Úloha enzýmov a cytokínov v patogenéze osteoartritídy

V posledných rokoch sa veľa výskumov zameralo na identifikáciu proteáz zodpovedných za degradáciu ECM kĺbovej chrupavky pri osteoartritíde. Podľa moderných myšlienok zohráva dôležitú úlohu v patogenéze osteoartritídy matricové metaloproteázy (MMP). Pacienti s osteoartritídou majú zvýšenú hladinu troch zástupcov MMP - kolagenáz, stromelyzínov a želatináz. Kolagenáza je zodpovedný za degradáciu natívneho kolagénu, stromelysin - kolagén typu IV, laminínu a proteoglykánmi, azhelatinaza - za degradáciu želatíny, kolagén IV, Vh typy XI elastínu. Okrem toho prítomnosť iného enzýmu - agrekanázy, ktorý má vlastnosti MMP a je zodpovedný za proteolýzu zhlukových proteoglykánových agregátov.

Kĺbovej chrupavky ľudských kolagenáz identifikované tri typy úrovniach, ktoré sú zvýšené u pacientov s osteoartritídou - kolagenázy-1 (MMP-1), kolagenáza-2 (MMP-8), kolagenáza-3 (MMP-13). Koexistencia troch rôznych typov kolagenáz v kĺbovej chrupke naznačuje, že každá z nich má svoju špecifickú úlohu. Naozaj, kolagenáza-1 a -2 sú lokalizované prevažne v povrchovej a hornej medziľahlej oblasti kĺbovej chrupavky, zatiaľ čo kolagenáza-3 sa nachádza v dolnej časti medziľahlých a hlboké zóny. Okrem toho, výsledky imunohistochemické štúdie ukázali, že v priebehu progresie úrovne osteoartrózy kolagenázy-3 dosiahne plateau, alebo dokonca klesá, zatiaľ čo úroveň kolagenázy-1 sa postupne zvyšuje. Existujú dôkazy o tom, že u osteoartrózy kolagenáza-1 je hlavne zapojený do zápalového procesu v kĺbovej chrupavky, zatiaľ čo kolagenáza-3 - prestavby tkanív. Cartilagin-3, exprimovaný v chrupavke pacientov s OA, vykonáva intenzívnejšie degradáciu kolagénu typu II ako kolagenáza-1.

Predstaviteľov druhej skupiny metaloproteáz ľudské stromelizinovu identifikovaný ako tri - stromelysin-1 (MMP-3), stromelysinu-2 (MMP-10) a stromelysin-3 (MMP-11). Dnes je známe, že len stromelysín-1 sa podieľa na patologickom procese pri osteoartritíde. V synoviálnej membráne u pacientov s osteoartritídou nie sú stanovené stromelysinu-2, ale bolo zistené, vo veľmi malých množstvách v synoviálnych fibroblastoch pacientov s reumatoidnou artritídou. Stromelysín-3 sa nachádza aj v synoviálnej membráne pacientov s reumatoidnou artritídou v blízkosti fibroblastov, najmä v zónach fibrózy.

V skupine gelatinázy v chrupavkové tkanivo ľudského označené iba dve - 92 kDa gelatináza (gelatináza B, alebo MMP-9) a 72 kDa gelatináza (želatináza A, alebo MMP-2); u pacientov s osteoartritídou sa stanoví zvýšenie hladiny 92 kD želatinázy.

Nie je to tak dávno, že bola identifikovaná ďalšia skupina MMP, ktorá je lokalizovaná na povrchu bunkových membrán a nazýva sa typom membrány MMP (MMP-MT). Do tejto skupiny patria štyri enzýmy - MMP-MT1-MMP-MT-4. Expresia MMP-MT sa nachádza v ľudskej kĺbovej chrupke. Hoci MMP-MT-1 má vlastnosti kolagenázy, MMP-MT-1 a MMP-MT-2 sú schopné aktivovať želatinázu - 72 kD a kolagenázu-3. Úloha tejto skupiny MMP v patogenéze OA si vyžaduje vylepšenie.

Proteinázy sú sekretované vo forme zymogénu, ktorý je aktivovaný inými proteinázami alebo organickými zlúčeninami ortuti. Katalytická aktivita MMP závisí od prítomnosti zinku v aktívnej zóne enzýmu.

