Imunologický výskum v urológii

Priradenie imunogramu urologickému pacientovi znamená, že ošetrujúci lekár predpokladá prítomnosť porúch v imunitnom systéme. Duplicitné bakteriálne, vírusové, plesňové infekcie, alergické reakcie, systémové ochorenia môžu byť príznaky týchto porúch, ktoré sa vyznačujú radom syndrómy (infekcia, rakoviny, alergických, autoimunitných, lymfoproliferatívne). Jeden pacient môže mať niekoľko syndrómov. Napríklad, chronické infekčné choroby (infekčná syndróm) môže spôsobiť zlyhanie imunity a imunity sa môže prejaviť predispozície k infekčných chorôb a rakoviny (Cancer syndróm). Náchylnosť k infekciám, môže dôjsť na pozadí sekundárneho imunodeficitu, ktorý sa vyvíjal v dôsledku lymfoproliferatívne ochorenia, ako je leukémia. Existujú tri hlavné skupiny patologických zmien v imunitnom systéme:

• kvantitatívnej alebo funkčnej nedostatočnosti jedného alebo druhého spojenia imunity, čo vedie k vzniku stavu imunitnej nedostatočnosti;
• porušenie v rozpoznaní antigénu imunitným systémom, čo vedie k vývoju autoimunitných procesov;
• hyperreaktívna alebo "zvrátená" imunitná odpoveď, prejavujúca sa vývojom alergických ochorení.

K dispozícii sú skríningy (testy úrovne 1) a kvalifikačné (testy na úrovni 2) metódy imunodiagnostiky. Prvé existujú na to, aby opravili porušenia v imunitnom systéme, posledne menované - aby vytvorili mechanizmy, ktoré sa podieľajú na ich vykonávaní na účely ďalšej imunokorekcie.

B-Bunkové spojenie imunity

Metódy skríningu

• Stanovenie relatívnej a absolútnej počtu B-lymfocytov pomocou imunofluorescencie alebo prietoková cytometria s použitím monoklonálnych protilátok k B-bunkovej antigény (CD19, CD20, vyznačujúci sa tým, CD - zhluk diferenciácia). Obsah B lymfocytov u normálnych dospelých: 8-19% z celkového počtu leukocytov alebo 190-380 buniek / ml. Zvýšenie obsahu B lymfocytov sa vyskytuje v akútnej a chronickej bakteriálne a plesňové infekcie, chronické ochorenie pečene, systémové ochorenia spojivového tkaniva, chronická lymfocytárnej leukémie, mnohopočetný myelóm.
• Stanovenie koncentrácie imunoglobulínov nespespetsificheskih (F, M, G, E) jednoduchú radiálne imunodifúzia alebo turbometrii nefelometria, radioimunotestu alebo enzýmovým imunotest (EIA). Normy pre dospelých: imunoglobulín (Ig) A 0,9 - 4,5 g / l. IgM 03-3,7 g / l. IgG 8,0 až 17 g / l. Zvýšenie koncentrácie imunoglobulínov nastáva pri rovnakých patologických stavoch, v ktorých dochádza k zvýšeniu obsahu B lymfocytov. Zníženie koncentrácie imunoglobulínov je vrodené hypogamaglobulinémia, nádory imunitného systému, odstránenie sleziny, straty bielkovín, pri ochorení obličiek alebo čriev, liečbu cytostatikami a immunodepreesantami.

Určovanie metód

• Určenie cirkulujúcich imunitných komplexov v krvi selektívnou precipitáciou v polysilylglykole, po ktorej nasleduje spektrofotometrické testovanie hustoty (normálne 80-20 UE). Zvýšenie cirkulujúcich imunitných komplexov je charakteristické pre akútne bakteriálne, plesňové, vírusové infekcie, autoimunitné, imunokomplexné choroby, sérová choroba, alergické reakcie typu 3;
• Stanovenie špecifických imunoglobulínov v krvi vo vzťahu k bakteriálne a vírusové antigény, deoxyribonukleová kyselina (DNA) v autoimunitných ochorení, identifikáciu spermií (autoimunitné neplodnosti) a protivopochechnyh protilátok (pyelonefritídy a glomerulonefritída) radiálne imunodifúznemu alebo ELISA.
• Určenie antispermových protilátok v spermií [MAR-test (zmiešaná antiglobulínová reakcia)], norma je negatívna.
• Určenie koncentrácie imunoglobulínov v moči na účely diferenciálnej diagnózy medzi pyelonefritídou a glomerulonefritídou (selektivita proteinúrie).
• Určenie IgE v prostatickej šťave na diagnostiku alergickej prostatitídy pomocou radiálnej imunodifúzie alebo ELISA. 
• Výskum reakcie blasttransformation reakciu B lymfocytov na B-bunky mitogénom (pokeweed mitogénom pre stimuláciu blasttransformation reakciu B lymfocytov v prítomnosti T-lymfocytov), pričom štandardná hodnota 95-100%.

