Embryonálne kmeňové bunky

Objav embryonálnych kmeňových buniek - vznikol nie náhodou, ale objavil sa na pripravenej pôde vedeckého výskumu v oblasti vývojovej biológie. Výraz "kmeňová bunka" sa zavádza do medicíny v roku 1908 na hematologické spoločnosti kongrese v Berlíne, Alexander Maximov aplikovaný na hemopoetických bunkách. Dlho pred izoláciu a prípravu stabilných línií pluripotentných embryonálnych kmeňových buniek v ranom vývoji výskumného procese použiť driek terato- (embryo-karcinomové bunky, s ktorou študoval neznáme mechanizmy embryogenézy, zahŕňajúci sekvenciu expresie skorých génov a proteínových produktov ich práce.

Ale je totipotencia ľudského genómu nenahraditeľne stratená v procese evolúcie? Nie a embryogenéza je dôkazom. Ak je to tak, potom, keď sa v zásade uskutoční druhá cesta evolučného vývoja? Pravdepodobne, keď osoba opustí vesmír, kde sú podmienky prostredia relatívne konštantné po dlhú dobu. Strata kostnej hmoty (kostnej demineralizácie v beztiažovom stave) veľmi pomaly prístupnejšie remodeláciu a regeneráciu môže byť považovaný za prvý krok k ľudskému adaptačného procesu ako druhu existencie v priestore. Platba za druhú cestu evolučného vývoja však bude iná - sterilita bude cenou, ktorá sa má splatiť všetkým bunkám, ktoré majú všelijnosť a absolútnu plasticitu. Takže množiť sa v tomto svete "evolučných chameleónov" nebude mať meiózu, otpochkovaniem. Ale budeme žiť dlho. Telomerasova nesmrteľnosť je nesmrteľnosť améby. V mnohobunkovom organizme sú kmeňové bunky substrátom kvantitatívnej a kvalitatívnej dlhovekosti.

[1], [2], [3], [4]

Zdroje embryonálnych kmeňových buniek

Dnes zdroje embryonálnych kmeňových buniek pre laboratórne testy línie myší s teratokarcinomem (129 / SV, F19, F8, Zin 40, CGR 86, R, CCE, JM-1, E14Tg2a, CGRSb) a ľudského teratokarcinomu (NTERA-2, Tera-2 , H-9 klon), rovnako ako Hess Trauneona. Avšak, prítomnosť podrobne bunkovú pas ukazuje imunitný fenotyp, výsledky analýzy chromozómu expresie profilu mRNA vystavených receptory a proteín intracelulárnu signalizácia nekompenzuje významné nevýhody teratokartsinomnyh linky HSV - rýchlej strate totipotencí a nemožnosť použitia v klinických štúdiách, a zmiešané diferenciáciu v kultúre, je veľmi ťažké izolovať čistú špecializovanú líniu z heterogénnej populácie buniek. Z tohto dôvodu, zvyčajne zdroj ESC linky vyrábané pre lekárske účely, slúži ako vnútorný bunkovej masy blastocysty, embryá jednotlivé blastoméra z 8-bunkovej fáze vývoja, bunky morula neskoršie štádia a primárne zárodočné bunky.

Treba poznamenať, že bunky teratokarcinómu, aj keď majú vlastnosť pluripotencie, majú v porovnaní s ESC významne nižší pluripotentný potenciál. Ich integrácia s embryonálnymi bunkami zriedkavo vedie k tvorbe chimér, v ktorých sa navyše nikdy nevytvárajú gaméty s genotypom buniek teratokarcinómu. Predpokladá sa, že to je spôsobené častým výskytom chromozomálnych abnormalít pri kultivácii teratokarcinových buniek: strata chromozómu Y, rozmanitosť trizómie, delécie alebo translokácie.

Pokusy o odlíšenie ľudskej ESC linky boli vykonané mnohokrát, ale táto úloha sa nedá vyriešiť, pretože normálne ľudské blastocysty sú ťažko prístupné k objektom. Okrem toho u ľudí je frekvencia chromozomálnych abnormalít vyššia ako u embryogenézy zvierat. Prevažná väčšina skorých ľudských embryí získaných po fertilizácii in vitro vykazuje chaotický chromozomálny mozaiizmus a často existujú numerické a štrukturálne odchýlky. Dokonca aj neskôr, v štádiu blastocysty, iba 20-25% ľudských embryí pozostáva z buniek s normálnym karyotypom. Bolo takmer nemožné použiť také embryá na vytvorenie ESC, keďže zygoty boli zvyčajne kultivované na štádiá dvoch alebo štyroch blastomérov a potom transplantované do maternice. Iba pomerne nedávno bola spoľahlivá technika vyvinutá na kultiváciu oplodnených ľudských ovulov do štádia blastocysty. Zavedenie tejto techniky do praxe in vitro fertilizácie nielenže zvýšilo frekvenciu úspešného výsledku implantácie, ale tiež urobilo normálne blastocysty dostupnejší objekt.

Ďalším zdrojom pluripotentných kmeňových buniek je primárne pohlavné bunky, ktoré, na rozdiel od vyspelejších populácií progenitorových germenativnogo epitel, nie sú na povrchu beta-integrínu, ale dochádza k tvorbe vysokej aktivity shelochnoy fosfatázu. Treba poznamenať, že v experimente bola populácia kmeňových buniek, ktoré boli vytvorené z primárnych pohlavných buniek, študovaná od 80. Rokov minulého storočia. Súčasne bola vyvinutá technika izolácie primárnych zárodočných buniek z rudimentu myšieho embryonálneho gonáda. Prvé neúspešné výsledky kultivácie primordiální zárodočné bunky in vitro naznačuje márnosť týchto snáh, ako bunky, aj keď prežil, ale nie množiť a zomrel počas prvého dňa. Neskôr sa zistilo, že myšie primárne zárodočné bunky reprodukujú in vitro iba v prítomnosti rozpustných a membránovo viazaných špecifických polypeptidových rastových faktorov v kultivačnom médiu. Početné štúdie ukázali, že je potrebné prítomnosť v živnej pôde nielen LIF, ale membrannosvyazannyh a ocele rozpustný faktor (SIF) pre prežitie a proliferáciu primordiálních zárodočných buniek. Tieto peptidy sú produkované somatických buniek embryí homozygotnou pre mutáciu z ocele, a jeden z nich je ligand preto-onkogénu cKIT.

Primárne zárodočné bunky cicavcov a ľudí majú extragonadálny pôvod a sú zdrojom klonálneho vývoja pohlavnej bunkovej línie. Štartová čiara primordiální zárodočné bunky, ako aj všetky tkanivá z embrya a extraembryonální mezodermu dáva epiblastu (primárna ektodermy) skorých embryí, ktoré majú mozaiky štrukturálnu organizáciu. Mikrochirurgické odstránenie rôznych častí skorého embrya vytvorilo lokalizačnú zónu v epibláte klonu sprostredkovaných prekurzorov primárnych zárodočných buniek. S rodamindekstrana, ktorý bol použitý ako bunkový marker sa zistilo, že prekurzory primordiální zárodočné bunky sú umiestnené v proximálnej oblasti epiblastu, v blízkosti extraembryonální ektodermy. Primárna sexuálna bunková línia vystupuje z 45-bunkového klonu, ktorý sa vyskytuje na samom začiatku gastrulácie. Potom dôjde k segregácii klonu a počas gastrulácie vstupujú primárne sexuálne bunky do extraembryonálneho mezodermu a nachádzajú sa v základni allantoidového pupku za primárnym pásom. Odtiaľ sa primárne zárodočné bunky migrujú smerom k ventrálnemu koncu endodermálneho endodermu a potom sa aktívne pohybujú cez mezenériu a na konci migrácie populujú genitálne valčeky. V procese migrácie, rovnako ako v prvých 2 - 3 dňoch lokalizácie v gonadovej rudente, primárne sexuálne bunky aktívne proliferujú a podstupujú osem replikačných cyklov. Ak je na začiatku migrácie asi 50 primárnych zárodočných buniek, v reprodukčných cystoch myšieho embrya s 12-dňovým vývojom počet primárnych pohlavných buniek presahuje 25 000.

Funkčné podobnosť HSR a primordiálních zárodočných buniek ukazuje úplnú integráciu druhej v náhradnej blastocysty vnútornej bunkovej hmoty a následné úplné vývoj embrya, tkanivá, ktoré sa skladajú iba z potomkov primordiální zárodočné bunky. Podľa ďalších charakteristík boli tiež identické myší primárne zárodočné bunky PGC, ukazujúci schopnosť diferenciácie do rôznych smerov, pre vytvorenie embryoidních teliesok in vitro, A in vivo tvorí teratomy pri aplikovaný podkožne do imunodeficientných myší pripomínajúcich spontánny teratomů semenníkov myší línie 129 / ter.

Je zistené, že po pridaní do LIF média, a rozpustné membrannosvyazannogo SIF izolované primárne zárodočné bunky, 8-dňový myšou embryá prežiť a proliferáciou v kultúre po dobu 4 dní, ale potom smrti. Okrem toho je doba, kedy kultúra smrti pozorované primordiální zárodočné bunky, sa zhoduje s fáze vývoja myších embryí (12,5-13,5 dni), keď púčiky primárnej gonadálnej ženy zárodočné bunky vstúpi meiosis a v samčích primordiálních zárodočných buniek sú blokované mitotickými delenie. Avšak, ak sa pridať k životnému prostrediu nielen rastové faktory LIF a SIF, ale i FGF2, sú primárne zárodočné bunky pokračovať proliferirovat a subkultúry, kedy sa vytvorí kolónia môžu množiť aj po vybratí z prostredia rastových faktorov (SIF a FGF). Takéto bunky môžu byť dlhodobo kultivované na embryonálnom fibroblastovom substráte bez pridania rozpustného rastového faktora LIF. Tieto stabilné bunkové línie odvodené z primárnych zárodočných buniek, o ktorých sa predpokladalo, že sa nazývajú embryonálne zárodočné bunky. Tento termín nemôže byť považovaný za úspešný, ako keď kultivované EG-bunky nemôžu byť získané embryonálne zárodočné bunky, ktoré sú schopné vykonávať následných fáz oogenéza alebo spermatogenézy. To je spôsobené skutočnosťou, že EG-bunkové línie, aj keď sú odvodené z primordiálních zárodočných buniek, ale v kultúre získanie vlastnosti pluripotentných embryonálnych kmeňových buniek strácajú schopnosť spáchania germenativnye linku. Inými slovami, primárne zárodočné bunky počas kultivácie strácať svoje vlastnosti gaméty transformované do prekurzorov a HSV-ako pluripotentných buniek.

Je potrebné poznamenať, že keď sa podávajú imunogénne myši EG, nezískavajú sa teratómy. Predpokladá sa, že strata schopnosti ľudských EG buniek iniciovať teratómy je spôsobená skutočnosťou, že tieto línie neboli vytvorené priamo z kultivovaných primárnych zárodočných buniek, ale boli získané z buniek izolovaných z embryoidných teliesok. Preto je možné, že sú potomkami pluripotentných, ale už spáchaných buniek.

Treba poznamenať, že existujú zásadné rozdiely medzi bunkami EG a primárnymi zárodočnými bunkami. Tieto neumožňujú získať chimérne myšie embryá, čo naznačuje nedostatočnú schopnosť primárnych zárodočných buniek integrovať sa do vnútornej bunkovej hmoty alebo trophektodermu. Charakteristiky populácie primárnych pohlavných buniek sú viac podobné zodpovedným líniám somatických buniek neskorších embryí, ktorých zavedenie do blastocysty tiež nevedie k tvorbe chimérnych embryí.

Modifikácia metódy kultivácie embryoidních teliesok získaných s EG-agregáciou buniek povolených selekciou na selektívnych médiách prijímať ďalšie populácie pluripotentných buniek, nazývané "bunky odvodené z embryoidních teliesok (embryoidních tela odvodených buniek - EBD-bunky). Schopnosť buniek EBD dlhodobo sa množiť v kultúre umožnilo vytvoriť stabilné bunkové línie viazaných buniek. Boli získané klony buniek exprimujúcich široké spektrum mRNA a proteínových markerov špecializovaných buniek. Tento prístup ako výsledok sa ukázalo, že primárne pohlavné ľudských pluripotentných buniek a diferenciáciu in vitro do rôznych bunkových typov: neuróny, glie, vaskulárne endotel, hematopoetických buniek, svalov a endodermální buniek.