Biologická aktivita MMP je riadená špecifickými TIMP. Doteraz boli identifikované tri typy TIMP, ktoré sa nachádzajú v ľudských artikulárnych tkanivách TIMP-1-TIMP-3. Štvrtý typ TIMP je identifikovaný a klonovaný, ale ešte nebol detegovaný v ľudských artikulárnych tkanivách. Tieto molekuly sa špecificky viažu k aktívnemu miestu MMP, aj keď niektoré z nich sú schopné sa viazať na aktívne miesto 72 kDa progelatinase (TIMP-2, -3, -4) a 92 kDa progelatinase (TIMP-1 a -3). Dáta ukazujú, že OA chrupavky v nerovnováhe medzi MMPs a TIMP, ktoré vedie k relatívneho nedostatku inhibítorov, ktoré môžu byť čiastočne súvisia so zvýšenou aktivitou MMP v tkanive. TIMP-1 a -2 sa nachádzajú v kĺbovej chrupke, sú syntetizované chondrocytmi. Pri osteoartritíde v synoviálnej membráne a synoviálnej tekutine bol zistený iba prvý typ TIMP. TIMP-3 sa detekuje výhradne v ECM. TIMP-4 má takmer identickú sekvenciu aminokyselín s TIMP-2 a-ZINA približne 38% -STIMP-1 takmer 50%. Iné cieľové bunky TIMP-4 je zodpovedný za moduláciu aktivácie progelatinase 72 kD povrchu buniek, čo naznačuje dôležitú úlohu ako regulátor ECM remodelácia tkanivovo špecifické.

Ďalším mechanizmom na kontrolu biologickej aktivity MMP je ich fyziologická aktivácia. Predpokladá sa, že enzýmy z rodiny serínových a cysteínových proteáz, ako AP / plazmín a katepsín B, sú fyziologickými aktivátormi MMP. V kĺbovej chrupke pacientov s osteoartritídou bola zistená zvýšená hladina urokinázy (UAP) a plazmínu.

Napriek tomu, že sa v kĺbnych tkanivách nachádza niekoľko typov katepsínov, katepsín-B sa považuje za najpravdepodobnejší aktivátor MMP v chrupavke. V tkanivách ľudského kĺbu boli detekované fyziologické inhibítory serínových a cysteínových proteáz. Aktivita inhibítora AP-1 (IAP-1), ako aj cysteínových proteáz, je znížená u pacientov s osteoartritídou. Podobne ako u MMP / TIMP je nerovnováha medzi serínovými a cysteínovými proteázami a ich inhibítormi, ktorá môže vysvetliť zvýšenú aktivitu MMP v kĺbovej chrupavke pacientov s osteoartritídou. Okrem toho sa MMP môžu navzájom aktivovať. Napríklad stromelyzín-1 aktivuje kolagenázu-1, kolagenázu-3 a želatinázu 92 kD; Kolagenáza-3 aktivuje 92 kD želatinázu; MMP-MT aktivuje kolagenázu-3 a želatináza-72 kD túto aktiváciu zosilňuje; MMP-MT tiež aktivuje 72 kD želatinázu. Cytokíny sa dajú rozdeliť do troch skupín - deštruktívne (prozápalové), regulačné (vrátane protizápalového) a anabolické (rastové faktory).

Typy cytokínov (podľa van den Berg WB et al)

Deštruktívne	Interleukín-1 TNF-alfa Leukemický inhibičný faktor Interleukín-17
Regulačné	Interleukín-4 Interleukín-10 Interleukín-13 Enzýmové inhibítory
Anabolické	Msulin-like rastové faktory TFR-b Kostné morfogenetické proteíny Morfogenetické bielkoviny získané z chrupky

Deštruktívne cytokíny, najmä IL-1 indukovanej zvýšenie uvoľňovania proteázy a inhibujú syntézu proteoglykánov a kolagény chondrocyty. Regulačné, že cytokíny, najmä IL-4 a -10, inhibujú produkciu antagonistu receptora IL-1, za účelom zvýšenia produkcie IL-1 (IL-1 RA), a zníženie aktivity úroveň a NO-syntázy v chondrocytov. Tak, IL-4 antagonizuje IL-1 troma spôsobmi: 1) znižuje produkciu a zabraňuje jeho účinkov, 2) zvyšuje produkciu základný "scavenger" IL-1 Par a 3) znižuje produkciu primárne sekundárne "messenger» NO. Okrem toho IL-4 znižuje degradáciu enzýmov tkaniva. V podmienkach in vivo optimálneho terapeutického účinku je dosiahnuté kombináciou IL-4 a IL-10. Anabolické faktory, ako kakTFR-p, a IGF-1, nie je naozaj zasahovať do produkcie alebo pôsobenia IL-1, ale znázorňujúci opačnú aktivitu, napríklad stimulujú syntézu proteoglykanu a kolagénu, inhibujú aktivitu proteázy a TGF (3, tiež inhibuje uvoľňovanie enzýmov a stimuluje ich inhibítory.