T-bunková väzba imunity

Metódy skríningu

• Stanovenie relatívnej a absolútnej počet zrelých CD3 T lymfocytárnej reakcii pomocou imunofluorescencie alebo prietoku cytofluorometrií použitím anti-SDZ monoklonálne protilátky. Norma pre dospelých je 58-76% alebo 1100-1700 buniek / μl. Zníženie počtu T-lymfocytov je indikátorom nedostatočnosti bunkového spojenia imunity. To je charakteristické pre niekoľko sekundárnych a primárnej imunodeficiencie (chronické bakteriálne a vírusové infekcie: tuberkulóza, syndróm získaného zlyhania imunity, rakovina, chronické zlyhanie obličiek, trauma, stres, starnutie, podvýživa, liečbu cytotoxickými liekmi, ionizujúce žiarenie). Zvýšenie počtu T-lymfocytov nastáva na pozadí hyperaktivity imunity alebo lymfoproliferatívnych ochorení. Pri zápale sa najprv zvyšuje počet T-lymfocytov a potom klesá. Absencia poklesu T-lymfocytov naznačuje chronizáciu zápalového procesu.
• Hodnotenie subpopulácií lymfocytov.
  • Určenie počtu T-pomocníkov (anti-CD4 protilátka). Normálne je to 36-55% alebo 400-1100 buniek / μl. Zvýšenie počtu týchto buniek sa vyskytuje u autoimunitných ochorení, Waldenstromovej choroby, aktivácie implantácie antigraftu; zníženie počtu T-pomocných buniek sa vyskytuje v chronickej bakteriálne, vírusové, protozoálnej infekcie, tuberkulóza, syndróm získanej imunitnej nedostatočnosti, malignít, popáleniny, poranenia, podvýživa, starnutia, liečbu cytostatikami, ionizujúce žiarenie.
  • Určenie počtu T-supresorov (anti-CD4 protilátka). Normálne je to 17-37% alebo 300-700 buniek / μl. Zvýšenie počtu supresorov T sa vyskytuje pri rovnakých podmienkach, v ktorých počet T pomocníkov klesá a ich pokles za rovnakých podmienok, kedy sa zvyšuje obsah T pomocníkov.
  • Imunoregulačný index CD4 / CD8, v norme 1,5-2,5. Hyperaktivita v dávkach vyšších ako 2,5 (alergické a autoimunitné ochorenia); hypoaktivita - menej ako 1,0 (predispozícia na chronické infekcie). Na začiatku zápalového procesu sa imunoregulačný index zvýši, a keď klesne, normalizuje sa.

