zostáva však nejasné, či bunky syntetizujú celú matricu súčasne alebo v určitých fázach v súlade s fyziologickými potrebami. Koncentrácia makromolekúl, metabolická rovnováha medzi nimi, ich vzťahy a interakcie určujú biochemické vlastnosti a teda aj funkciu kĺbovej chrupavky v rámci jedného kĺbu. Hlavnou zložkou ECM dospelej kĺbovej chrupavky je voda (65 – 70 % celkovej hmotnosti), ktorá je v nej pevne viazaná vďaka špeciálnym fyzikálnym vlastnostiam makromolekúl chrupavkového tkaniva, ktoré sú súčasťou kolagénov, proteoglykánov a nekolagénových glykoproteínov.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Biochemické zloženie chrupavky

Kolagénové vlákna pozostávajú z molekúl fibrilárneho proteínu kolagénu. U cicavcov kolagén tvorí štvrtinu všetkých bielkovín v tele. Kolagén tvorí fibrilárne prvky (kolagénové fibrily) pozostávajúce zo štrukturálnych podjednotiek nazývaných tropokolagén. Molekula tropokolagénu má tri reťazce, ktoré tvoria trojitú špirálu. Táto štruktúra molekuly tropokolagénu, rovnako ako štruktúra kolagénového vlákna, spočíva v tom, že tieto molekuly sú umiestnené rovnobežne v pozdĺžnom smere s konštantným posunom približne o 1/4 dĺžky a poskytujú tkanivám, v ktorých sa nachádzajú, vysokú elasticitu a pevnosť. V súčasnosti je známych 10 geneticky odlišných typov kolagénu, ktoré sa líšia chemickou štruktúrou α-reťazcov a/alebo ich súborom v molekule. Najlepšie študované sú prvé štyri typy kolagénu, ktoré sú schopné tvoriť až 10 molekulárnych izoforiem.

Kolagénové fibrily sú súčasťou extracelulárneho priestoru väčšiny spojivových tkanív vrátane chrupavky. V nerozpustnej trojrozmernej sieti pretínajúcich sa kolagénových fibríl sú zapletené ďalšie rozpustnejšie zložky, ako sú proteoglykány, glykoproteíny a tkanivovo špecifické proteíny; tie sú niekedy kovalentne viazané na kolagénové prvky.

Molekuly kolagénu organizované do fibríl tvoria približne 50 % organického suchého zvyšku chrupavky (10 – 20 % pôvodnej chrupavky). V zrelej chrupavke je približne 90 % kolagénov kolagén typu II, ktoré sa nachádzajú iba v niektorých tkanivách (napr. sklovec, embryonálny dorzálny miech). Kolagén typu II patrí do molekúl kolagénu triedy I (tvoriace fibrily). Okrem neho zrelá ľudská kĺbová chrupavka obsahuje aj kolagény typu IX, XI a malé množstvo typu VI. Relatívne množstvo kolagénových vlákien typu IX v kolagénových fibrilách sa znižuje z 15 % vo fetálnej chrupavke na približne 1 % v zrelej hovädzej chrupavke.

Molekuly kolagénu typu I pozostávajú z troch identických polypeptidových reťazcov a, (II) syntetizovaných a vylučovaných ako prekurzorový prokolagén. Po uvoľnení hotových molekúl kolagénu do extracelulárneho priestoru tvoria fibrily. V zrelej kĺbovej chrupavke tvorí kolagén typu II fibrilárne arkády, v ktorých sa „hrubšie“ molekuly nachádzajú v hlbokých vrstvách tkaniva a „tenšie“ molekuly sa nachádzajú horizontálne v povrchových vrstvách.

V géne prokolagénu typu II bol nájdený exón kódujúci N-terminálny propeptid bohatý na cysteín. Tento exón nie je exprimovaný v zrelej chrupavke, ale v skorých štádiách vývoja (prechondrogenéza). Vďaka prítomnosti tohto exónu je molekula prokolagénu typu II (typ II A) dlhšia ako kolagén typu II. Expresia tohto typu prokolagénu pravdepodobne inhibuje akumuláciu prvkov v mimosubcelulárnej hmote kĺbovej chrupavky. Môže zohrávať určitú úlohu vo vývoji patológie chrupavky (napr. nedostatočná reparatívna odpoveď, tvorba osteofytov atď.).