Alternatívne zdroje embryonálnych kmeňových buniek

Alternatívnym zdrojom ľudských ESC línií môžu byť hybridné bunky. Implantáciu do maternice pseudopregnantních kravského geterogenomnoy získané štruktúry pri zlučovaní elektroporácie fetus ľudských somatických buniek s vaječných kráv, ktoré predtým boli odstránené z pronukleu, umožňuje prijať vnútorné bunkovej hmoty vopred implantáciu embrya umelých vývojových štádiách. Za týmto účelom sa v prvom stupni sa získa z blastocysty vajcia kravy s transplantovanými ľudskými bunkami jadra.

V druhom štádiu je embryoblast extrahovaný z blastocysty a z neho - ESC podľa Thomsonovej metódy. Je pozoruhodné, že najlepšie výsledky v separačných ESC línií podľa tohto spôsobu boli získané za použitia jadrá folikulárnych buniek alebo primordiálních zárodočných buniek, ktoré pretrvávajú v ľudskom tele v stave režimu spánku. To je spôsobené skutočnosťou, že vajcia kravy transplantované ľudské bunky jadro neukorochennye by mal mať vysokú aktivitu a telomér telomeazy, ktorý sa vyhýba predčasné starnutie ESC klony odvodené z hybridného vajcia (Repin, 2001). Je známe, že najdôležitejšie intracelulárne signálne proteíny PGC sú OCT3, Oct4, Tcf, Groucho, ktoré patria do tzv tlmiče, chromatínu proteíny. Tlmiče poskytujú obzvlášť kompaktné balenie heterochromatínu, ktoré zabraňuje tvorbe slučiek euchromatínu. Balíček chromatínov sprostredkovaný týmito proteínmi koreluje s celočivotnosťou genómu ESC. Doteraz sa zistilo, že zrelé vajíčka dobytka a ľudí sú jediným typom špecializovaných buniek obsahujúcich vysoké koncentrácie tlmiacich proteínov v cytoplazme. Na tomto základe bola vyvinutá metóda na výrobu hybridných ESC prenosom jadier somatických buniek na nejadrové ovuly kráv. Predbežné štúdie in vitro ukázali, že cytoplazma oocytov kráv obnovuje totipotencí genóm ľudských somatických bunkových jadier po 12-24 hodinách kultivácie.

Osobitne zaujímavé sú údaje o vlastnostiach preimplantačného vývoja ľudských embryí, ktoré naznačujú neskoršiu náhradu totipotentných buniek populáciou pluripotentných buniek ako u myší. Štúdium bunkových transformácií ukázalo, že bunky vnútornej bunkovej hmoty ľudského blastocystu okrem ESC tiež vytvárajú trofoblastové bunky, čo naznačuje ich celkovú potenciu.

Je známe, že v štádiu blastocystu existujú dve odlišne spájané bunkové populácie. Jednou z nich je vonkajšia vrstva blastocystu, trofektodermu, odvodeného z trofoblastových buniek a iných zložiek embryonálnej placenty. Druhá populácia buniek je zoskupená do hustej hmoty, ktorá sa dotýka vnútorného povrchu trophectodermu. Bunková populácia vnútornej bunkovej hmoty pochádza zo všetkých tkanív a zárodkov embryonálnych orgánov. V štádiu neskorého blastocystu sa z vnútornej bunkovej hmoty vytvorí extra-embryonálny endoderm a vytvorí sa epiblast (primárny ektoderm). Súčasne epiblastové bunky zachovávajú pluripotenciu, zatiaľ čo schopnosť diferencovať bunky extratermálneho endodermu je obmedzená.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]

Získanie ľudských embryonálnych kmeňových buniek

Až do nedávnej doby sa verilo, že trofoblastu získali z hESCs nemožné. Avšak diploidný línia trophectoderm kmeňové bunky izolované z blastocysty v médiu, ktoré obsahuje, namiesto toho, LIF a FGF2 heparínu, šíri a je transformovaný do kmeňových buniek. Ak máte odstrániť zo svojho stredu FGF2 sa trophectoderm bunky prestanú chov, začnú endoreduplikace chromozómov a bunkových elementov trofektodermalnye postupne premenená na obrie trofoblastu. Pravdepodobne, LIF nestimuluje proliferáciu trophectoderm buniek vzhľadom na to, že FGF2 spúšťa mechanizmus transsignalizatsii ako FGF2, väzbu na cytoplazmatickej receptor (FGFR2), kinázy MAP v cytoplazme - ERK1 a ERK2. V dôsledku toho, keď je začlenený do buniek blastocysty jednej signálnej dráhy (LIF - gpl30 - AKO kinázy - STAT3) bunky vnútornej bunkovej masy sú transformované na pluripotentné hESCs, pričom aktivácia druhého mechanizmu transmembránového signalizácia (FGF2 - FGFR2 - MAP kinázy ERK1 / ERK2) kmeňové bunky v blastocysty trophectoderm vytvorené. Voľba signálne dráhy, zase závisí od aktivity génu Oct4. Tento gén patrí POU doména, ktorá sa nachádza v lokuse t 17 autozomů a je exprimovaný počas oogenéza, v drvenie období, rovnako ako v bunkách vnútorný bunkovej masy blastocysty, a v prvotných zárodočných buniek. Funkčné role Oct4 gén kódujúci transkripčný faktor nevyhnutný pre vznik pluripotentných buniek, ich diferenciáciu a dediferenciace.

Expresia génu oct4 v ESC sa mení v závislosti od interakcie tohto transkripčného faktora s kofaktormi. Smerová regulácia expresie oct4 v blastocystoch ukázala, že ak sa jeho aktivita znižuje, polovica buniek tvorí trophektoderm, zatiaľ čo s nárastom indukovanej expresie okt4 prevažne dochádza k ESC.

V experimente, ESC nemožno preložiť do radu kultiváciou totipotentné blastoméra štiepenie fáze a vo fáze gastrulation a neskorších štádiách embryonálneho vývoja. Myš HSR zvyčajne prideliť na 3,5-4,5 dňoch gravidity, čo zodpovedá šiestej (jednej vrstvy blastocysty) a siedmej stupňoch (dvojvrstvových blastocysty - ranne vajcia valec) normálne embryogenézy. Je zrejmé, že len v preimplantačnom období embryá myší obsahujú bunkové populácie, ktoré sa môžu transformovať na ESC. V dôsledku toho je izolácia liniek ESC možná iba v určitých štádiách embryogenézy. Totipotent, pokiaľ ide o príležitosti pre rozvoj životaschopného embryá zo zárodočných obalov a placenty sú zygota a vznikajúce pri drvení blastoméra. Strata celkovej potencie zárodočných buniek začína v štádiu neskorého morula, kedy ďalšie rozdrvenie blastomérov závisí od ich polohy. Rané morula blastoméra udržať totipotencí ako experimentálne manipulácii sa mení ich umiestnenie, ako je inverzia ich umiestnenie, nebráni rozvoju vysoko kvalitné embrya.

Zistilo sa, že účinnosť uvoľňovania ESC v línii je ovplyvnená stavom blastocyst v čase ich explantácie. Použitie blastocysty po sedemdňovej simuláciu diapauzy v genitálnym trakte myší, s odobratými vaječníkmi na 3,5 dňa gravidity a liečených progesterónom a prispieva k úspešnej oddeleniu línií embryonálnych kmeňových buniek. Predpokladá sa, že za takýchto podmienok sa zvýši počet blastomérov tvoriacich vnútornú bunkovú hmotnosť. Je tiež možné, že bunkový cyklus sa rozširuje a väčšina blastomérov prechádza do fázy G0.

Okrem toho je vytváranie stabilných pluripotentných embryonálnych kmeňových buniek línií závisí od genotypu embryá: pomerne ľahko rozlíšiť od HSR myšiach blastocysty vedenie 129, je podstatne ťažšie je získať za použitia myší CS7BL / 6 a prakticky nemožné izolovať riadok z hESCs blastocysty CBA / Ca myšou. Je zrejmé, že skoré embryá majú niektoré genetické vlastnosti, ktoré ovplyvňujú vývoj pluripotentnej línie ESC. Avšak, keď sú kultivované epiblastu izoláciou, rovnako ako selektívny výber diferenciačný bunkové línie hESCs z skorých embryí CBA / Ca myši boli doteraz pridelené.

Osvedčená štandardná technika na získanie ESK línie z blastocystov je uvedená v laboratórnych príručkách o technike experimentovania s skorými embryami. Experimentálne línie ESK možno tiež získať kultiváciou izolovaného epiblátu (primárny ektoderm) 4,5 dní myších embryí s pomerne zložitou mikrochirurgickou technikou a modifikovanými kultivačnými podmienkami. Zložitosť tohto postupu je odôvodnená, pretože frekvencia tvorby ESC línii bola oveľa vyššia ako pri práci s vnútornou bunkovou hmotou blastocysty.

Na izoláciu liniek ESC sa každý klon prenesie do mikrotitračnej jamky, množí sa zhruba 40 až 60 buniek, opäť sa rozptýli. Niekoľko opakovanie tohto postupu umožňuje získať imortalizované línii ESK maximálnych rýchlosti proliferácie normokariotipnyh buniek naviazaných na plastu, ktorý priechody 50-100 udržanie totipotencí a vysokú telomerasovou aktivitu. V procese podporné línia ESC najväčšie nebezpečenstvo je, že znečistenie alebo sérové bakteriálne endotoxíny - aj stopy koncentrácia endotoxínu v živnej pôde spôsobil masové smrť nezrelých zárodočných buniek. Pri starostlivom riadení lineárneho rastu a včasné disperzie HSR v kultúre sú schopné symetrického štiepenie, v ktorom obaja dcérske bunky zostávajú pluripotentné a je schopný vykonávať neobmedzený počet bunkových cyklov, udržuje diploidný karyotyp a celkovú účinnosť.

Výber čistej populácie ľudských ESC sa môže uskutočniť po transfekcii molekúl rekombinantnej DNA obsahujúcich gén kódujúci syntézu zeleného fluorescenčného proteínu (GFP) do ich genómu. Expresia GFP sa zvyšuje s rastúcou HSR v prostredí podporujúcom ich proliferáciu, zatiaľ čo začiatok diferenciácie úrovne génovej expresie znížená, čo umožňuje, vybraných na selektívnom médiu čistých stabilných pluripotentných bunkových línií. Keď sa kultivuje selekcia ESC v GFP, frekvencia kolónií sa značne zvýši, pretože v podmienkach selekčných plodín sa eliminuje silný antiproliferatívny účinok diferencovaných buniek.

Preklad ľudských embryonálnych kmeňových buniek, v súlade prostredníctvom spôsobe ich izolácie preimplantačných embryí (krok 80-120 bunky), ktoré zostávajú po in vitro fertilizácia postupu v. Za týmto účelom sa umelo získané "nadbytočné" embryá mechanicky dispergujú v prostredí Delbecco-Needle. Po označení buniek selektívnymi monoklonálnymi protilátkami s fluorescenčnou značkou sa izolujú bunky embryoblastu. Embryoblast sa disperguje do jednotlivých buniek pomocou zmesi disaspázy-kolagenázy. Disociované bunky boli pestované v špeciálnom médiu (80% Delbekko strednej + 20% fetálneho teľacieho séra v prítomnosti 500 ug / ml IL-6, LIF a VVP) na monovrstvě embryonálnych fibroblastov podávač 3 prvej pasáže. V tomto prípade je prežitie a proliferácia kmeňových a progenitorových buniek podporovaná expozíciou IL-6, LIF a SCF. V takomto prostredí ESC rastú pomocou klonov suspenzie nezasadených škrabaných buniek, ktoré musia byť disociované jemným viacnásobným pipetovaním. Nové klony sa objavujú v pozastavenej kultúre 5. - 7. Deň. Maximálna rýchlosť rastu ESC sa dosiahne opakovanou disociáciou klonov v štádiu 10 až 15 buniek. Potom sa každý klon prenesie do mikrobunky a rozvinie sa na agregát 40 až 50 buniek. Postup sa opakuje mnohokrát v pasážach, čím sa zvyšuje objem kultivácie na hustotu 5 až 10 miliónov buniek na 6 cm šálku. Použitím takejto Thomson pasážovania bol izolovaný 10 klony imortalizovaných ľudských HSR ktorý priechody 100 si zachovávajú vysokú telomerasovou aktivitu, schopnosť intenzívne proliferáciu a fenotypových charakteristík minimálnu celkovú účinnosť, s diferenciáciou v niektorom z 350 špecializovaných bunkových línií, ktoré sú odvodené bez-, mezo- - a endodermu. Diferenciácia ľudského ESC začal (pri zmene stredné, pridanie a odstránenie séra LIF) s prichytenie buniek k podkladu, čo ukazuje vývoj cytoskeletu a expresie adhéznych receptorov. Je dôležité, aby sa pri neobmedzenom šírení ľudských ESC zachoval normálny karyotyp.