Prozápalové cytokíny sú zodpovedné za zvýšenú syntézu a expresiu MMP v tkanivách kĺbov. Sú syntetizované v synoviálnej membráne a potom difundujú do kĺbovej chrupavky cez synoviálnu tekutinu. Prozápalové cytokíny aktivujú chondrocyty, ktoré sú tiež schopné produkovať prozápalové cytokíny. V kĺboch postihnutých osteoartrózou hrá úlohu efektora zápalu hlavne bunky synoviálnej membrány. Je to synovitída typu makrofágu, ktorá vylučuje proteázy a zápalové mediátory. Medzi nimi, v patogenéze osteoartritídy, sa do najväčšej miery podieľajú IL-f, TNF-a, IL-6, leukemický inhibičný faktor (LIF) a IL-17.

Biologicky aktívne látky, ktoré stimulujú degradáciu kĺbovej chrupavky pri osteoartritíde

• Interleukín-1
• Interleukín-3
• Interleukín-4
• TNF-alfa
• Faktory stimulujúce kolónie: makrofágy (monocyty) a granulocyt-makrofágy
• Látka P
• PGE ₂
• Aktivátory plazminogénu (typy tkaniva a urokinázy) a plazmin
• Metalloproteázy (kolagenázy, ellastázy, stromelysíny)
• Katepsíny A a B
• detektívka
• Bakteriálne lipopolysacharidy
• Fosfolipáza Ag

Údaje z literatúry ukazujú, že IL-ip a prípadne TNF-a sú hlavnými mediátormi deštrukcie kĺbových tkanív pri osteoartritíde. Nie je však známe, či fungujú nezávisle od seba alebo či medzi nimi existuje funkčná hierarchia. Na modeloch osteoartrózy na zvieratách bolo preukázané, že IL-1 blokáda účinne bráni deštrukciu kĺbovej chrupavky, zatiaľ čo blokáda TNF-a vedie k oslabeniu zápalu v kĺbových tkanivách. V synoviálnej membráne, synoviálnej tekutine a chrupavke pacientov boli zistené zvýšené koncentrácie obidvoch cytokínov. Chondrocyty sú schopné zvýšiť syntézu nielen proteázy (MMP a hlavne AP), ale aj menšie kolagénov, ako je typu I a III, ako aj znížiť syntézu kolagénu typu II a IX a proteoglykánmi. Tieto cytokíny tiež stimulovať aktívnych foriem kyslíka a zápalové mediátory, ako PGE ₂. Výsledkom takýchto makromolekulových zmien kĺbovej chrupavky v osteoartritídy je neúčinné opravné procesy, čo vedie k ďalšej degradácii chrupavky.

Vyššie uvedené prozápalové cytokíny modulujú procesy inhibície / aktivácie MMP pri osteoartritíde. Napríklad, nerovnováha medzi úrovňou TIMP-1 a MMP v chrupavke v osteoartritídy môže byť sprostredkovaná IL-ip, pretože štúdie in vitro preukázali, že zvýšenie koncentrácie IL-1 beta znižuje koncentráciu TIMP-1 a MMP zvýšená syntéza chondrocyty. Syntéza AP je tiež modulovaná IL-1 beta. Stimulácia in vitro chondrocytoch kĺbovej chrupavky s IL-1 vyzyvet dávke závislé zvýšenie syntézy a prudkému poklesu AP syntézy PAI-1. Schopnosť IL-1 pre zníženie syntézy PAI-1, syntézy a stimulovať AP je silný mechanizmus pre generovanie plazmínový aktivácie a MMP. Okrem toho, plazmín je nielen enzým aktivujúci iné enzýmy, ale tiež sa podieľa na degradácii chrupavky priamu proteolýzou.

IL-ip je syntetizovaný ako inaktívny prekurzorové hmotnosti 31 kD (pre-IL-ip), Azat, po odštiepení signálneho peptidu, sa konvertuje na aktívny cytokínu z hmotnosti 17,5 kD. V tkanivách kĺbov, vrátane synoviálnej membrány a synoviálnej tekutine kĺbovej chrupavky, IL-ip detekovaný v aktívnej forme, a v štúdiách in vivo preukázali schopnosť synoviálnej membrány v osteoartritíde sekréciu tohto cytokínu. Niektoré serínové proteázy sú schopné konvertovať pre-IL-ip na svoju bioaktívnu formu. U cicavcov, také vlastnosti sa nachádzajú iba v jednej proteázy, ktorý patrí do rodiny cysteín aspartatspetsificheskih enzýmov zvanej IL-1p konvertujúceho enzýmu (IKF alebo kaspázy-1). Tento enzým je schopný špecificky konverziu pre-IL-ip biologicky aktívne "zrelé" IL-ip s hmotnosťou 17,5 kD. IKF - proenzýmy s molekulovou hmotnosťou 45 kDa (P45), ktorá je lokalizovaná v bunkovej membráne. Po proenzima P45 proteolytickým štiepením za vzniku dvoch podjednotiek, známe ako P10 a P20, ktorý je charakteristický pre enzymatickú aktivitu.