Sieť kolagénových fibríl typu II zabezpečuje funkciu odolnosti voči naťahovaniu a je nevyhnutná na udržanie objemu a tvaru tkaniva. Táto funkcia je umocnená kovalentnými a krížovými väzbami medzi molekulami kolagénu. V extracelulárnom chrupavkovom tkanive (ECM) enzým lyzyloxidáza tvorí aldehyd z hydroxylyzínu, ktorý sa potom premieňa na viacmocnú aminokyselinu hydroxylyzyl-pyridinolín, ktorá tvorí krížové väzby medzi reťazcami. Na jednej strane sa koncentrácia tejto aminokyseliny s vekom zvyšuje, ale v zrelej chrupavke zostáva prakticky nezmenená. Na druhej strane sa v kĺbovej chrupavke s vekom zisťuje nárast koncentrácie krížových väzieb rôznych typov, ktoré vznikajú bez účasti enzýmov.

Približne 10 % celkového množstva kolagénov v chrupavkovom tkanive tvoria takzvané minoritné kolagény, ktoré do značnej miery určujú jedinečnú funkciu tohto tkaniva. Kolagén typu IX patrí do triedy III molekúl s krátkou špirálou a do jedinečnej skupiny kolagénov FACIT (Fibril-Associated Collagen with Interrupted Triple-Helices). Skladá sa z troch geneticky odlišných reťazcov. Jeden z nich, reťazec _a2, je glykozylovaný súčasne s chondroitínsulfátom, čo robí z tejto molekuly proteoglykán. Medzi špirálovými segmentmi kolagénu typu IX a kolagénu typu II sa nachádzajú zrelé aj nezrelé hydroxypyridínové priečne väzby. Kolagén IX môže tiež fungovať ako intermolekulárny-interfibrilárny „konektor“ (alebo mostík) medzi susednými kolagénovými fibrilami. Molekuly kolagénu IX tvoria navzájom priečne väzby, čo zvyšuje mechanickú stabilitu fibrilárnej trojrozmernej siete a chráni ju pred účinkami enzýmov. Poskytujú tiež odolnosť voči deformácii, čím obmedzujú napučiavanie proteoglykánov nachádzajúcich sa vo vnútri siete. Okrem aniónového CS reťazca obsahuje molekula kolagénu IX aj katiónovú doménu, ktorá fibrile dodáva veľký náboj a tendenciu interagovať s inými makromolekulami matrice.

Kolagén typu XI tvorí iba 2 – 3 % celkovej hmotnosti kolagénu. Patrí do kolagénov triedy I (tvoriace fibrily) a pozostáva z troch rôznych α-reťazcov. Spolu s kolagénom typu II a IX tvorí kolagén typu XI heterotypické fibrily kĺbovej chrupavky. Molekuly kolagénu typu XI boli detegované v kolagénových fibrilách typu II pomocou imunoelektromikroskopie. Pravdepodobne organizujú molekuly kolagénu typu II, riadia laterálny rast fibríl a určujú priemer heterotypických kolagénových fibríl. Okrem toho sa kolagén XI podieľa na tvorbe priečnych väzieb, ale aj v zrelej chrupavke zostávajú priečne väzby vo forme nezrelých dvojmocných ketoamínov.

Malé množstvo kolagénu typu VI, ďalšieho člena molekúl s krátkou špirálou triedy III, sa nachádza v kĺbovej chrupavke. Kolagén typu VI tvorí rôzne mikrofibrily a pravdepodobne je koncentrovaný v kapsulárnej matrici chondrónu.