Druhý spôsob izolácie ľudských ESC línií je založený na použití primárnych pohlavných buniek. Experimentálne štúdie ukázali, že Eu-bunkové línie je možné získať z genitálnych plátov embryí myší starších 12,5 dní. Avšak v týchto prípadoch bola frekvencia tvorby progenitorových bunkových línií signifikantne nižšia ako pri pokusoch s predchádzajúcimi embryami. Zároveň primárne pohlavné bunky z gonád myších embryí 13,5-dňového gestačného veku sú všeobecne neschopné transformácie do línie.

Prvé stabilné línie pluripotentných ľudských EG buniek sa získali z primárnych gonocytov izolovaných z pohlavných pupek embryí starých 5 až 9 týždňov. Izolované bunky boli kultivované na podklade inaktivovaných myšiach embryonálnych fibroblastov v médiu DMEM s fetálnym sérom, ku ktorej sa pridá mercaptoetanolu, Forskolin, rovnako ako rekombinantné ľudské rastové faktory (FGF a LIF). Po 7 až 12 dňoch sa v kultúre objavili mnohobunkové kolónie podľa morfologických znakov a molekulárnych markerov zodpovedajúcich ľudským EG bunkám. Po agregácii tieto bunky vytvorili embryoidné telá, ktorých ďalší vývoj sa objavil v špecializovaných bunkách, charakteristických pre deriváty všetkých troch embryonálnych listov. V priebehu 10 až 20 pasáží zachovali EG bunkové línie normálny karyotyp a nestratili pluripotenciu.

Ukazuje sa tiež, že kombinovaný účinok LIF, membránovo viazaných a rozpustných oceľových faktorov, ako aj TGF-b, modifikuje program na vývoj primárnych zárodočných buniek. Namiesto zastavenia mitotických rozdelení a začiatku diferenciácie voči oogenéze alebo spermatogenéze sa primárne pohlavné bunky ďalej proliferujú. Po niekoľkých ďalších mitotických cykloch sa stávajú podobnými epiblastovými bunkami a stratou vlastností prekurzorov zárodočných buniek sa transformujú na pluripotentné embryonálne kmene EG buniek.

Takže v roku 1998 boli imortalizované línie primárnych sexuálnych buniek najskôr izolované z pohlavného rudimentu tkaniva ľudského plodu. Embryogenézy ľudských zárodočných buniek primárnych objaví v žĺtkového vaku v treťom týždni vývoja a na 4-5th týždňov, tieto bunky migrujú do oblasti sexuálneho nádoru, kde tvorí populáciu primárnych dormantnye gonocytes. V neaktívnom stave zostávajú primárne zárodočné bunky v očiach až do narodenia. Primárne zárodočnej bunkové línie boli získané z plodových genitálneho hrbolčeka 5-9 týždňov starých embryí získaných ex tempore tkanina, ktorá sa nechá reagovať so zmesou kolagenáza typu IV-V, hyaluronidázy a DNázy pre kvantitatívne a kvalitatívne výťažok zvýšenie buniek. Primárne zárodočné bunky v tkanivách tuberkulózy plodových pohlavných orgánov sú obklopené stromálnymi (mezenchymálnymi) bunkami Sertoli. Funkčné účel Sertoliho buniek je výroba antiapoptotických faktorov (Fas ligand), mitogény, a imunosupresívne činidlá, ktorá chráni sexuálne kmeňových buniek z imunitného napadnutia tela. Okrem toho stromálne mikroprostredie genitálneho tuberkulu hrá dôležitú úlohu pri dozrievaní gamét. Izolované primárne zárodočné bunky sa vysádzajú v kultúre cez feedernú stromálnu vrstvu pozostávajúcu z fetálnych fibroblastov prvých troch pasáží. Najúčinnejšou kombináciou mitogénov je komplex pozostávajúci z LIF, FGF a forskolínu (stimulant na tvorbu cAMP). Proliferačnej primordiální zárodočné bunky in vitro vyžadujú pridanie fetálneho séra, v prítomnosti primárnych reprodukčných gonocytes v kultúre klonov sprevádzané tvorbou globulárnych, non-adherentních buniek k podkladu.

Americká National Institutes of Health na základe zhrnutie existujúcich informácií o spôsoboch pridelenie ľudských línií HSS z blastocysty bol vykonaný predbežný záver, že úspešné pridelenie ESC je s najväčšou pravdepodobnosťou pri kultúrnych a spoločenských blastocysty s dobre vytvoreným embryoblast (Kmeňové bunky: vedecký pokrok a budúce výskumné smery Nat. Inst, Health USA). Z tohto hľadiska je najlepším zdrojom HSR k vytvoreniu linky sú ľudské blastocysty 5. Deň vývoja, ktorého pridelenie vnútorné bunkovej hmoty, by mal byť starostlivo odstránené trophectoderm. Izolované vnútorné bunková hmota sa skladá v tomto štádiu 30-35 buniek musí byť kultivované na substráte embryonálnych fibroblastoch myší, čo je rozhodujúcou podmienkou pre tvorbu kolónií v živnej hESCs.

Analýza fenotypových vlastností embryonálnych kmeňových buniek

Jednoznačný záujem interspecies porovnávacia analýza fenotypových vlastností ESC. Bolo zistené, že ľudské ESC kolónie - husté zhluky vyrovnaných epiteliálnych buniek, zatiaľ čo myši embryoidních teľa sa skladajú z voľnej konglomerátu zaoblených buniek. V ľudskej indexe ESC plazme pomer jadrová je nižšia ako v myšiach HSR. Opičí embryonálne kmeňové bunky tvoria plochý kolónie viac zubaté buniek. V skorých klonoch primátov ESC sa jednoducho pozorujú jednotlivé bunky. Množiacich hESCs všetky druhy zvierat nevyjadrujú MHC triedy I a II. V rovnakej dobe, ľudské HSR poskytnúť pozitívnu odpoveď na protilátky TERA 1-60 a GCTM-2, ktorý ukazuje na prítomnosť na povrchu keratín / chondroitín sulfát proteoglykánmi, charakteristické pre embryonálny (teratomy) -kartsinomnyh kmeňových buniek. Expresie v hESCs všetkých druhov zvierat Oct4 génu naznačuje, že aj napriek fenotypové rozdiely v ľudských a myšiach HSR, zrejme podľa rovnakej sady génov zodpovedných za udržiavanie pluripotence (Peru, 2001). Okrem toho vedenie ESC odvodené z embryonálnych potkanov, ošípaných, králikov, primátov, a dobytok, majú podobné morfologické charakteristiky, podobný súbor molekulárnej identifikáciu markerov a takmer totožný molekulárnej mechanizmus pre realizáciu programu embryogenézy, ktorý umožňuje, aby sa nový pohľad na problematiku xenotransplantácie ,

Na rozdiel od normálneho embryogenézy in vivo, in vitro proliferáciu hESCs nie je sprevádzaná tvorbou zárodočných vrstiev, a pokračuje do bloku Homeotické Nohgenov pozadí, to znamená, bez organogenézy. Vzhľadom k tomu, segmentácie gény nefungujú v kultúre hESCs nemožno reprodukovať také obdobie embryogenézy ako karta somit segmentácie jadra, tvorbe žĺtkového vaku, allantois provizórne a ďalších orgánov a tkanív. Kultúry ESC boli zmrazené na začiatku tvorby 350 reštrikčných línií špecializovaných buniek. Tak, klon pomocné progenitorové bunky a centrálne lokalizované PGC sú Model embryo počas vývoja, v ktorom sú rôzne regióny tkanivá vytvorený v jednom stupni sa líši od špecializovaných buniek odvodených však z bežných prekurzorov. Aj keď minimálnej úrovni receptorov na povrchu hESCs, si zachovávajú schopnosť vykonávať primitívne morfogenetické procesy simulujúce väčšinu štruktúry raného embrya v suspenzii hESCs v kultúre a kameniva tvorí štruktúru pripomínajúce blastocysty alebo dokonca vyšší embrya (vaječné vojne). Také suspenzné agregáty boli vhodne nazývané jednoduché a komplexné embryoidné telieska.

V zmesi diferencovať do rôznych buniek embryoidních tela súčasne exprimovaných gény včasnej ektodermy (OCT3, FGF-5, nodálny), endoderm (gata-4), mezodermu (Brachyura), kardiogénny mezodermu (PKH-2,5), neurálnej trubice (msx3 ) a hematopoézu (elkf). Pomocou rôznych kombinácií cytokínov a rastových faktorov pre cielenie tvorbu zárodočných vrstiev buniek in vitro v mnohých prípadoch bolo možné získať embryoidních teliesok, ktoré boli s výhodou exprimovaných génov ektodermy alebo mezoderm, ktorá otvára cestu k modelovanie gastrulation a skorej fáze organogenézy.

Klonální rast hESCs je dôkazom asymetrického bunkového delenia, v ktorom iba jeden zo ESC v stredovej klonu zachováva neobmedzujúce schopnosť reprodukcie, zatiaľ čo druhá dcérska bunka vedie k vytváraniu progenitorových buniek, diferenciácia je už dovnútra. Preto je miera násobenia klonu na obvode embryoidného tela vyššia ako v strede. Okrajové bunky rastúce klon podstúpi spontánna diferenciácia disordered migrovať alebo zomrieť apoptózy mechanizmy. Tieto udalosti určí osud klonu v prípade, že rýchlosť šírenia vyššia ako rýchlosť migrácie a apoptotické bunkovej smrti, klon veľkosti aj naďalej zvyšovať, stabilizáciu dochádza s rovnakou apoptózy a rýchlosť tvorby nových rýchlosti buniek, regresia - obrátenom pomere týchto procesov. Progenitorové bunky sa delia symetricky, to znamená, že obe dcérske bunky sú ďalej diferencované do zrelých špecializovaných bunkových línií. Pomer ESC / progenitorových buniek sa líšia, ale je vždy počet kontaktných miest, je len zlomkom jedného percenta populácie progenitorových buniek. Preto iba opatrné pipetovanie a včasné rozčlenenie klonov môže zvýšiť počet kultúr ESC v kultúre. Aby sa dosiahol maximálny výťažok ESC, najúčinnejšie bolo rozdelenie klonov v štádiu 10-12 buniek. Smer a stupeň diferenciácie buniek v embryoidnom tele závisí od ich polohy. Vonkajšie embryoidních tela bunky neexprimujúcich gén a Oct4 podstúpiť diferenciáciu primárnych endoderm buniek, z ktorých následne vytvorených epiteloidní bunky a parietálnej extraembryonálních viscerálny endoderm. Vnútorné bunky embryoidného tela exprimujú gén oct4 a udržujú pluripotenciu počas 48 hodín kultivácie. Ale potom morfologické reorganizácie sa vyskytuje v epitelových monovrstva buniek začína a expresiu génov, ktoré riadia vývoj primárneho ektodermy. Ďalej je proces celkového neusporiadaného cytodiferenciační začína s výskytom rôznych typov buniek, ktoré sú deriváty všetkých troch zárodočných vrstiev. V procese spontánna diferenciáciu embryoidních telesných buniek najprv vznikajú agregáty, endoderm markery vo forme fragmentov (cysty) žĺtkového vaku. Ďalej sa v týchto štruktúrach objavujú angioblasty a endotelové bunky rastúcich kapilár. V záverečnej fáze spontánna diferenciácia vnútorných buniek embryoidních tela vyvíja rôzne terminálne diferencované bunky, vrátane neurónov, gliových prvky, kardiomyocytov, makrofágy a erytrocyty. V určitom priblíženia (s ohľadom na priestorové inverzii listov tvoriacich embryonálny tkaniva) cez embryoidních teliesok in vitro môže skúmať morfogenetické procesy a analýzu molekulárnych mechanizmov embryonálny cytodiferenciační počiatočného obdobia, a stanoviť úlohu špecifických génov pri vykonávaní týchto procesov.

V klone sú teda bunky, v ktorých sú objavené rôzne programy genetického vývoja - ESC, skoré progenitory a diferenciačné progenitorové populácie. Kultivácia ESC metódami klesajúcej kvapky alebo masovej kultúry bez feederovej vrstvy a bez pridania LIF do média nevyhnutne vedie k tvorbe embryoidných telies. Morfológia buniek vonkajšej a vnútornej vrstvy embryoidných telies je odlišná. Vonkajšia vrstva pozostáva z veľkých procesných buniek. Ich povrch, obrátený k životnému prostrediu, je pokrytý mnohými mikrovilmi. Vonkajšia vrstva buniek je oddelená od vnútornej bazálnej membrány pripomínajúcej membránu Reichert, zatiaľ čo bunky vnútornej vrstvy embryoidných telies sú valcovité epitel. Morfologicky, vnútorná vrstva, hoci obsahuje veľa deliacich buniek, viac pripomína nediferencované ESC kolónie.

