Molekulárne genetické metódy na diagnostiku dedičných ochorení

Metódy DNA technológie sa používajú na určenie lokalizácie v určitom chromozóme mutantný gén zodpovedný za vznik určitých foriem dedičných chorôb. Vzhľadom k tomu, gén je segment DNA a mutácie génu - poškodenie primárnej štruktúry DNA (mutácie sa rozumie všetky zmeny v sekvencii DNA, bez ohľadu na ich umiestnenie a vplyvu na jednotlivé životaschopnosť), potom sondáž prípravky chromozómov v metafáze pacientov dedičné ochorenie, možné stanoviť lokalizácia patologického génu. Metódy molekulárnej genetiky vytvoriť možnosť diagnostiku ochorení, pri zmenenej štruktúry DNA, ktoré umožňujú zistiť lokalizáciu dedičných porúch. Molekulárne genetické metódy môžu odhaliť mutácie spojené s nahradením dokonca jednej bázy.

Najdôležitejšou etapou identifikácie génu je jeho izolácia. DNA môže byť izolovaná z akéhokoľvek typu tkaniva a buniek obsahujúcich jadrá. Kroky izoláciu DNA zahŕňajú rýchle lýze buniek odstreďovaním s odstránením fragmenty bunkových organel a membrán, enzymatickou deštrukcii proteínov a ich extrakciu rozpúšťadlom s fenolom a chloroformom, koncentrácia DNA vyzrážaním v etanole.

Genetické laboratóriá DNA sa často izoluje z krvných leukocytov, pre ktoré je pacient odobratých 5-20 ml žilovej krv do sterilnej skúmavky s roztokom antikoagulantu (heparín). Leukocyty sa potom separujú a spracujú podľa krokov uvedených vyššie.

V ďalšej fáze prípravy materiálu na štúdiu - DNA "cut" na fragmenty na miestach s prísne špecifickou sekvenciou bázou sa vykonáva pomocou bakteriálnych enzýmov - restrikčná endonukleáza (reštrikčných enzýmov). Reštrikčné enzýmy rozoznávajú špecifické sekvencie 4-6, aspoň 8-12 nukleotidov do molekuly dvouřetězcové DNA a jeho rozdeliť na fragmenty týchto sekvencií lokalizáciu miest nazývajú reštrikčné miesta. Počet produkoval reštrikčné fragmenty DNA určená frekvenciou výskytu reštrikčných miest a fragmenty o veľkosti - povahe rozloženie týchto miest pozdĺž dĺžky pôvodnej molekuly DNA. Čím častejšie sú umiestnené restrikčné miesta, tým kratšie sú fragmenty DNA po obmedzení. V súčasnej dobe existuje viac ako 500 rôznych typov reštrikčnými enzýmami bakteriálneho pôvodu, a každý z týchto enzýmov uznáva svoju špecifickú sekvenciu nukleotidov. V budúcnosti sa môžu ako genetické markery pre DNA použiť restrikčné miesta. Vzniknuté reštrikčné fragmenty DNA je možné triediť podľa dĺžky elektroforézy na agarózovom alebo polyakrylamidovom gélu, a tak môže byť určená ich molekulovej hmotnosti. Zvyčajne sa pre detekciu DNA v géle používaného špecifického farbenie (zvyčajne etidiumbromidom) a zobrazenie gélu v prechádzajúcom svetle ultrafialové. Lokalizácia lokalizácie DNA má červenú farbu. Naproti tomu sa pri spracovaní niekoľkých DNA reštrikčné endonukleázy vytvorené tak veľa fragmenty rôznej dĺžky, ktoré sa nedarí byť oddelené elektroforézou, že nie je možné vizuálne identifikovať jednotlivé fragmenty DNA sa elektroforegramu (vyrobeného rovnomerné zafarbenie po celej dĺžke gélu). Preto sa na identifikáciu požadovaných fragmentov DNA v takom géli používa hybridizačná metóda s označenými DNA sondami.

Každý segment jednoreťazcová DNA alebo RNA je schopný viazať (hybridizácii) s komplementárnym reťazcom, s guanín je vždy spojená s cytozín, adenín s tymínu. Toto je tvorba dvojvláknovej molekuly. Ak je jednovláknová kópia klonovaného génu označená rádioaktívnou značkou, získa sa sonda. Sonda je schopná nájsť komplementárny segment DNA, ktorý je potom ľahko identifikovateľný rádioutografiou. Rádioaktívna sonda pridaná k liečivu roztiahnutých chromozómov umožňuje, aby bol gén lokalizovaný na určitom chromozóme: niektoré DNA vzorky môžu byť identifikované DNA sonde v Southern blotting. Hybridizácia nastane, ak testovaná časť DNA obsahuje normálny gén. V prípade, že existuje abnormálne sekvencie nukleotidov, tj. Zodpovedajúce chromozómov štruktúry obsahujú mutantný gén, nedôjde hybridizácia, ktorý umožňuje určiť lokalizáciu abnormálneho génu.

Na získanie DNA sondy sa používa metóda klonovania génov. Princíp spočíva v tom, že fragment DNA zodpovedajúce každý gén alebo oblasti génu vloženého do klonovacieho častice, zvyčajne bakteriálne plazmid (kruhové extrachromozomální DNA prítomné v bakteriálnych bunkách a nesúci gény rezistencie na antibiotiká), a potom sa baktérie ktoré majú plazmid so zabudovaným ľudským génom, sú znásobené. Vzhľadom k syntetických postupoch je možné získať plazmid miliardy kópií ľudského génu alebo jeho časti.

Ďalej sa ako sondy na vyhľadávanie komplementárnych sekvencií používajú kópie DNA označené rádioaktívnou značkou alebo fluorochrómmi zo skupiny študovaných molekúl DNA.

V súčasnosti existuje veľa druhov metód používajúcich sondy DNA na diagnostiku génových mutácií.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7],