Proteoglykány sú proteíny, ku ktorým je kovalentne pripojený aspoň jeden glykozaminoglykánový reťazec. Proteoglykány patria medzi najzložitejšie biologické makromolekuly. Proteoglykány sú najpočetnejšie zastúpené v mimosubcelulárnej hmote chrupavky. Hydrofilné proteoglykány, „zapletené“ do siete kolagénových fibríl, plnia svoju hlavnú funkciu – dodávajú chrupavke schopnosť reverzibilnej deformácie. Predpokladá sa, že proteoglykány plnia aj množstvo ďalších funkcií, ktorých podstata nie je úplne jasná.

Agrekan je hlavný proteoglykán kĺbovej chrupavky a tvorí približne 90 % celkovej hmotnosti proteoglykánov v tkanive. Jeho jadrový proteín s hmotnosťou 230 kD je glykozylovaný viacerými kovalentne viazanými glykozaminoglykánovými reťazcami a N-terminálnymi a C-terminálnymi oligosacharidmi.

Glykozaminoglykánové reťazce kĺbovej chrupavky, ktoré tvoria približne 90 % celkovej hmotnosti makromolekúl, sú keratánsulfát (sekvencia sulfátovaného disacharidu N-acetylglukozamínolaktózy s viacerými sulfátovanými miestami a ďalšími monosacharidovými zvyškami, ako je kyselina sialová) a chondroitínsulfát (sekvencia disacharidu N-acetylgalaktozamín glukurónovej kyseliny so sulfátovým esterom pripojeným na každý štvrtý alebo šiesty atóm uhlíka N-acetylgalaktozamínu).

Jadrový proteín agrekánu obsahuje tri globulárne (G1, G2, G3) a dve interglobulárne (E1 a E2) domény. N-terminálna oblasť obsahuje domény G1 a G2 oddelené segmentom E1, ktorý je dlhý 21 nm. Doména C3, nachádzajúca sa v C-terminálnej oblasti, je od G2 oddelená _dlhším (približne 260 nm) segmentom E2, ktorý nesie viac ako 100 reťazcov chondroitínsulfátov, približne 15 – 25 reťazcov keratínsulfátov a O-viazané oligosacharidy. N-viazané oligosacharidy sa nachádzajú hlavne v doménach G1 a C2 a segmente E1, ako aj v blízkosti _oblasti G3. Glykozaminoglykány sú zoskupené do dvoch oblastí: najdlhšia (tzv. oblasť bohatá na chondroitínsulfát) obsahuje reťazce chondroitínsulfátu a približne 50 % reťazcov keratínsulfátu. Oblasť bohatá na keratansulfát sa nachádza v _segmente E2 v blízkosti domény G1 a predchádza oblasti bohatej na chondroitínsulfát. Molekuly agrekánu tiež obsahujú fosfátové estery, ktoré sa nachádzajú predovšetkým na xylózových zvyškoch, ktoré pripájajú reťazce chondroitínsulfátu k jadrovému proteínu; nachádzajú sa aj na serínových zvyškoch jadrového proteínu.

C-terminálny segment C3 _domény je vysoko homológny s lektínom, čo umožňuje fixáciu molekúl proteoglykánov v ECM väzbou na určité sacharidové štruktúry.

Nedávne štúdie identifikovali exón kódujúci subdoménu podobnú EGF v rámci G3 _. Pomocou polyklonálnych protilátok proti EGF bol epitop podobný EGF lokalizovaný v peptide s hmotnosťou 68 kD v agrekáne ľudskej kĺbovej chrupavky. Jeho funkcia však ešte len musí byť objasnená. Táto subdoména sa nachádza aj v adhéznych molekulách, ktoré riadia migráciu lymfocytov. Iba približne tretina molekúl agrekánu izolovaných zo zrelej ľudskej kĺbovej chrupavky obsahuje intaktnú _doménu C3; je to pravdepodobne preto, že molekuly agrekánu sa môžu enzymaticky zmenšiť v extracelulárnom matrixe (ECM). Osud a funkcia štiepených fragmentov nie sú známe.