Vlastnosti ľudských embryonálnych kmeňových buniek

Absencia parenchymálnych-mezenchýmových interakcií na pozadí signál blokujúce gény homeosis spôsobuje neusporiadanú rast PGC v kultúre, pretože táto karta je prerušené a tvorbu infraštruktúry provizórne orgány. Neorganizovaná rast a neusporiadaný spontánnej diferenciácii hESCs v kultúre v dôsledku nedostatku mezenchýmových značenie stromálny rámec budúcich orgánov: in vitro, je možné, že tvorba miliónov hepatocytov, ale nemôže dostať žiadne segmenty pečene, vrátane takých štruktúrnych a funkčných prvkov, ako sú napríklad dutín, priestoru Disse a Kupfferových buniek.

Má sa za to, že pluripotence HSR realizovaný výhradne v embryogenézy tvoria tkanivá a orgány embryá, zatiaľ čo pupočnej šnúry a placenty sú odvodené trofoblastu. Zatvorený v plášti trofektodermalnuyu ESK dôsledne generovať klony provizórne realizáciu vývojový program kombinačné mRNA hromadnej Nohteyaov topografické matrice, ktoré predurčujú priestorového usporiadania, tvar, rozmery, počet priebežných a konečných orgánových buniek a montáž parenchým do štruktúrny a funkčné jednotky. Zároveň ESC sa ako jediné bunky, v ktorých molekulárnej mechanizmus realizácii ich potenciálu úplne oddeliť od genetického programu vývoja a poskytovatelia energetických služieb sa zbavená možnosti interakcie s ostatnými bunkami v dôsledku zablokovania oboch vnímania receptorov a transsignalizatsii systémov. Avšak zodpovedajúce aktivačné otáčok má za následok postupné nasadenie embryogenézy programu koncového narodenia je kompletne vytvorená a pripravená k životu extrauterine organizmu zložené z miliárd buniek. V tomto krátkom čase, ale nepredstaviteľné dlh v bunkovom priestore cesta nevyhnutnému výskytu chýb v molekulárnych mechanizmov, ktoré poskytujú dôležité funkcie buniek, a programov, ktoré riadia ich proliferáciu, diferenciáciu a špecializáciu. Preto sa v moderných farmakogenomika posudzovať oddelene ochorení molekulárnych zariadení a programovanie bunkovej ochorenia. A pôsobenie väčšiny nových liekov zameraných na korekciu názov programu diferenciácie, proliferácie a organogenézy, rovnako ako regeneráciu orgánov a tkanív. V dospelom organizme cez HSR sa stane možné riadiť správanie kmeňových / progenitorových buniek transplantovaných do mozgu, pečene, sleziny, kostnej drene a ďalších orgánov ľudského oprava poškodenej príjemcu parenchymálnych orgánov kvôli odlišnosti a špecializácie darcu mezenchymálnych buniek konzervovaných matice. V podstate, totipotencí Program začína ďalšiu oocytov genómu úrovne, zygoty a blastoméra, ale tieto bunky ešte nie je možné klonovať a pasážovania v množstvách nutných pre potreby experiental a praktické medicíne. Preto je ESC je jedinečným zdrojom genetickej informácie, ktorá obsahuje trojrozmerný lineárny reštrikčné mapu embrya a kódy špecializovaných bunkových línií počas gastrulation.

Prakticky neobmedzené možnosti regeneračného regulátora s ohľadom na skutočnosť, že ich genómu, na rozdiel od genetického aparátu diferencovaných somatických buniek, udržuje pluripotence. Jedným prejavom nečinnom stave korene v HSR genetickej informácie je tzv minimálna fenotyp - na povrchu HSR vyjadrenie obmedzený počet receptorov, a teda nasadený len veľmi málo programov pre interakciu transsignalizatsii jadrovej aparát bunky s jeho mikroprostredia. Na pozadí hibernácie génov zodpovedných za obmedzenie špecializovaných bunkových línií a diferenciácie buniek, aktivuje iba asi 30 500 génov, ktorých produkty poskytujú komunikačné bunky s okolitou mikroprostredie. Za použitia metódy sériovej analýzy génovej expresie je znázornené, že všeobecnosť hlavné funkčné genóm krabíc regulujúcich energiu a metabolizmus v somatických bunkách a HSR v poslednom určenom extrémne nízke množstvo mRNA receptorov, G-proteínov, druhých poslov, transkriptázy, kofaktory expresiu a represiu to znamená, že celý systém transmembránový regulačný signál do bunky. To je vzhľadom k nedostatku alebo veľmi nízku expresiu génov transsignalizatsii. Počas diferenciácie indukované v genóme ESC 18 zastavení prevádzky synchrónne funkčné gény pre pozadie aktivácie transsignalizatsii 61 génu, ktorý riadi syntézu bunkových adhéznych receptorov, zložky extracelulárnej matrice, obmedzenie transkriptázy messendzhernyh prvky a vysielanie signálu systému pre jadrového bloku s plazmou receptory bunkovej membrány. Súčasne blokovaná expresie génov zodpovedných za syntézu proteínov tlmičov hluku, ako aj génovú expresiu koingibitorov poskytuje totipotencí genómu hESCs.

Genetické markery boli nájdené pre bunky všetkých troch embryonálnych letákov. Identifikácia ektodermální vrstva buniek vykonáva na expresiu génov uzlové, OCT3 a FGF-5, mesodermálních bunky - gén Brachyura, zeta-globínu, endoderm - na gata-4 expresie génu. V normálnom embryogenézy, počas gastrulation pozorovaná aktívnej migráciu nezrelých populácií kmeňových a progenitorových buniek, lokálne označenie oblasti tvárových kostí lebky, niektoré časti mozgu, periférneho nervového systému, srdcový systém a týmusu tkanív, ktoré sú tvorené z klonov posunutá buniek. Označovanie buniek skoré gény zárodočné vrstvy uľahčuje topografického analýzu migrácie progenitorových buniek vo vyvíjajúce sa embryo. Je zistené, najmä to, že bunky v agregáty embryocarcinoma P19 expresie prvého génu mesoderm brachyura začína počas redukcie génovej expresie tkanivového plasminogenového aktivátora, a-fetoproteínu, keratínu 8 a keratínu 19, ktoré sú markery čoskoro mesodermální premenlivých zásob. V dôsledku toho je tvorba tkaniva mesodermálního pôvodu začína až po procese migrácie a usadzovaniu bodových mesodermální progenitorov.

Pri extrémne obmedzenými funkciami fenotypu a neprítomnosti väčšiny blokov transsignalizatsii HSV však má niektoré receptorové molekuly, ktoré môžu byť použité pre ich identifikáciu. Je pozoruhodné, že tieto antigény sú markery ESC u ľudí a primátov boli bežné. Najčastejšie sa používa pre označovanie hESCs značených protilátok na antigény membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (unikátne lipidovej antigény ako komplexnú glykolipidy GL7 s sialovej kyseliny), rovnako ako vysoké polyméry glykoproteíny TRA-1-81, TRA-1-60. Ďalej hESCs exprimovali špecifické embryonálny antigén SSEA-1 a endogénne alkalickej fosfatázy, rovnako ako špecifický transkripčný faktor Oct4. Ten je potreba pre udržanie proliferácie hESCs mechanizmy - špecifický transkripčný faktor, Oct4 gén aktivuje expresiu fibroblastový rastový faktor 4, génovej expresie a stabilizuje box zodpovedá za neobmedzujúce DNA zdvojenie v nezrelých bunkách. Medzi najdôležitejšie intracelulárne signálne proteíny sú OCT3, Oct4, Tcf a Groucho, vzťahujúce sa k proteínom chromatínu-tlmičov.

Takmer okamžite po dlhodobých kultivovaných pokusov HSR je neúspešné a organizmus sa najprv pripraví kultúry kmeňových buniek izolovaných z myších blastocysty a primárne zárodočné bunkové kultúry, začal štádia ESC pluripotence štúdie kapacity, keď sa podáva v raných fázach vývoja embrya. Ukázalo sa, že pri morula a blastocysty PGC sú schopné tvoriť chimerická embryá, v ktorom detekovaný darcovské PGC potomkovia vo všetkých somatických tkanivách, a dokonca aj v gamét. Tak, v Developmental Biology pomocou ESC skriptovacieho "mostík" medzi experimentálnych štúdií in vivo a in vitro, ktoré sa významne zvýšili možnosť študovať procesov záložky primárnych tkanív a orgánov, ich diferenciáciu a embryonálny vývoj orgánov.

Je dobre známe, že in vivo v priebehu embryogenézy integrovaný ESK do bunkovej hmoty skorého embrya, a ich deriváty sa nachádzajú vo všetkých orgánoch a tkanivách. PGC kolonizovať zárodočnej línie chimerická zárodočných buniek, potomkovia z ktoré tvoria úplný vajcia a spermie. Embryonálne kmeňové bunky sú klonogenní - jednotlivé PGC môžu vytvárať geneticky identické s kolónie buniek molekulárnych markerov, ktoré zahŕňajú Oct4 génovú expresiu a alkalickú fosfatázu, vysokú telomerasovou aktivitu, rovnako ako expresiu špecifických zárodočných antigénov.

Pre štúdium mechanizmov embryogenézy pomocou techniky hESCs chimerization morula vytvorením biologickej štruktúry, ktorá sa nachádza mimo vrstva tetraploidná blastoméra príjemcu a darcu PGC sa podávajú do. Tak, trofoblast vytvorené z potomkov tetraploidná blastoméra príjemcu, ktorý umožňuje implantáciu a placenty a darcovské PGC pôsobí ako vnútorný bunkovej hmoty, ktorá je tvorená z životaschopné zárodočnej línie primárnych tela a progenitorových gamét. Štúdia ESC hodnota spočíva nielen v tom, že, keď je manipulácia in vitro s ich genómu zachované pluripotence, ale aj v tom, že pri zachovaní schopnosti podieľať sa na tvorbe hESCs prvotné zárodočných bunkách chimerická embryo. Je ukázané, že iba jeden potomkovia geneticky modifikovaných PGC kolonizovať všetky primárne a choroboplodné zárodky, ktoré tvoria tkaninu chimerická embryo získané agregáciou alebo kultivácia buniek s 8-bunky embrya. Keď transplantované myši morula HSR transfekciou zeleného fluorescenčného proteínu génu fluorescenčné potomkovia buniek boli zistené vo všetkých skúmaných tkanivách vyvíjajúceho sa embrya (Shimada, 1999). Transplantácia ESC v morula môže vytvoriť životaschopné myšou, telo, ktoré sa skladá výlučne z potomkov daroval ESC, ktorá otvára príležitosti pre celý rad liečebných možností klonovanie. Práve takýto metodický prístup bol úspešne aplikovaný študovať problémy vývojovej biológie, najmä, môže analyzovať genetické mechanizmy inaktivácie chromozóme X alebo epigenetické nestability hESCs. Transplantácia ESC do skorého embrya sa používa aj v biotechnológii v poľnohospodárstve, ako aj v experimentoch génovej terapie.

Transplantácie geneticky modifikovaných ESC sa používajú na testovanie cieľových buniek mutantných génov. In vitro kultivované ESC sa používajú v biotechnológii na vytvorenie vyradených myší. Pre tento účel, pomocou homológnej rekombinácie, ktoré majú byť odstránené z HSR štúdie génovej (knock-out) a selektívne médiá vylučujú buniek nemajú tento gén. Potom sa do blastocystu injekčne injikujú ESC alebo sa agregujú blastoméry morula. Takto získané chimérní skorých embryí sa presadia do recipientní samice a novonarodené myši zvolený z jedincov s gamét, nullizigotnymi tohto génu. Podľa tejto technológie vytvorená počtu riadkov knockout myší, ktoré sú široko používané v experimentálnej biológii a experimentálnej medicíny. Na týchto biologických modelov študoval hodnoty určitých génov v embryonálnom vývoji, rovnako ako ich úlohu v mechanizmoch chorôb a patologických stavov u ľudí. Okrem toho sa v predklinickej testovacej fáze nových metód génovej terapie používajú línie vyradených zvierat. Napríklad pomocou génovej transfekcia v ESK normálnej alely mutovaného génu efektívne riadiť opravený mutáciu, zasahuje hemopoetických systému. Zavedenie cudzích génov do ESC umožňuje vytvorenie línií homozygotných transgénnych laboratórnych zvierat rýchlejším tempom. Malo by však byť poznamenané, že delécie génu rekombinačné technikou zameraný spoľahlivo spracovaný doteraz len relatívne ESC myšou. Použitie myší s dvojitou mutáciou, HSR nainštalovaný funkčný úlohu zhluk oblasti génov na chromozóme 7 (kópií genómovej oblasti 19 minút ľudského chromozómu) a proximálna časť 11. Chromozómu (kópia ľudského 5d chromozóm) - vypustenie týchto génov v Myši ESK umožnili vyhodnotiť funkciu ich analógov u ľudí.