TNF-a sa tiež syntetizuje ako membránovo viazaný prekurzor s hmotnosťou 26 kD; proteolytickým štiepením sa uvoľňuje z bunky ako aktívna rozpustná forma s hmotnosťou 17 kD. Proteolytické štiepenie sa uskutočňuje pomocou TNF-a-konvertujúceho enzýmu (TNF-KF), ktorý patrí do rodiny adamalysínov. AR Amin a spoluautori (1997) zistili zvýšenú expresiu TNF-CF mRNA v kĺbovej chrupavke pacientov s osteoartritídou.

Biologická aktivácia chondrocytov a synovitocytov IL-1 a TNF-a je sprostredkovaná väzbou na špecifické receptory na povrchu buniek - IL-R a TNF-R. Pre každý cytokín boli identifikované dva typy receptorov: typy IL-IP typu I a II a typy TNF-P I (p55) a II (p75). Na prenos signálov v bunkách kĺbových tkanív reaguje IL-1PI a p55. IL-1P typ I má mierne vyššiu afinitu k IL-1 beta než k IL-la; IL-1P typ II - naopak má väčšiu afinitu k IL-1a ako k IL-ip. Nie je jasné, či IL-IP II typ II môže sprostredkovať IL-1 signály alebo slúži iba kompetitívnym inhibí-cím väzby IL-1 na IL-1PI typ. V hondroiitah a synoviálnych fibroblastov pacientov s osteoartritídou nájsť veľké množstvo IL-1PI a p55, čo vysvetľuje vysokú citlivosť týchto buniek na stimuláciu cytokíny relevantné. Tento proces vedie k zvýšeniu sekrécie proteolytických enzýmov ak zničeniu kĺbovej chrupavky.

Nie je vylúčená účasť IL-6 na patologickom procese pri osteoartritíde. Tento predpoklad je založený na nasledujúcich zisteniach:

• IL-6 zvyšuje počet zápalových buniek v synoviálnej membráne,
• IL-6 stimuluje proliferáciu chondrocytov,
• IL-6 zvyšuje účinky IL-1 na zvýšenie syntézy MMP a inhibíciu syntézy proteoglykánov.

Avšak, IL-6 je schopný vyvolať produkciu TIMP, ale nemá vplyv na produkciu MMP je preto za to, že tento cytokín sa podieľa na procese zadržanie proteolytické degradácii kĺbovej chrupavky, ktorá sa vykonáva pomocou mechanizmu spätnej väzby.

Ďalšie reprezentatívne rodiny IL-6 je LIF - cytokín, ktorý je produkovaný chondrocytov získaných od pacientov s osteoartritídou, v odozve na stimuláciu prozápalovými cytokíny, IL-ip a TNF-a. LIF stimuluje resorpciu proteoglykánov chrupavky, ako aj syntézu produkcie MMP a NO. Úloha tohto cytokínu pri osteoartritíde nie je úplne pochopená.

IL-17 je 20 až 30 kD homodimér, ktorý má podobný účinok na IL-1, ale oveľa menej výrazný. IL-17 stimuluje syntézu a uvoľňovanie radu prozápalových cytokínov, vrátane IL-ip, TNF-a, IL-6 a MMP v cieľových bunkách, ako sú ľudské makrofágy. Okrem toho IL-17 stimuluje produkciu NO s chondrocytmi. Rovnako ako LIF, úloha IL-17 v patogenéze OA bola len málo skúmaná.

Anorganický voľný radikál NO hrá dôležitú úlohu pri degradácii kĺbovej chrupavky s OA. Chondrocyty získané od pacientov s osteoartritídou produkujú viac NO ako spontánne tak aj po stimulácii s prozápalovými cytokínmi v porovnaní s normálnymi bunkami. Vysoké koncentrácie NO detekovaný v synoviálnej tekutine a sére pacientov s osteoartritídou - je výsledkom zvýšenej expresie a syntézy indukovanej NO-syntázy (hNOC) - enzým zodpovedný za produkciu NO. Nedávno bola klonovaná DNA špecifická pre chondrocyty hNOC, bola stanovená aminokyselinová sekvencia enzýmu. Aminokyselinová sekvencia indikuje 50% identitu a 70% podobnosť s hNOC špecifickou pre endotel a nervové tkanivo.