_{Hlavným funkčným segmentom molekuly agrekánu je segment} E2 obsahujúci glykozaminoglykány. Táto oblasť, bohatá na keratánsulfáty, obsahuje aminokyseliny prolín, serín a treonín. Väčšina serínových a treonínových zvyškov je O-glykozylovaná zvyškami N-acetylgalaktozamínu; tie iniciujú syntézu určitých oligosacharidov, ktoré sú začlenené do reťazcov keratánsulfátu, čím ich predlžujú. Zvyšok segmentu E2 _obsahuje viac ako 100 serín-glycínových sekvencií, v ktorých serín zabezpečuje pripojenie k xylozylovým zvyškom na začiatku reťazcov chondroitínsulfátu. Chondroitín-6-sulfát aj chondroitín-4-sulfát typicky existujú súčasne v tej istej molekule proteoglykánu, pričom ich pomer sa mení v závislosti od lokalizácie chrupavkového tkaniva a veku osoby.

Štruktúra molekúl agrekánu v ľudskej kĺbovej chrupavkovej matrici prechádza počas dozrievania a starnutia množstvom zmien. Zmeny súvisiace so starnutím zahŕňajú zníženie hydrodynamickej veľkosti v dôsledku zmeny priemernej dĺžky reťazcov chondroitínsulfátu a zvýšenie počtu a dĺžky reťazcov keratánsulfátu. Množstvo zmien v molekule agrekánu je tiež spôsobené pôsobením proteolytických enzýmov (napr. agrekanázy a stromelezínu) na jadrový proteín. To vedie k progresívnemu znižovaniu priemernej dĺžky jadrového proteínu molekuly agrekánu.

Molekuly agrekánu sú syntetizované chondrocytmi a vylučované do extracelulárneho matrixu (ECM), kde tvoria agregáty stabilizované molekulami linkerového proteínu. Táto agregácia zahŕňa vysoko špecifické nekovalentné a kooperatívne interakcie medzi vláknom kyseliny glukurónovej a takmer 200 molekulami agrekánu a linkerového proteínu. Kyselina glukurónová je extracelulárny, nesulfátovaný, lineárny glykozaminoglykán s vysokou molekulovou hmotnosťou zložený z viacerých sekvenčne spojených molekúl N-acetylglukozamínu a kyseliny glukurónovej. Párové slučky domény G1 agrekánu reverzibilne interagujú s piatimi sekvenčne umiestnenými disacharidmi kyseliny hyalurónovej. Linkerový proteín, ktorý obsahuje podobné (vysoko homológne) párové slučky, interaguje s doménou C1 a molekulou kyseliny hyalurónovej a stabilizuje štruktúru agregátu. Komplex doména C1 - kyselina hyalurónová - väzbový proteín tvorí vysoko stabilnú interakciu, ktorá chráni doménu G1 a väzbový proteín pred pôsobením proteolytických enzýmov. Boli identifikované dve molekuly väzbového proteínu s molekulovou hmotnosťou 40-50 kDa; líšia sa od seba stupňom glykozylácie. V mieste väzby medzi kyselinou hyalurónovou a agrekánom je prítomná iba jedna molekula väzbového proteínu. Tretia, menšia, molekula väzbového proteínu vzniká z väčších molekul proteolytickým štiepením.

Približne 200 molekúl agrekánov sa môže viazať na jednu molekulu kyseliny hyalurónovej a vytvoriť agregát dlhý 8 μm. V matrici asociovanej s bunkami, ktorá pozostáva z pericelulárnych a teritoriálnych kompartmentov, si agregáty udržiavajú svoju asociáciu s bunkami väzbou (prostredníctvom vlákna kyseliny hyalurónovej) na receptory podobné CD44 na bunkovej membráne.