Funkčné kapacita štúdie ľudských embryonálnych génov, transfekcia v géne, ktorý laboratórne zvieratá povolené hESCs najmä CRYPTO objasniť úlohu génu na karte a tvoriacich gén kardiogénny mezodermu, Pax-6 - v embryogenézy oka. Predstavuje prvú expresiu génov v nezrelé proliferujúce karty ESC teratokarcinomu a blastocysty myši potvrdené ohromujúci represie v transsignalizatsii génoch ESK. Kombinácia mutantných HSR 60-80 a 20-30 buniek normálnych preimplantačnej myšiach embryí vedie k vzniku chimérických embryí v ktorej záložky telo sa skladá z darcu a príjemcu buniek, ktorý nám umožňuje určiť úlohu neznámych génov v gastrulation a organogenézy. Funkčné mapa zväčšených génových vývoji myšiach embryí detaily role génu karte SF-1 v nadobličkách a pohlavných primordia, hmotnostných 1-gen - v obličkách karte myod génov rodiny - na karte v génovej rodiny kostrového svalstva gata-1-4 - v obmedzení dozrievania základy erytro- a lymfopoézy.

Réžia mimo materskej a otcovskej alely génov v hESCs použitím vektora rekombinázy slúžil k objasneniu funkcie rôznych génov v priebehu skorej embryogenézy a technológie zacielenia ľudských neznámych génov v myšiach HSR prispieť k objavu nových mutovaných génov zodpovedných za rozvoj závažných dedičných ochorení. Pomocou metódy knockout definovaný obligátne význam niektorých génov, pre ktorú sa embryonálnych tkanív: gata-4 - pre myokardu, gata-1 - na erytroidných hemopoetických tkanív, MyoD - kostrové svalstvo, brachyura - pre obmedzenie mesoderm transkriptázy hnf3 a hnf4 - pre pečeňové kmeňové bunky, handra-2 - odkazy na klony T a B lymfocytov (Repin, 2001). Double delécie génov v hESCs otvorila prístup k štúdiu funkčné role génov zárodočné vrstvy, segmentácia a homeosis a transplantácii ESC danej možnosť získania životaschopné medzidruhové hybridných embryí. S zlepšených spôsobov transplantácie darcovských PGC v jednom 8-bunky embrya preukázané, že chimerization na bunkovej úrovni mnohých orgánov prijímajúcej embrya. Všimnite si, že mobilné klíčky sa nachádzajú v príjemca tkaniva myších orgánoch človeka po podaní ľudských krvotvorných buniek do blastocysty. Bolo zistené, že v myšiach embryí počas tvorby krvných telies obiehajúcich pluripotentných hESCs. Je možné, že ich biologické funkcie je organizácia budúceho plodu imunitného systému. ESC in vitro reprodukované vhodné modely ľudskej genetickej choroby: s dvojitou mutáciou modelom dystrofínového génu u myší DMD, vypnutie atm génu (riadiaci signál syntéza kináza chromatínu) - ataxia-teleangektaziyu. V tomto prípade, fatálne dedičné ochorenia u detí v dôsledku chýb opravy DNA vyvíja degeneráciu Purkyňových buniek v malom mozgu, ktoré je sprevádzané involúcia týmusu vzhľadom ku smrti proliferujúcich buniek. Klinika, patofyziológie a patomorfologija ataxia-teleangek- Tazi reprodukovanej prostredníctvom zavedenia do HSS abnormálne genetickej informácie z myší chiméry na zodpovedajú tým, ktoré u ľudí. Ďalej ataxia-teleangektazii pomocou PGC a knockout myší vyvinuté experimentálny model, niektoré dedičné homozygotná ľudských ochorení súvisiacich s poruchami metabolizmu sacharidov a lipidov, katabolizmus aminokyselín, odstránenie medi a bilirubínu, čo významne zvýšila možnosť experimentálnej medicíny pre predklinické testovanie nových metód pre liečenie príslušných chorôb osoba.

[12], [13], [14], [15]

Použitie cytohybridu kmeňových buniek

Hybridné bunky získané fúziou somatických buniek od hESCs, sú vhodné a perspektívne modelom pre štúdium kmeňových buniek pluripotence a úpravu diferencovaných bunkových chromozómov. Tsitogibridy získaný fúziou ESC s diferencovaných buniek dospelého zvieraťa, poskytujú príležitosť k štúdiu vzťahu medzi genómy rôznych "veku": vytvára jedinečnú situáciu, kedy homológne chromozómy odvodené z buniek rôznych štádiách diferenciácie, a meniace sa stupňa zrelosti, sú v rovnakej jadra, kde sa dá ľahko transdeystvuyuschimi zdieľať regulačné signály. Je ťažké predvídať, ako bude reagovať tsisregulyatornye epigenetické systém homológnych chromozómov existujúcich počas yn rozdelený vývoj, v reakcii na dopad transdeystvuyuschih signálov z embryonálnych príbuzných genómov. Okrem toho, v hybridných bunkách dochádza k segregácii rodičovskej chromozómu, ktorá umožňuje štúdium interakcie genómov na samostatnej úrovne chromozómov, to znamená, potenciálne oddeliť časť špecifických chromozómov v udržiavaní pluripotence, alebo naopak, výstup v diferenciácii.

Ako prvý experimentálny model pre štúdium interakcie genómov iné "históriu vývoja" použitý tsitogibridy získať spojením teratokartsinomnyh pluripotentné a diferencované somatické bunky. V niektorých prípadoch takéto hybridné bunky zachovali pluripotentné vlastnosti na dostatočne vysokej úrovni. Najmä, in vivo somatické hybridný teratokartsinomno-bunky boli indukované vývoj pravých teratomů obsahujúcich deriváty všetkých troch zárodočných vrstiev, in vitro v suspenzné kultúre, vytvorených embryoidních teliesok. Aj v tomto type medzidruhových tsitogibridov poznamenať prítomnosť fetálnych antigénov v prípadoch, keď somatická partnerom fúzie s teratokarcinomových buniek boli lymfocyty alebo tymocytov. Je pozoruhodné, že tsitogibridy fúzií teratokartsinomnyh buniek fibroblastov, v súlade s fenotypom fibroblastov.

Najdôležitejšie je, že známym faktom, že v-teratokartsinomno somatické hybridné bunky sa objavil Známky genómu úpravu diferencovaných buniek, vyznačujúci sa tým, reaktiváciu jednotlivých génov alebo neaktívne X-chromozómu somatické partnera. To znamená, že výsledky výskumu na type buniek tsitogibridah teratokartsinomno-somatických ukazujú, že hybridné bunky často aj pluripotence a preprogramovanie genómu existujú známky somatické partnera.

V experimentoch na získanie embryonálnych Vnútrodruhová hybridných buniek fúziou splenocytů myšou HSR dospelé zviera študované vlastnosti, ako tsitogibridov, Analýza oddeľovanie rodičovských chromozómov a hodnotené pluripotence hybridný genóm. Pre medzidruhových hybridných buniek produkovaných fúznych teratokarcinomových buniek somatických buniek, všeobecne vyznačuje nízkou segregáciu chromozómov sa tetraploidná alebo takmer tetraploidná karyotyp. Takéto chromozomálne tsitogibridah kompozícia bola pozorovaná vo fúznych primordiálních zárodočných buniek na lymfocyty. V rovnakej dobe, medzidruhové hybridný bunky získané v dôsledku fúzie myších lymfocytov buniek teratokartsinomnyh norok, tam bola intenzívna segregácii chromozómov somatická partnerom.

Kvalitatívne nová fáza štúdiu segregácie rodičovských chromozómov v medzidruhových hybridov prišiel po vývoji mikrosatelitních analytickou metódou za použitia polymerázovej reťazovej reakcie, pričom každý chromozóm myši nájdených niekoľko sto značiek, čo umožňuje spoľahlivo rozlíšiť akúkoľvek dvojicu homológnych chromozómov v hybridných buniek.

Spojením ESK (za použitia HM-1 bunky deficitné v gipoksantinfosforiboziltransferazy činnosti, 2n = 40, XY, izolovaný z blastocysty myšieho kmeňa 129 / 01A) sa splenocyty z myší kongenní čiary DD / c sa nepodarilo prijať sadu hybridných klonov morfologicky mal podobnosť hESCs. Všetky klony boli izolované na selektívnom médiu, v ktorom je možný rast len s aktívnou bunkovou gipoksantinfosforiboziltransferazoy. Elektroforetická analýza ukázala prítomnosť všetkých klonov alelická variant gipoksantinfosforiboziltransferazy charakteristika myši DD / c. Pomocou cytogenetickú analýzy sa zistilo, že štyri mal tri hybridné klony okolodiploidny sada chromozómov. Jeden takmer tetraploidný klon obsahoval dve populácie hybridných buniek, z ktorých jedna bola tetraploidná a druhá, menšia, diploidná.

Analýza mikrosatelitních umožňujúci rozlíšiť akúkoľvek dvojicu homológnych chromozómov myší 129 / 01A a DD / c, v hybridných klonov sa okolodiploidnym sady ukázala, že klony došlo v dvoch rôznych prednostné odstránenie nepohlavných somatické partnera. Väčšina autozomálne klony HESS2 a HESS3 mal markery línie 129 / 01A, tj pluripotentné partnera. Výnimkou bola chromozómu 1 a I: klony HESS2 a HESS3, spolu s markermi HM-1 buniek, malý počet markerov prítomná somatická partnera. Tieto výsledky môžu odrážať neúplné segregácii chromozómov 1 a a somatická partnera a sú v súlade s údajmi, ktoré cytogenetickými Trizomia chromozómov, ktoré sa vyskytuje v 30 až 40% HESS2 a bunkovej klony HESS3. HESS4 klon líšili významne v chromozomálne zložení: mnoho autozomy Tento klon pochádza z genómu ESK (chromozómy 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 a 17), ale chromozómy 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 a 19 boli reprezentované homológmi oboch rodičov. Kvantitatívne pomer mikrosatelitních markerov tieto homológne chromozómy zodpovedal približne 1: 1. To umožnilo autorom naznačujú, že jeden homolog je odvodená z genómu ESC a druhý - z diferencovaných buniek. V niektorých subklonů klonu HESS4 pozorovali iba symbolické prítomnosť chromozómov 18 a 19 somatických partnera. Výsledky ukazujú, že bunky klonovať HESS4, navyše k segregácii chromozómov somatických partnera, bolo odstránenie jednej alebo oboch homológy vyššie chromozómu pluripotentné genómu, teda došlo k obojstrannej segregácie chromozómov oboch rodičov - tento jav je úplne nezvyčajné, pretože tsitogibridov charakteristická segregácie chromozómov len jeden z rodičov.

Okrem toho, po prechode 20., všetky klony hybridných buniek obsahujú iba chromozómu X markery somatické partnera, to znamená, že v klonoch bol nahradený X chromozómu ESC na X chromozóme somatické partnera. To je potvrdené in situ hybridizačnými údajmi s použitím sondy značenej FITC špecifickej pre myší X-chromozóm: pozitívny signál bol detegovaný len na jednom chromozóme. Treba poznamenať, že v skorších štádiách kultivácie (až do 15. Pasáže) boli podľa cytogenetických údajov v mnohých bunkách prítomné dva X-chromozómy. V dôsledku toho použitie selektívneho média umožňuje manipulovať s chromozomálnym zložením hybridných buniek a selektívne sa zameriavajú na klony nesúce jednotlivé chromozómy somatického partnera na pozadí genómu ESC.

Ako unikátny vlastnosť genómu tsitogibridov je lokalizačné rodičovských genómov v jedinej jadro, samozrejme, vyvoláva otázku zachovanie vlastností pluripotentných embryonálnych genómu HSV-hybridov somatických buniek v podmienkach tesného kontaktu s genómu diferencovaných buniek. Morfologicky tsitogibridy PGC a somatické bunky boli podobné rodičovskej línie hESCs. Kvalifikácia pluripotence ukázali, že všetky klony okolodiploidnym sadu chromozómov boli schopné tvoriť v suspenzné kultúre embryoidních teliesok, v ktorom deriváty troch zárodočných vrstiev prítomný.

Väčšina hybridných buniek obsahovala antigén ECMA-7, marker charakteristický pre rané myšie embryá a mal tiež vysokú aktivitu alkalickej fosfatázy. Najpresvedčivejšie údaje o vysokých pluripotentných vlastnostiach hybridných buniek sa získali v experimentoch na získanie série injekčných chimér zahrnujúcich hybridné bunky klonu HESS2. Analýza biochemických markerov ukázala, že potomkovia darcovských hybridných buniek sa našli vo väčšine chimérnych tkanív. Preto hybridné bunky získané fúziou buniek ESC a somaticky diferencovaných buniek si uchovávajú pluripotenciu na vysokej úrovni vrátane schopnosti vytvárať chiméry, keď sú vložené do dutiny blastocysty.