NO inhibuje syntézu makromolekúl ECM kĺbovej chrupavky a stimuluje syntézu MMP. Navyše zvýšenie produkcie NO je sprevádzané poklesom syntézy antagonistu IL-IP (IL-1RA) chondrocytmi. Zvýšenie hladiny IL-1 a zníženie IL-1 RA vedie tak k hyperstimulácii NO chondrocytov, čo zase vedie k zvýšenému odbúravaniu chrupavkovej matrice. Boli hlásené terapeutické účinky in vivo selektívneho inhibítora hNOC na progresiu experimentálnej osteoartritídy.

Prírodné inhibítory cytokínov môžu priamo inhibovať väzbu cytokínov na receptory bunkových membrán a znižovať ich prozápalovú aktivitu. Prírodné inhibítory cytokínov možno rozdeliť do troch tried podľa spôsobu ich účinku.

Prvá trieda inhibítorov zahŕňa antagonisty receptora, ktoré zabraňujú väzbe ligandu na jeho receptor prostredníctvom súťaže o väzbové miesto. Doteraz bol takýto inhibítor nájdený len pre IL-1, hore uvedený kompetitívny inhibítor IL-1 / ILIP IL-1 PA systém. IL-1 RA blokuje mnoho účinkov, ktoré sú pozorované v tkanivách kĺbov u osteoartritídy, vrátane syntézy prostaglandínov u synoviálnych buniek, produkcie kolagenázy chondrocyty a degradáciou chrupavky v skrinke.

IL-1RA sa deteguje v rôznych formách - jeden rozpustný (rIL-1PA) a dva intercelulárne (μIL-1PAI a μIL-1APAP). Afinita rozpustnej formy IL-1RA je 5-krát vyššia ako u medzibunkových foriem. Napriek intenzívnemu vedeckému hľadaniu zostáva táto funkcia neznáma. Eksperimety in vitro preukázali, že inhibícia IL-1 beta aktivity požadovanej koncentráciu IL-1Pa 10-100 krát prekračuje limit, v podmienkach in vivo vyžaduje tisícnásobne zvýšenie koncentrácie IL-1Pa. Táto skutočnosť môže čiastočne vysvetliť relatívny nedostatok IL-1 RA a nadbytok IL-1 v synovii pacientov s osteoartritídou.

Druhá skupina prírodných inhibítorov cytokínov je reprezentovaná rozpustnými receptormi cytokínov. Príkladom takýchto inhibítorov u ľudí, ktoré súvisia s patogenézou osteoartrózy, sú pIL-1P a pp55. Rozpustné cytokinové receptory sú skrátené formy bežných receptora väzbou k cytokínu, ktoré bránia ich väzba na membránové asociované receptory cieľových buniek, pôsobí mechanizmom kompetitívneho antagonizmu.

Hlavným prekurzorom rozpustných receptorov je membránovo viazaný IL-1PP. Afinita rIL-IP vzhľadom na IL-1 a IL-1 PA je odlišná. Preto pIL-1PH má väčšiu afinitu k IL-1p ako k IL-1 PA a pIL-1PI vykazuje vyššiu afinitu k IL-1RA než k IL-ip.

Pre TNF existujú aj dva typy rozpustných receptorov - pp55 a pp75, ako sú rozpustné IL-1 receptory, ktoré sú tvorené "oplodňovaním" (dumpingom). In vivo sa obidva receptory nachádzajú v tkanivách postihnutých kĺbov. Uvažuje sa o úlohe rozpustných receptorov TNF v patogenéze osteoartritídy. Predpokladá sa, že v nízkych koncentráciách, ktoré stabilizujú trojrozmerné štruktúry TNF a zvyšujú polčas bioaktívne cytokínu, zatiaľ čo vysoké koncentrácie PP55 a PP75 môže znížiť aktivitu TNF kompetitívneho antagonizmu. Zdá sa, že pp75 môže pôsobiť ako nosič TNF, čo uľahčuje jeho väzbu na receptor spojený s membránou.

Tretia trieda prírodných inhibítorov cytokínov je reprezentovaná skupinou protizápalových cytokínov, ktoré zahŕňajú TGF-beta, IL-4, IL-10 a IL-13. Protizápalové cytokíny znižujú tvorbu prozápalových, rovnako ako niektorých proteáz, stimulujú produkciu IL-1RA a TIMP.