Tvorba agregátov v extracelulárnom membránovom tkanive (ECM) je zložitý proces. Novo syntetizované molekuly agrekánov neprejavujú okamžite schopnosť viazať sa na kyselinu hyalurónovú. To môže slúžiť ako regulačný mechanizmus, ktorý umožňuje novo syntetizovaným molekulám dosiahnuť interteritoriálnu zónu matrice predtým, ako sa imobilizujú do veľkých agregátov. Počet novo syntetizovaných molekúl agrekánov a väzbových proteínov schopných tvoriť agregáty interakciou s kyselinou hyalurónovou s vekom významne klesá. Okrem toho sa s vekom významne znižuje aj veľkosť agregátov izolovaných z ľudskej kĺbovej chrupavky. Je to čiastočne spôsobené znížením priemernej dĺžky molekúl kyseliny hyalurónovej a molekúl agrekánov.

V kĺbovej chrupavke boli zistené dva typy agregátov. Priemerná veľkosť prvého typu agregátov je 60 S, zatiaľ čo druhého typu (rýchlo sa vyzrážajúce „superagregáty“) je 120 S. Druhý typ sa vyznačuje množstvom molekúl väzbového proteínu. Prítomnosť týchto superagregátov môže hrať dôležitú úlohu vo fungovaní tkaniva; počas obnovy tkaniva po imobilizácii končatiny sa ich vyššie koncentrácie nachádzajú v stredných vrstvách kĺbovej chrupavky, zatiaľ čo v kĺbe postihnutom osteoartrózou je ich veľkosť v počiatočných štádiách ochorenia výrazne znížená.

Okrem agrekánu obsahuje kĺbová chrupavka množstvo menších proteoglykánov. Biglykán a dekorín, molekuly, ktoré nesú dermatánsulfáty, majú molekulové hmotnosti približne 100 a 70 kDa; hmotnosť ich jadrového proteínu je približne 30 kDa.

V ľudskej kĺbovej chrupavke obsahuje molekula biglykánu dva reťazce dermatánsulfátu, zatiaľ čo bežnejší dekorín obsahuje iba jeden. Tieto molekuly tvoria len malú časť proteoglykánov v kĺbovej chrupavke, hoci ich môže byť toľko ako veľkých agregovaných proteoglykánov. Malé proteoglykány interagujú s inými makromolekulami v extracelulárnom chrupavkovom telese (ECM), vrátane kolagénových fibríl, fibronektínu, rastových faktorov atď. Dekorín je primárne lokalizovaný na povrchu kolagénových fibríl a inhibuje fibrilogenézu kolagénu. Jadrový proteín je pevne spojený s doménou fibronektínu viažucou bunky, čím pravdepodobne bráni väzbe fibronektínu na receptory na povrchu buniek (integríny). Pretože sa dekorín aj biglykán viažu na fibronektín a inhibujú adhéziu a migráciu buniek, ako aj tvorbu trombov, sú schopné inhibovať procesy opravy tkaniva.

Fibromodulín kĺbovej chrupavky je proteoglykán s molekulovou hmotnosťou 50 – 65 kD asociovaný s kolagénovými fibrilami. Jeho jadrový proteín, homológny s jadrovými proteínmi dekorínu a biglykánu, obsahuje veľké množstvo zvyškov tyrozínsulfátu. Táto glykozylovaná forma fibromodulínu (predtým nazývaná 59 kD matricový proteín) sa môže podieľať na regulácii tvorby a udržiavania štruktúry kolagénových fibríl. Fibromodulín a dekorín sa nachádzajú na povrchu kolagénových fibríl. Ako už bolo uvedené, zväčšeniu priemeru fibríl by malo predchádzať selektívne odstránenie týchto proteoglykánov (ako aj molekúl kolagénu typu IX).

Kĺbová chrupavka obsahuje v extracelulárnom membránovom médiu (ECM) množstvo proteínov, ktoré nie sú ani proteoglykány, ani kolagény. Interagujú s inými makromolekulami a vytvárajú sieť, ktorá zahŕňa väčšinu molekúl ECM.

Ancorín, proteín s molekulovou hmotnosťou 34 kD, je lokalizovaný na povrchu chondrocytov a v bunkovej membráne, kde sprostredkováva interakcie medzi bunkou a matricou. Vďaka svojej vysokej afinite ku kolagénu typu II môže pôsobiť ako mechanoreceptor, ktorý prenáša signál o zmenenom tlaku na fibrilu do chondrocytu.