Klony HESS2 a HESS4 sa významne líšili v zložení materských chromozómov, ale mali podobné pluripotentné vlastnosti. Dalo by sa uveriť, že pluripotencia v hybridnom genóme sa prejavuje ako dominantná črta, ale je možné, že nie všetky chromozómy embryonálneho genómu sa podieľajú na procese udržania pluripotencie. Ak je tento predpoklad správny, možno očakávať, že odstránenie niektorých chromozómov pluripotentného partnera z genómu hybridómov nebude sprevádzať zmena ich pluripotentného stavu. V tomto prípade analýza segregácie rodičovských chromozómov v embryonálnych hybridných bunkách umožní blízky prístup k identifikácii chromozómov zodpovedných za kontrolu pluripotencie embryonálnych buniek.

Serov O. Et al (2001) zistili, medzi 50 potomstva získaného krížením chimér s normálnou myši, ktoré sa majú genotyp myší 129 / 01A, a nesúci X chromozómu DD myšou. Autori vnímajú dôvod v redukcii pluripotencie v hybridných bunkách pod vplyvom somatického genómu. Alternatívne vysvetlenie môže byť negatívny vplyv Trizomia nejakú nerovnováhou autozomů a pohlavných chromozómov (XXY pozorovaná v bunkách až do 15. Pasáž) v hybridných bunkách pri priechode meiózy. Je známe, že bunky XXY nemôžu prejsť meiózou a tvoriť gaméty. Trisomia je tiež schopná spôsobiť zníženie proliferačnej aktivity hybridných buniek, vďaka čomu selektívna výhoda vo vývoji chimér môže patriť do buniek príjemcu embrya. Z toho vyplýva, že na primerané vyhodnotenie pluripotentného potenciálu hybridných buniek je potrebné získať hybridné klony s normálnym diploidným súborom chromozómov.

V pokusoch Sérová O. Et al (2001), prvý demonštruje možnosť preprogramovanie chromozóm X v genóme somatických buniek hybridný bunky. Tento záver vyplýva z autori analýzu expresie chimér HPRT génu (X-chromozóm značka): prítomnosť alelických variantov HPRT DD / c myší bola detekovaná vo všetkých analyzovaných tkanivách chimerická. Je potrebné zdôrazniť, že po zavedení hybridných buniek v blastocysty dutine tsitogibridy spadajú do neselektívnych podmienok a zachovanie X chromozómu v genóme hybridných buniek, znamená, že sa stal obligátne súčasť svojho genómu a nemá to nediskriminuje z Y chromozóm pluripotentné partnera.

Zhŕňa výsledky analýzy interakcie somatické a pluripotentných genómu v hybridných buniek, autori došli k záveru, že v niektorých tsitogibridah pluripotence sa javí ako dominantný znak. Hybridný gén schopný jednotlivých chromozómov preprogramovať diferencované bunky, ktoré sa však nevylučuje opačný účinok na somatické genómu pluripotence embryonálneho genómu. Pri kultivácii hybridných buniek dochádza k indukcii diferenciácie oveľa častejšie ako v pôvodnej materskej línii ESC NM-1. Podobný účinok je pozorovaný pri tvorbe primárnych kolónií: mnohých primárnych kolónií embryonálnych hybridných buniek diferencovaných v skorých štádiách vzdelávania s veľkou stratou klonov pri ich chove a rozmnožovanie.

Cytohybridy tvorené fúziou ESC so somatickými bunkami tak napriek tesnému kontaktu s genómom diferencovaných buniek zachovávajú pluripotenciu ako jedinečnú vlastnosť embryonálneho genómu. Navyše, v takých hybridných bunkách je možné preprogramovať jednotlivé chromozómy pochádzajúce z difundovaných buniek. Zostáva nejasné, ako úplne pretrvávajú pluripotentné vlastnosti embryonálneho genómu v hybridných bunkách, najmä ich schopnosť zúčastňovať sa na tvorbe embryonálnej dráhy v chiméroch. Preto je potrebné získať embryonálne hybridné bunky s normálnym karyotypom. V každom prípade, pluripotentné embryonálne hybridný bunky môže byť reálny model pre genetickej identifikácie chromozómov podieľajúcich sa na udržiavaní pluripotence alebo jej kontrole ako bilaterálne segregácia rodičovských chromozómov potenciálne poskytuje takú možnosť.

Nemenej atraktívne sú fenomén štúdie, ktorá Serov G. Et al (2001), je definovaná ako "chromozomálne pamäti." V hybridnom genómu homológnej chromozómy sú dve alternatívne konfigurácie: homológy somatické partnera raz prešla diferenciácie, vzhľadom k tomu, homológy pluripotentné partnera, tento proces ešte len začína. Z tohto dôvodu zachovania vysokej pluripotentné vlastnosti hybridných buniek, naznačuje, že "pluripotentné" konfigurácia homológy ESC pomerne stabilný v hybridných genómov, napriek vplyvu transdeystvuyuschih faktorov vychádzajúcich z somatické partnera. Vyššie popísané vlastnosti preprogramovanie diferencované homológnej genómu chromozómov počas vývoja chimér nevylučujú možnosť, že prvá fáza tvorby in vitro a kultivácie tsitogibridov ktoré si zachovávajú svoju získané počas diferenciácie in vivo. Podľa posledných údajov, pri prenášaní embryonálnych hybridných buniek v neselektívnym médiu, v ktorom dochádza k intenzívnej iba eliminačný chromozómy somatické partner, to znamená, že genóm hybridných buniek ľahko rozlíši homológy po kultúre in vitro po dobu 10-15 pasáží. Tak, embryonálny hybridný bunky predstavujú sľubnú experimentálny model pre štúdium nielen zo základných vlastností embryonálny genómu ako pluripotence, ale aj na jeho alternatívy - embryonálne diferenciáciu.

Terapeutická účinnosť transplantácie embryonálnych kmeňových buniek

Pred analýzou terapeutickej účinnosti transplantácie ESC a jej derivátov sumarizujeme uvedený materiál. Funkcia ESC, pokiaľ ide o úplné vykonanie embryogenézy in vitro sú nedostatočné, pretože chyby v tomto prípade z dôvodu neprítomnosti mezenchýmových kmeňových buniek, ktoré sa vyskytujú v tele samostatne a nezávisle na hESCs. Genetická účinnosť ESK menej genetický potenciál zygoty teda priamo pre klonovanie embryá HSR nepoužíva. Unikátny biologický potenciál hESCs ako jediné bunky, v ktorých sú vývojové programy rozmiestnené úplne konzistentné vykonávanie, nachádza uplatnenie pri štúdiu štúdií génovej funkcie. Použitie ESK vykonáva dekódovanie prvej kombinácie signálov, ktoré aktivujú expresiu skorých a neskorých génov, ktoré kódujú pre rozvoj troch zárodočných vrstiev. Zachovanie genómu pluripotence HSR in vitro činí je unikátny nástroj pre opravy regenerácie, ktorý môže automaticky kompenzovať straty buniek poškodených orgánov a tkanív. V ideálnom hypotetické prevedení je možné predpokladať, že "... V transplantáciu darcu PGC v organizme príjemcu, sú prenesené kompaktne zabalené programy, ktoré za priaznivých podmienok sú realizované vo výstavbe nových tkani'7 schopného" ... Efektívne integrovať do tela príjemcu ako morfologické, funkčné aj funkčné. "

Prirodzene, po vývoji metód na monodiferenciáciu ESC sa začalo in vivo štúdium funkčnej aktivity buniek získaných in vitro z jediného špecializovaného klonu. Proliferujúci ESO klon generuje populácie migrujúcich progenitorových buniek, ktoré sú skutočne schopné aktívne sa integrovať do zón poškodenia tkaniva príjemcu, ktorý sa používa v medicíne s regeneratívnou plastikou. Bolo zistené, že transplantácia dopa-neurónov v substantia nigra znižuje klinické prejavy u experimentálneho hemiparkinsonizmu. Regionálne transplantácie darcovských neurálnych kmeňových buniek znižujú stupeň motorických porúch spôsobených traumou alebo kontúziou miechy a mozgu. Prijaté a prvé pozitívne výsledky transplantácie kmeňových buniek pri demyelinizačných ochoreniach. Zdá sa, že regeneračné-plastové potenciály ESC otvárajú neobmedzené možnosti použitia bunkovej transplantácie v praktickom lekárstve. Avšak pri transplantácii do ektopických zón sa ESC nevyhnutelne transformujú na nádory. Pri subkutánnej injekcii ESC v imunodeficientných myšiach sa tvoria teratómy. Pri presádzaní pod kapsule hnojovice ESK semenníkov u syngenních myší je tiež vytvorený teratomy pozostávajúce z rôznych tkanív, buniek, ktoré sú deriváty všetkých troch zárodočných vrstiev. U takýchto teratómov sú procesy zníženej organogenézy extrémne zriedkavé.

Množstvo prác poskytuje informácie o pozitívnych výsledkoch transplantácie skorých derivátov ESCO na zvieratá s ex-perimentálnou patológiou. Cell neurotransplantation za použitia derivátov PGC je ďalej vyvinutý v experimente a prvých klinických skúšok pri korekcii funkčných porúch v mozgu a miechy, ošetrenie syringomyelia a roztrúsená skleróza (Repin, 2001). S príchodom technológie neyronogeneza HSR in vitro, namiesto použitia transplantácie techniky embryonálny mozgového tkaniva vyvinuté deriváty neurosféry, získané z kultúr embryonálne nervového tkaniva. Takéto transplantačné suspenzie sú omnoho homogénnejšie a obsahujú sprostredkované neuronálne a neurogliové prekurzory.

Navyše k normálnemu živnej pôde kyselinou retinovou v dávke 10 ug / ml po dobu 6 týždňov v embryonálnych línií (teratomy) NTERA-2 ľudského -kartsinomy tvorený viac ako 80% z post-mitotických neurónov. Kompletné homogenita neurónovou populáciou je dosiahnuté prietoku triedenie značené immunophenotypic markery zrelých neurónov, ktoré môžu zbaviť zvyškov teratokartsinomnyh a nezrelých buniek. Po transplantácii v rôznych oblastiach mozgu pokusných zvierat tieto neuróny sú nielen prežiť, ale aj zakotvený v regionálnych neurónových sietí. U zvierat sa experimentálnych modelov lokálnych porúch CNS neurotransplantation znižuje klinické prejavy ľudskou patológiou, ako sú účinky kraniocerebrálne trauma, mŕtvica, demyelinizačné ochorenia, vrodených vád cerebelárne vývoj, ochorenia ukladanie lipidov a polysacharidov.

Na optimalizáciu regeneračných procesov v degeneratívnych ochoreniach centrálneho nervového systému sa vyvíjajú technológie na prípravu oligodendrocytov produkujúcich myelín z ESK. Prvá fáza tradične zahŕňa rozšírenie ESC s násobením počtu buniek potrebných na transplantáciu. V druhom stupni sa uskutočňuje riadená diferenciácia buniek do populácie prekurzorov oligodendrocytov produkujúcich myelín, ktorá je riadená selektívnymi markerovými antigénmi.

Niektoré vyhliadky sú otvorené pre použitie s derivátmi HSR vyvinúť metódy pre korekciu imunodeficitu spôsobeného genetické chyby v zrenia týmusu. V štúdiách na knockout (RAG 1) myši s indukovanou defektom génu - porušenie rekombinácie mechanizmus V (D) J miesta génu TCR, čo vedie k strate funkcie T-lymfocytov, transplantácia skoré deriváty PGC v týmusu zviera zotaví zrenia normálnej populácie imunitných klonov zodpovedných za bunková imunita. Klinické štúdie transplantácie vopred pripravené in vitro hESCs na liečbu fatálne dedičné anémie u detí.

Námietky voči rýchlemu zavedeniu transplantácie kmeňových buniek do klinickej ambulancie sú odôvodnené obmedzeným počtom stabilných línií ľudských embryonálnych kmeňových buniek a potrebou ich štandardizácie. Na zvýšenie čistoty štandardizovaných ESC línií ako aj dospelých kmeňových buniek sa navrhuje metóda výberu línie založená na molekulárnej genetickej analýze krátkych tandemových opakovaní DNA. Je tiež potrebné testovať línie ESC na prítomnosť malých chromozomálnych preskupení a genetických mutácií, potenciálna možnosť ich výskytu v podmienkach kultivácie buniek je dostatočne vysoká. Práca rozširuje povinné skúšanie vlastností všetkých typoch PGC a regionálnych pluripotentných kmeňových buniek, pretože ich množenie in vitro môže viesť k novým vlastnostiam nie je spojených embryonálnych kmeňových buniek na definitívne alebo tkanív. Najmä sa predpokladá, že dlhodobá kultivácia v médiu s cytokíny Hess bližšie k nádorovým bunkám, pretože sa vyskytujú podobné zmeny dráh regulujúcich bunkový cyklus s obstaraním schopnosť vykonávať neobmedzený počet bunkových delení. Niektorí autori berú na základe potenciálu vývoja nádorov ľudskú transplantáciu skorých derivátov embryonálnych kmeňových buniek ako bezohľadnosť. Podľa ich názoru je oveľa bezpečnejšie používať oddaných potomkov ESC, teda línií predkov diferencovaných buniek. Avšak spoľahlivá technika na získanie stabilných ľudských bunkových línií, ktoré sa líšia správnym smerom, ešte nebola vyvinutá.

V literatúre je preto stále viac a viac údajov o pozitívnom terapeutickom účinku transplantácie derivátov ľudských embryonálnych kmeňových buniek. Mnohé z týchto diel však podliehajú revízii a kritike. Niektorí vedci sa domnievajú, že výsledky predchádzajúcich klinických skúšok sú len predbežný charakter a iba ukazujú, že kmeňové bunky sú schopné vykonávať priaznivý vplyv na klinický priebeh ochorenia. Preto je potrebné získať údaje o dlhodobých výsledkoch transplantácie buniek. Ako argument sa uvádzajú štádia vývoja klinickej neurotransplantológie. V skutočnosti, v literatúre, pôvodne ovládaná zverejnenie vysokej účinnosti transplantácia mozgu fragmenty embryí u Parkinsonovej choroby, ale potom sa začali objavovať správy popierajú terapeutickú účinnosť embryonálny alebo fetálny nervového tkaniva transplantované do mozgu pacientov.

Riadil prvé klinické testy hodnotenie bezpečnosti transplantácie neuroblast - deriváty PGC NTERA-2 teratokarcinomu, nezrelé bunky, ktoré proliferáciou v kultúre boli podrobené skladovanie 100 miliónty bunkovej hmoty. Časť takto získaných buniek bola použitá pre určenie charakteristík fenotypu bunky a nečistôt, ako aj pre testovanie potenciálnych kontaminácie vírusmi a baktériami. Z kultivačné médium bolo odstránené a LIF živnej vrstve buniek strómy a fetálnych vytvorené podmienky pre riadené diferenciáciu hESCs do Neuroblasty s kombináciou cytokínov a rastových faktorov. Potom boli neuroblasty purifikované z nezrelých teratokarcinómových buniek na triediči kŕmnych klietok. Po druhom čistení a charakterizácia fenotypu transplantovaných buniek Neuroblasty (10-12000000), suspenzia pomocou špeciálnej injekčnej striekačky, a microcannulas stereotaxy a pod kontrolou CT vstrekovaný do nucleus basalis mozgu pacientov (siedmy mesiac po hemoragickej mŕtvicu). Odnogodovoy po transplantácii screening účinky transplantáciu neurónov v zdvihu zóne viditeľné žiadne nežiaduce a vedľajšie účinky. Polovica pacientov sa konal zlepšenie motorických funkcií v období od 6 do 12 mesiacov po transplantácii. Pozitívne klinické zmeny boli sprevádzané zvýšením prekrvenia zdvihu zóne po transplantácii buniek: priemerné zvýšenie absorpcie fluorescenčného značených 2-deoxyglukózy, podľa pozitrónová emisná tomografia dosiahol 18%, a v niektorých pacientov - 35%.

Avšak Národný inštitút zdravotníctva USA vykonal nezávislú štúdiu o klinickej účinnosti neurotransplantácie u pacientov s parkinsonizmom. Pacienti v prvej skupine boli transplantovaní dopamínom produkujúcim embryonálne nervové tkanivo, zatiaľ čo druhá skupina pacientov prešla falošnou operáciou. Výsledky naznačujú nulovú klinickú účinnosť takejto neurotransplantácie napriek skutočnosti, že embryonálne neuróny produkujúce dopamín prežívajú v mozgu príjemcov. Navyše po 2 roky po transplantácii fetálnej nervového tkaniva u 15% pacientov došlo k rozvoju trvalej dyskinéza, ktoré chýbajú u pacientov v skupine s placebom (Kmeňové bunky: vedecký pokrok a budúce výskumné smery Nat Inst v zdravotníctve USA ...). Pozorovania ďalšieho vývoja ochorenia u týchto pacientov pokračujú.

Niektorí autori prisudzujú rozporuplný literatúru o hodnotení klinických údajov účinnosť Neurotransplantation s odlišným prístupom k výberu pacientov skupín, neadekvátny výber objektívne metódy hodnotenia ich stavu a, čo je najdôležitejšie, rôzne podmienky vývoja plodu nervového tkaniva a v rôznych častiach mozgu, z ktorého bola textílie, vyrobené v rôznych veľkostiach štep a metodické funkcie operáciu.

Je potrebné poznamenať, že pokusy o priame transplantácii pluripotentných embryonálnych kmeňových buniek do striatálnymi oblasti mozgu krýs s experimentálnym tela gemiparkinsonizmom sprevádzaná proliferáciu ESC a ich diferenciáciu na dopaminergné neuróny. Je potrebné predpokladať, že novovzniknuté neuróny účinne zabudovaný do neurónové siete, ako regulátory otáčok po transplantácii bola pozorovaná korekcia anomálií správania a motora asymetria v apomorfínu teste. Zároveň niektoré zvieratá zomreli v dôsledku transformácie transplantovaného ESK do mozgového nádoru.

Odborníci z amerického Národného a lekárskej akadémie, špecialisti National Institutes of Health sa domnievajú, že klinický potenciál hESCs si zasluhuje veľkú pozornosť, ale trvajú na tom, že je potrebné pre detailné štúdium ich vlastností, nebezpečenstvo komplikácií a dlhodobé účinky pri pokusoch so zodpovedajúcimi biologických modelov ľudských chorôb (Kmeňové bunky a budúca regeneratívna medicína National Academy Press, Kmeňové bunky a budúce výskumné smernice., Nat. Inst, Health USA).

Z tohto hľadiska je dôležité, že porovnávacia Histologická analýza experimentálnych teratom získaný transplantácií v semenníkoch kalové PGC s teratomů, ktoré sa vyvinuli v dôsledku transplantácie skoré embryo, ktoré zahŕňali tiež prítomné HSV ukázal, že ESK bez ohľadu na pôvod alebo interakcie s jedna alebo iné okolité bunky rovnakým spôsobom realizovať ich tumorigénny účinnosť. Ukázalo sa, že takéto teratomů klonální pôvod, ako z nádoru HSR môže dôjsť, skladajúci sa z derivátov všetkých troch zárodočných vrstiev (.reg, 2001). Je pozoruhodné, že keď transplantované do imunodeficientných myší klonovaných PGC s normálnym karyotypom a vytvorených teratomů pozostávajúcich z rôznych typov diferencovaných somatických buniek. Tieto experimentálne údaje - perfektný dôkaz klonální pôvod teratomů. Z pohľadu vývojovej biológie, ktoré naznačujú, že to nie je násobkom angažovaných progenitorových buniek a pluripotentných kmeňových buniek identity je zdrojom diferencovaných derivátov všetkých troch zárodočných vrstiev, teratom komponentov. Avšak, v praktickej výsledky transplantácie buniek týchto štúdií sú, pokiaľ nie sú príliš vysoké, potom sa varovný signál potenciálne nebezpečenstvo, pretože inokulačné ESC alebo primordiálních zárodočných buniek v rôznych tkanivách dospelých imunodeficientných myší nevyhnutne spôsobí vývoj nádoru z transplantovaných kmeňových buniek. Neoplastickým degenerácia ektopicky transplantujú ESC sprevádzané vznikom satelitných populácie diferencovaných buniek - čiastočne odlíšiť je určite HSR a progenitorové klony vyhradenej linky. Je zaujímavé, že po transplantácii hESCs do buniek kostrového svalstva u teratokartsinomnymi neurónov tvoria častejšie. Avšak, v spravujúcich PGC Mace vajcia alebo blastocysty sprevádzané úplnej integrácie do zárodočných buniek bez tvorby nádorových buniek. Zároveň ESC vložený takmer vo všetkých orgánoch a tkanivách embryá, vrátane sexuálneho zárodok. Takéto allofennye zvieratá boli najprv pripraví spracovaním teratokarcinom bunky 129 v skorých štádiách embryí u 8-100 buniek. V allofennyh populácie myšiach sú geterogenomnyh darcu PGC buniek odvodených z zavedené do kostnej drene, čriev, kože, pečene a pohlavných orgánov, ktoré umožňuje vytvárať v experimente aj medzidruhové bunkovej chimér. Čím menšia je doba skorého embryá, tým vyššia je percento buniek chimerization, najvyšší stupeň chimerization pozorované v hematopoetického systému, kože, nervového systému, pečene a tenkého čreva allofennogo embrya. V dospelom organizme tkanivo prístupný chimerization chrániť pred imunitným systémom príjemcu gistogematicalkie prekážky: transplantácia primordiální zárodočné bunky v semenníkoch parenchýmu sprevádzané vložením darcu kmeňových buniek do tkaniva príjemcu germenativny vrstvy. Avšak, nedochádza transplantácia ESC do útvaru blastocysty chimérických primordia genitálií generácie darcovských primordiální zárodočné bunky. ESC pluripotence pri vytváraní osobitných podmienok, a môžu byť použité pre klonovanie: ESC transplantácia myšou 8-16 buniek myšieho embrya, bunkovej mitózy kde tsitokalazinom blokované, prispieva k normálnemu embryogenézy sa vývoja embrya darcovských PGC.

V dôsledku toho, možno namiesto transplantácie alogénne ESC terapeutického klonovania založené na jadra somatických buniek transplantáciu do enukleovaného oocytu vytvoriť blastocysty vnútornej bunkovej hmoty, z ktorej sa potom pridelenú línia geneticky identických darcovských PGC somatická jadra. Technicky je táto myšlienka je možné, pretože možnosť vytvorenia ľudských embryonálnych kmeňových buniek línií z blastocysty získanej po transplantácii somatických jadier do enukleovaného vajíčka opakovane ukázal v pokusoch na laboratórnych zvieratách (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Najmä u myší homozygotných pre mutácie rag2, fibroblasty získané kultiváciou tkanivové bunky subepidermální boli použité ako darcov jadra sa presadia do enukleovaných oocytov. Po aktivácii oocytov "zygota" kultivované, kým nebol vznik blastocysty, z vnútornej bunkovej hmoty sa izoluje PGC a odovzdávanie je do linky pre mutantné gén nullizigotnyh buniek (rag2 ~ / ~). Homológnou rekombináciou v týchto ESC bola mutácia jedného alelického génu korigovaná. V prvej sérii pokusov z hESCs rekombinantný gén získaný embryoidních teliesok boli pripravené, transfektované bunky ich rekombinantný retrovírus (HoxB4i / GFP) a po množení u myší injekciou žily rag2 ~ / ~. V druhej sérii boli tetraploidné blastoméry agregované s geneticky modifikovanými ESC a transplantované ich príjemcom. Narodené imunokompetentné myši slúžili ako darcovia kostnej drene na transplantáciu do mutantných myší rag2 ~ / ~. V oboch sériách, výsledok bol pozitívny: 3-4 týždňov vo všetkých myší normálnych zrelých myeloidných a lymfoidných buniek bolo zistené, schopné produkovať imunoglobulíny. Tak, transplantácia do oocytu jadra somatických buniek, môžu byť použité nielen na produkciu ľudských embryonálnych kmeňových buniek línie, ale aj pre tsitogenoterapii - oprava dedičných abnormalít ESC ako vektor pre prepravu korekciu genetickej informácie. Avšak v tomto smere transplantácie buniek existujú okrem bioetických problémov aj obmedzenia. Nie je jasné, do akej miery je transplantácia bude terapeuticky klonovanie buniek s genotypom totožné s genotypu konkrétneho pacienta, pretože tieto bunky sa môžu zaviesť mutácie, ktoré vytvára predispozíciu k určitým ochoreniam. Normálne ľudské vajíčka zostávajú neprístupné objekt, pričom aj pri transplantácii somatických jadra do enukleovaného zvieracieho vajíčka iba 15-25% inžinierstvom "zygota" vyvinúť do štádia blastocysty. Nie je stanovené, koľko blastocysty je potrebné na získanie jednej línie pluripotentných klonovaných ESC. Treba poznamenať aj vysokú úroveň finančných nákladov spojených so zložitosťou metodológie terapeutického klonovania.