Fibronektín je súčasťou väčšiny chrupavkových tkanív a mierne sa líši od plazmatického fibronektínu. Predpokladá sa, že fibronektín podporuje integráciu matrice interakciou s bunkovými membránami a inými zložkami matrice, ako je kolagén typu II a trombospondín. Fragmenty fibronektínu majú negatívny vplyv na metabolizmus chondrocytov: inhibujú syntézu agrekánov a stimulujú katabolické procesy. Vysoké koncentrácie fragmentov fibronektínu boli nájdené v kĺbovej tekutine pacientov s osteoartrózou, takže sa môžu podieľať na patogenéze ochorenia v neskorších štádiách. Fragmenty iných molekúl matrice, ktoré sa viažu na receptory chondrocytov, majú pravdepodobne podobné účinky.

Oligomérny matrixový proteín chrupavky (OMPC), člen nadrodiny trombospondínov, je pentamér s piatimi identickými podjednotkami s molekulovou hmotnosťou približne 83 kDa. Nachádza sa vo veľkom množstve v kĺbovej chrupavke, najmä vo vrstve proliferujúcich buniek v rastúcom tkanive. Preto je možné, že OMPC sa podieľa na regulácii rastu buniek. V mimosklenenej hmote zrelej kĺbovej chrupavky sa nachádza v oveľa nižších koncentráciách. Medzi matrixové proteíny patria aj:

• základný matrixový proteín (36 kDa), ktorý má vysokú afinitu k chondrocytom, môže sprostredkovať interakcie medzi bunkami v ECM, napríklad počas remodelácie tkaniva;
• GP-39 (39 kDa) sa exprimuje v povrchovej vrstve kĺbovej chrupavky a v synoviálnej membráne (jeho funkcie nie sú známe);
• 21 kD proteín je syntetizovaný hypertrofovanými chondrocytmi, interaguje s kolagénom typu X a môže fungovať v zóne „vlnivej čiary“.

Okrem toho je zrejmé, že chondrocyty exprimujú neglykozylované formy malých neagregovaných proteoglykánov v určitých štádiách vývoja chrupavky a za patologických podmienok, ale ich špecifická funkcia je v súčasnosti predmetom štúdia.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Funkčné vlastnosti kĺbovej chrupavky

Molekuly agrekánov poskytujú kĺbovej chrupavke schopnosť reverzibilnej deformácie. Vykazujú špecifické interakcie v extracelulárnom priestore a nepochybne hrajú dôležitú úlohu v organizácii, štruktúre a funkcii extracelulárnej hmoty (ECM). V chrupavkovom tkanive dosahujú molekuly agrekánov koncentráciu 100 mg/ml. V chrupavke sú molekuly agrekánov stlačené na 20 % objemu, ktorý zaberajú v roztoku. Trojrozmerná sieť tvorená kolagénovými fibrilami dodáva tkanivu charakteristický tvar a zabraňuje zväčšeniu objemu proteoglykánov. V rámci kolagénovej siete nesú imobilné proteoglykány veľký negatívny elektrický náboj (obsahujú veľké množstvo aniónových skupín), čo im umožňuje interagovať s mobilnými katiónovými skupinami intersticiálnej tekutiny. Interakciou s vodou proteoglykány vytvárajú tzv. napučiavací tlak, ktorému pôsobí kolagénová sieť.

Prítomnosť vody v extracelulárnom matrici (ECM) je veľmi dôležitá. Voda určuje objem tkaniva; viazaná na proteoglykány poskytuje odolnosť voči kompresii. Okrem toho voda zabezpečuje transport molekúl a difúziu v ECM. Vysoká hustota negatívneho náboja na veľkých proteoglykánoch fixovaných v tkanive vytvára „efekt vylúčeného objemu“. Veľkosť pórov intrakoncentrovaného roztoku proteoglykánov je taká malá, že difúzia veľkých globulárnych proteínov do tkaniva je výrazne obmedzená. ECM odpudzuje malé negatívne nabité proteíny (napr. chloridové ióny) a veľké proteíny (ako je albumín a imunoglobulíny). Veľkosť buniek v hustej sieti kolagénových fibríl a proteoglykánov je porovnateľná iba s veľkosťou niektorých anorganických molekúl (napr. sodík a draslík, ale nie vápnik).