Záverom, v pluripotentním genómu ESC hypomethylated DNA v kombinácii s vysokou telomerasové aktivity a krátke fáze C ^ bunkového cyklu, čo zaisťuje intenzívny a potenciálne nekonečnú násobenie, počas ktorej PGC udržať diploidný chromozómov a "juvenilná" sadu fenotypových charakteristík. Klonální rast PGC v kultúre nebráni ich diferenciáciu na každom špecializované bunky organizmu na proliferáciu a zastavenie linky a pridaním zodpovedajúce regulačné signály. Obmedzenie diferenciácie hESCs v súlade in vitro somatické bunky je realizovaná bez účasti mesenchymu, obchádzať Nohteyaov, je organogenézy a bez tvorby embryá. Ektopické podanie ESC in vivo nevyhnutne vedie k vzniku teratokarcinómov. Transplantácie ESC do blastocysty alebo začiatkom embryá sprevádzané ich integrácia s tkanivami embrya a jeho stabilný chimerization orgánov.

Regeneračné a plastové technológie založené na transplantáciu buniek je priesečník záujmov členov bunkovej biológie, vývojová biológia, experimentálne genetika, imunológia, neurológia, kardiológia, hematológia a mnohých ďalších odboroch experimentálne a praktické medicíne. Najdôležitejšie experimentálne výsledky potvrdzujú možnosť preprogramovanie kmeňové bunky sa smerom zmeny ich vlastností, ktoré sa otvára vyhliadky pre riadenie bunkovo diferenciačné procesy, rastovými faktormi - infarktu regeneráciu, obnove lézie CNS a normalizáciu funkcie prístroja ostrovčekov pankreasu. Avšak, rozšírené transplantácii zavedenie Deriváty ESC v lekárskej praxi je nutné skúmať vlastnosti ľudských kmeňových buniek podrobnejšie a ďalšie experimenty s PGC v experimentálnych modeloch ochorení.

Bioetické otázky a problém odmietanie alogénnej transplantácie buniek by mohla vyriešiť pozorovanú plasticitu genómu regionálnych dospelými kmeňovými bunkami. Avšak počiatočné informáciou je, že pri presádzaní pečeni izolované a dôkladne charakterizovaných autológnych krvotvorných buniek, z ktorých sú k dispozícii nové hepatocyty, ktoré zahŕňajú do pečeňových lalôčikov, sú teraz prehodnocovať a posúdil. Avšak, zverejnené údaje, že transplantácia neurálnych kmeňových buniek v týmuse je tvorba nových výhonkov darcovských T-A a B-lymfocytov, a transplantácii neurálnej kmeňové bunky mozgu v kostnej dreni vedie k tvorbe hematopoetických zárodočných utrpel darcov myeloidnej a erytropoézu , V dôsledku toho, v dospelých orgánoch môže byť zachovaná pluripotentné kmeňové bunky, ktoré sú schopné genómu preprogramovanie ESC do kapacity.

Zdroj HSR pre lekárske využitie zostáva ľudské embryo, čo predurčuje nevyhnutnosť nového prechodu z morálnych, etických, morálnych, právnych a náboženských záležitostí na počiatku ľudského života. Objav ESC dal silný impulz pre obnovenie tvrdých diskusií o tom, kde leží línia medzi živými bunkami a hmotou, substanciou a osobnosťou. Zároveň neexistujú univerzálne normy, pravidlá a zákony týkajúce sa používania ESC v medicíne napriek opakovaným pokusom o ich vytvorenie a prijatie. Každý štát v rámci svojich právnych predpisov tento problém rieši sám. Lekári z celého sveta sa naďalej pokúšajú vyvinúť regeneratívnu plastickú medicínu nad rámec takýchto diskusií, a to predovšetkým použitím neembryonických kmeňových buniek a zásobami kmeňových buniek dospelého organizmu.

Niektoré z histórie izolácie embryonálnych kmeňových buniek

Terato- (embryonálne) bunky boli izolované z -kartsinomnye spontánne sa vyskytujúcich semenníkov kmeň teratomy myš 129 / terc-Sv, spontánny ovariálne teratomy myší línie Lt / Sv, a z teratomů ektopichno zdroj boli transplantované bunky alebo embryonálnej tkaniva. Medzi takto získaných terato- stabilných myších línií (embryonálnych) -kartsinomnyh niektorých bunkách sú pluripotentné, ostatné boli podrobené diferenciáciu iba v bunkách jedného konkrétneho typu, a niektoré boli všeobecne neschopný cytodiferenciační.

V tej dobe bol kladený dôraz výskum, ktorý ukázal možný návrat terato- (embryo) -kartsinomnyh buniek na normálnu fenotyp po ich zavedení do tkaniva vyvíjajúceho sa embrya, rovnako ako práca na vytvorenie in vitro geneticky modifikované terato- (embryo) -kartsinomnyh buniek, pomocou ktorých sa získali mutantné myši na biologické modelovanie ľudskej dedičnej patológie.

Na izoláciu terato- linky (embryo) bol použitý v klimatizačnom -kartsinomnyh bunkovej suspenzné kultúry. V kultivačnom terato- (embryo) -kartsinomnye buniek, ako HSR, rast pre vytvorenie embryoidních teliesok a vyžadujú byť preložené do radu väzbové disociačná udržiavanie pluripotence v živnej vrstve embryonálnych fibroblastoch alebo suspenzné kultivácie v kondicionovaných médiách. Terato- pluripotentné bunky (embryo) - karcinóm linky veľké, guľovité, majú vysokú aktivitu alkalickej fosfatázy, tvoriť agregáty a sú schopné viacsmerové diferenciácie. Keď je zavedený do blastocysty sú začlenené morulae, čo vedie k vytvoreniu chimérických embryí, v rôznych orgánoch a tkanivách, ktoré sú deriváty nachádzajú terato- (embryo) -kartsinomnyh bunky. Avšak, drvivá väčšina takých chimérických embryí umierajú v maternici, a v orgánoch, prežívajúce chiméry novorodené cudzie bunky a zriedka detekované s nízkou hustotou. Zároveň výskyt nádorov (fibrosarkómu, rhabdomyosarkom, a iných typov zhubného opuch a adenómu slinivky brušnej) sa prudko zvyšuje, a nádorových degenerácia často dochádza aj v maternici chimérických embryí.

Väčšina buniek terato-embryo-karcinómu v mikroprostredí normálnych embryonálnych buniek takmer prirodzene získava malígne neoplastické charakteristiky. Predpokladá sa, že nezvratná malignita je spôsobená aktiváciou protoonkogénov v procese štrukturálnych prešmykov. Jedinou výnimkou sú bunkové línie embriokartsinomnoy sst3, teratom odvodený z myší semenníka (línia 129 / Sv-ter), ktoré vykazujú vysokú schopnosť začleniť sa do tkanív a orgánov plodu bez následnej tvorby nádorov u chimérických myší. Deriváty teratobarokarcinómových bunkových línií u chimérnych myší sa prakticky nezúčastňujú na tvorbe primárnych gonocytov. Je zrejmé, že je spojená s vysokou frekvenciou na chromozómy spoločné pre väčšinu terato- (embryo) -kartsinomnyh línie, pri ktorom bunky pozorovanej aneuploidie alebo chromozomálne anomáliu.

V laboratóriu sa získalo niekoľko stabilných línií ľudských terato-embryo-karcinómov, charakterizovaných pluripotenciou, vysokou proliferatívnou aktivitou a schopnosťou diferencovať sa s rastom kultúr. Konkrétne bola použitá línia ľudských terato-embryo-karcinómových buniek NTERA-2 na štúdium mechanizmov neurálnej cytodiferenciácie. Po transplantácii buniek tejto línie do subventrikulárnej oblasti predného mozgu novorodených potkanov sa pozorovala ich migrácia a neurónogenéza. Objavili sa aj pokusy transplantovať neurónové terato- získané kultiváciou buniek (embryo) -kartsinomnoy riadok NTERA-2, pre pacientov s ťahy, ktoré podľa autorov, vedúcich ku klinickému zlepšeniu ochorenia. V tomto prípade neboli zaznamenané prípady malignity transplantovaných buniek teratogeneze embryo-karcinómu NTERA-2 u pacientov s mozgovou príhodou.

Prvý riadok nediferencovaných pluripotentných kmeňových buniek myší na začiatku 80. Rokov minulého storočia sa dostal Evans a Martin, ich výberom z vnútornej bunkovej masy blastocysty - embryoblast. Izolované linky ESC pre dlhodobú zachovanú pluripotenciu a schopnosť diferencovať sa na rôzne typy buniek pod vplyvom faktorov špeciálneho kultivačného média.

Termín "embryonálne pluripotentné kmeňová bunka" patrí Leroy Stevensa, že vyšetrovanie tabak dechtu vplyvu na frekvencii vývoja nádoru upozornil na výskyt spontánnych testikulárne teratokarcinomu lineárnych (129 / objem) myší v kontrolnej skupine. Testikulárne teratokarcinomu bunky boli charakterizované vysokou rýchlosťou proliferácie, a v prítomnosti kvapaliny, ktorý zostáva v dutine brušnej s tvorbou spontánnej diferenciácie neurónov, keratinocyty, chondrocyty, kardiomyocytov, rovnako ako vlasy a kostí, ale bez uvedenia objednaný cytoarchitectonics príslušnej tkaniva. Pri sadení v teratokarcinom bunkovej kultúre pestujú nepripojený k substrátu pluripotentných klonov a vytvorené embryoidních teliesok bola potom zastavená a podrobené spontánneho štiepenia disorderly diferencovať na neuróny, glia, svalových buniek a kardiomyocytov. Stevens zistené, že teratokarcinom myší 129 / objem obsahuje menej ako 1% buniek, ktoré sú schopné diferenciácie na rôznych špecializovaných somatické linky, a sama o sebe diferenciácie závisí od faktorov, ktoré sa ich týkajú (zloženie peritoneálnou tekutina, produkty pridanej ku kultúre zrelých buniek alebo tkanív). Leroy Stevenson predpoklad o prítomnosti medzi teratokarcinomových buniek embryonálnej progenitorové sexuálne zárodočné bunky bol potvrdený: suspenzia embryoblast preimplantačnej embryá buniek dospelých myších tkanivách vytvoreného teratokarcinom, a oddelené od nich čistých bunkových línií po intraperitoneálnom podaní príjemcov, sa členia na neuróny, kardiomyocytov a iných somatických kletki deriváty všetkých troch zárodočných vrstiev. Pri pokusoch in vivo transplantácia ESK (získaný z embryoblastu ale nie trofoblastu) v myšiach embryí v rôznych fázach línie 8-32 blastoméra skončila narodenia chimérického zvieraťa (bez vzniku nádoru) v orgánoch, ktoré detekuje klíčky darcovské tkanivo. Chimérizmus bol pozorovaný aj v rade pohlavných buniek.

Primárne progenitorové zárodočné bunky izolované z myšieho embrya zárodočné pohlavia, morfológiu, imunologické fenotyp a funkčné vlastnosti v súlade s hESCs odvodených od teratokarcinomem Stevenson a embryoblastu. V chiméry narodené po podaní hESCs do blastocysty, allofenny varhany morfogeneze vyznačujúci mozaikovú striedavého darcu a príjemcu štruktúrny a funkčné jednotky sú pečeň, pľúca a obličky. V mnohých prípadoch sa pozorovala tvorba črevných kryptov alebo lalokov pečene, pozostávajúcich súčasne z recipientných a darcovských buniek. Avšak vždy sa uskutočnila morfogenéza podľa genetického programu druhu, ku ktorému patril príjemca, a chimerizmus bol obmedzený výlučne na bunkovú úroveň.

Potom sa zistilo, že proliferácia hESCs bez cytodiferenciační na feeder mezenchýmových buniek vrstvy odvodený (fetálnej fibroblasty) sa vyskytuje v prítomnosti LIF záväzné v selektívnom živnom médiu, ktoré selektívne poskytujú iba prežitie kmeňových a progenitorových buniek, zatiaľ čo prevažná väčšina špecializovaných bunkových elementov umiera. S pomocou týchto techník v roku 1998 James Thomson bolo pridelené päť imortalizované línie embryonálnych kmeňových buniek z vnútornej bunkovej masy blastocysty osoby. Ten istý rok, John Gerhart vyvinul metódu izolácie nesmrteľné ESC čiary pred sexuálnym obláčiku štyri až päť týždňov ľudských embryí. Vzhľadom k svojej jedinečnej vlastnosti, dva roky neskôr, embryonálnych kmeňových buniek a kmeňových buniek definitívny tkanivo začal byť použitý v praxi regeneratívnej medicíne a génovej terapie.