V extracelulárnom chrupavkovom priestore (ECM) sa v kolagénových fibrilách nachádza určité množstvo vody. Extrafibrilárny priestor určuje fyzikálno-chemické a biomechanické vlastnosti chrupavky. Obsah vody v intrafibrilárnom priestore závisí od koncentrácie proteoglykánov v extrafibrilárnom priestore a zvyšuje sa so znižujúcou sa koncentráciou proteoglykánov.

Fixný negatívny náboj na proteoglykánoch určuje iónové zloženie extracelulárneho média, ktoré obsahuje voľné katióny vo vysokej koncentrácii a voľné anióny v nízkej koncentrácii. S rastúcou koncentráciou molekúl agrekánov od povrchovej k hlbokej zóne chrupavky sa mení iónové prostredie tkaniva. Koncentrácia anorganických iónov v extracelulárnom matrixe (ECM) vytvára vysoký osmotický tlak.

Materiálové vlastnosti chrupavky závisia od interakcie kolagénových fibríl, proteoglykánov a kvapalnej fázy tkaniva. Štrukturálne a kompozičné zmeny spojené s rozdielom medzi procesmi syntézy a katabolizmu, degradáciou makromolekúl a fyzickou traumou významne ovplyvňujú materiálové vlastnosti chrupavky a menia jej funkciu. Keďže koncentrácia, distribúcia a makromolekulová organizácia kolagénov a proteoglykánov sa mení v závislosti od hĺbky chrupavkovej zóny, biomechanické vlastnosti každej zóny sa líšia. Napríklad povrchová zóna s vysokou koncentráciou kolagénu, tangenciálne umiestnenými fibrilami a relatívne nízkou koncentráciou proteoglykánov má najvýraznejšie vlastnosti odolávať naťahovaniu a rovnomerne rozkladať zaťaženie po celom povrchu tkaniva. V prechodových a hlbokých zónach vysoká koncentrácia proteoglykánov dodáva tkanivu vlastnosť odolávať tlakovému zaťaženiu. Na úrovni „vlnivky“ sa materiálové vlastnosti chrupavky prudko menia z poddajnej nekalcifikovanej zóny na pevnejšiu mineralizovanú chrupavku. V oblasti „vlnivky“ je pevnosť tkaniva zabezpečená kolagénovou sieťou. Podkladové úseky chrupavky nie sú prekryté kolagénovými fibrilami; v oblasti osteochondrálneho spojenia je pevnosť tkaniva zabezpečená špeciálnymi kontúrami hranice medzi nekalcifikovanými a kalcifikovanými chrupavkovými zónami vo forme nepravidelných prstovitých výrastkov, ktoré „uzatvárajú“ obe vrstvy a zabraňujú ich oddeleniu. Kalcifikovaná chrupavka má menšiu hustotu ako subchondrálna kosť, preto funguje ako medzivrstva, ktorá zmäkčuje tlakové zaťaženie na chrupavku a prenáša ho na subchondrálnu kosť.

Počas zaťaženia dochádza ku komplexnému rozloženiu troch síl - extenzie, šmyku a kompresie. Kĺbová matrica sa deformuje v dôsledku vytlačenia vody (ako aj produktov bunkového metabolizmu) zo zaťažovacej zóny, čím sa zvyšuje koncentrácia iónov v intersticiálnej tekutine. Pohyb vody priamo závisí od trvania a sily aplikovaného zaťaženia a je oneskorený negatívnym nábojom proteoglykánov. Počas deformácie tkaniva sú proteoglykány pevnejšie pritlačené k sebe, čím sa efektívne zvyšuje hustota negatívneho náboja, a intermolekulárne sily, ktoré negatívny náboj odpudzujú, zase zvyšujú odolnosť tkaniva voči ďalšej deformácii. Deformácia nakoniec dosiahne rovnováhu, v ktorej sú vonkajšie zaťažovacie sily vyvážené vnútornými odporovými silami - tlakom napučiavania (interakcia proteoglykánov s iónmi) a mechanickým namáhaním (interakcia proteoglykánov a kolagénov). Po odstránení zaťaženia chrupavkové tkanivo nadobudne svoj pôvodný tvar absorpciou vody spolu so živinami. Počiatočný (predzáťažový) tvar tkaniva sa dosiahne, keď je tlak napučiavania proteoglykánov vyvážený odporom kolagénovej siete voči ich šíreniu.

Biomechanické vlastnosti kĺbovej chrupavky sú založené na štrukturálnej integrite tkaniva – kolagén-proteoglykánovej kompozícii ako pevnej fáze a vode a rozpustených iónoch ako kvapalnej fáze. V nezaťaženom stave je hydrostatický tlak v kĺbovej chrupavke približne 1 – 2 atm. Tento hydrostatický tlak sa môže in vivo zvýšiť na 100 – 200 atm za milisekundu počas státia a na 40 – 50 atm počas chôdze. Štúdie in vitro ukázali, že hydrostatický tlak 50 – 150 atm (fyziologický) vedie k miernemu zvýšeniu anabolizmu chrupavky v krátkom čase a po 2 hodinách vedie k strate chrupavkovej tekutiny, ale nespôsobuje žiadne iné zmeny. Otázka, ako rýchlo chondrocyty reagujú in vivo na tento typ záťaže, zostáva nevyriešená.

Indukovaný pokles hydratácie s následným zvýšením koncentrácie proteoglykánov vedie k priťahovaniu kladne nabitých iónov, ako sú H ⁺ a Na ⁺. To vedie k zmene celkového iónového zloženia a pH ECM a chondrocytov. Dlhodobé cvičenie indukuje pokles pH a zároveň pokles syntézy proteoglykánov chondrocytmi. Je možné, že vplyv extracelulárneho iónového prostredia na syntetické procesy čiastočne súvisí aj s jeho vplyvom na zloženie ECM. Novo syntetizované molekuly agrekánov dozrievajú do agregovaných foriem neskôr v slabo kyslom prostredí ako za normálnych podmienok. Je pravdepodobné, že pokles pH v okolí chondrocytov (napr. počas cvičenia) umožňuje väčšiemu počtu novo syntetizovaných molekúl agrekánov dosiahnuť interteritoriálnu matricu.

Po odstránení záťaže sa voda vracia zo synoviálnej dutiny a prenáša živiny pre bunky. V chrupavke postihnutej osteoartrózou je koncentrácia proteoglykánov znížená, preto sa počas záťaže voda pohybuje nielen vertikálne do synoviálnej dutiny, ale aj v iných smeroch, čím sa znižuje výživa chondrocytov.

Imobilizácia alebo mierne zaťaženie vedie k výraznému zníženiu syntézy chrupavky a obsahu proteoglykánov, zatiaľ čo zvýšené dynamické zaťaženie vedie k miernemu zvýšeniu syntézy a obsahu proteoglykánov. Namáhavé cvičenie (20 km/deň počas 15 týždňov) u psov vyvolalo zmeny v obsahu proteoglykánov, najmä prudký pokles ich koncentrácie v povrchovej zóne. Došlo k určitému reverzibilnému zmäknutiu chrupavky a remodelácii subchondrálnej kosti. Silné statické zaťaženie však spôsobilo poškodenie chrupavky a následnú degeneráciu. Okrem toho strata agrekánu z extracelulárneho matrixu (ECM) iniciuje abnormálne zmeny charakteristické pre osteoartrózu. Strata agrekánu vedie k priťahovaniu vody a opuchu malého množstva zostávajúceho proteoglykánu. Toto rozpúšťanie agrekánu prispieva k zníženiu lokálnej hustoty fixného náboja a v konečnom dôsledku vedie k zmene osmolarity.