Určovanie metód

• Určenie počtu prirodzených zabijakov (NK buniek) - anti-CD16 a anti-CD56 protilátok. Norma pre CD 16-lymfocyty je 6-26%, CD56 - 9-19%. Zvýšenie počtu NK-buniek sa vyskytuje v odmietnutia štepu, znížiť - pri vírusových infekcií, rakoviny, primárnej a sekundárnej imunodeficiencie, popálenín, poranení a stresu, liečbu cytostatikami a ionizujúceho žiarenia. 
• Určenie počtu T-lymfocytov s receptorom pre interleukín-2 (aktivačný marker) - anti-CD25 protilátky. Norma je 10-15%. Zvýšenie ich počtu sa pozoruje u alergických ochorení, odmietnutia transplantátu, reakcie na antigény závislých od týmusu v akútnom období primárnej infekcie, zníženie rovnakých ochorení, pri ktorých sa počet NK buniek znižuje.
• Skúmanie expresie aktivačného markera - histokompatibilnej molekuly HLA-DR triedy II. Zvýšená expresia sa vyskytuje pri zápalových procesoch, u pacientov s hepatitídou C, celiakií, syfilisom, akútnymi respiračnými infekciami.
• Hodnotenie apoptózy lymfocytov. Údaj o pripravenosti lymfocytov apoptózy môžu byť identifikované pomocou ich expresie povrchových Fas-receptora (CD95) v mitochondriách a BD-2 protoonkogenu. Apoptóza bola hodnotená spracovanie lymfocytov dvoma fluorescenčnými farbivami: propidium jodidom, ktorý sa viaže na fragmenty DNA a annexinu Y, väzba k fosfatidylserínu na bunkovej membráne sa objaví na začiatku apoptózy. Hodnotenie výsledkov sa vykonáva na prietokovom cytofluorimetri. Výpočet výsledkov je založený na pomere buniek zafarbených rôznymi farbivami. Unstained bunky sú životaschopné bunky, spojené iba s annexinu Y, - prvé známky apoptózy, s propidium jodidom a annexin I - neskorý prejavy apoptózy, farbenie iba propidiumjodidom označuje nekrózu.
• Vyhodnotenie proliferácie T-lymfocytov in vitro.
  • Zmena bunkovej blastogenézy je reakciou blast-transformácie lymfocytov. Leukocyty sa inkubujú s akýmkoľvek mitogénom rastlinného pôvodu (lektíny). Viac bežne používaný fytohemaglutinín počas 72 hodín, potom urobiť rozmazanie, zafarbenie a počítanie počtu výbuchov! Stimulačný index - pomer percento transformovaných buniek v experimente (kultúra PHA) na podiel transformovaných buniek v kontrolnej skupine (kultivačné bez PHA). Reakcia blast-transformácie lymfocytov sa môže hodnotiť zahrnutím rádioaktívneho označenia (ZN-thymdín) do kultivovaných buniek, keď sa pri delení buniek zvyšuje syntéza DNA. Poruchy proliferatívnej odpovede sa vyskytujú tak pri primárnych, ako aj pri sekundárnych imunodeficienciách spojených s infekciami, onkologickými chorobami, renálnou insuficienciou a chirurgickými intervenciami.
  • Vyhodnotenie týchto štúdiách expresie aktivačných markerov (CD25, receptoru transferínu na - CD71) molekúl a MHC triedy II, HLA-DR, ktoré sú v podstate neprítomné na kľudových T-lymfocyty. T lymfocyty stimulované fytohemaglutinín po 3 dňoch expresie aktivačných markerov boli analyzované priamu alebo nepriamu imonufluoreskujúca, prietoková cytometria s použitím monoklonálnych protilátok vylučovaných receptory.
  • Meranie množstva mediátorov syntetizované aktivovanými T lymfocyty [interleukín (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, gama-interferón, atď.], Rádioimunoanalyticky alebo testom ELISA. Zvlášť dôležité je odhad koncentrácie y-interferónu a IL-4 sa obaja markery YOU Th2 a v supernatante kultúr a aktivované intracelulárne. Ak je to možné, je vhodné pre stanovenie expresie génu pre príslušnú cytokínu úrovni mediatorova ribonukleovej kyseliny v treonínu produkujúcich buniek a expresie receptora intenzít pre príslušné cytokíny.
    
• Reakcia inhibície migrácie lymfocytov. Senzitizované T-lymfocyty pri reakcii s lymfokínmi uvoľňujúcimi antigén vrátane faktorov. Inhibíciu migrácie lymfocytov. Fenomén inhibície sa pozoruje, keď sa mitogény zavedú do kultúry buniek. Vyhodnotenie stupňa inhibície umožňuje posúdiť schopnosť lymfocytov uvoľňovať cytokíny. Obvykle je frekvencia migrácie v závislosti od konkrétneho mitogénu 20-80%.
• Vyhodnotenie cytotoxicity NK buniek. Určte schopnosť prirodzených zabíjačských buniek usmrcovať cieľové bunky erytromyeloidnej línie K-562. Ak sa vyhodnotí cytotoxicita závislá od protilátok, použijú sa cieľové bunky potiahnuté protilátkami IgG. Cieľové bunky sa značia 3H-uridínom a inkubujú sa s efektorovými bunkami. Smrť cieľových buniek sa odhaduje z uvoľnenia rádioaktívneho označenia do roztoku. Zníženie cytotoxicity sa vyskytuje u malígnych novotvarov. V niektorých prípadoch, keď je potrebná prognóza účinnosti liečby interleukínmi, sa cytotoxicita NK buniek vyhodnotí pri inkubácii s určitými cytokínmi.

Vyšetrenie funkcie fagocytov

Metódy skríningu

Vyšetrenie absorpcie mikrobiálnych buniek fagocytmi (fagocytóza latexových častíc, testovaná kultúra stafylokokov, Escherichia coli alebo mikroorganizmy izolované od pacienta). Centrifugáciou heparinizovanej krvi sa izoluje suspenzia leukocytov, pre opsonizáciu sa pridá sérum IV krvnej skupiny (opsoníny sú proteíny, ktoré zvyšujú fagocytózu). Mikrobiálna suspenzia sa zriedi, zmieša s leukocytmi a inkubuje sa 120 minút, odoberie sa vzorka na analýzu po 30.90.120 minútach po začiatku inkubácie. Z vybraných suspenzií leukocytov sa urobia škvrny. Určte nasledujúce indikátory fagocytózy:

• fagocytový index - percento buniek, ktoré vstúpili do fagocytózy za 30 minút a 120 minút inkubácie; normatívna hodnota fagocytového indexu (30) 94% fagocytového indexu (120) - 92%;
• fagocytové číslo - priemerný počet baktérií, ktoré sú intracelulárne; normatívna hodnota fagocytového čísla (30) 11%, fagocytového čísla (120) - 9,8%;  
• koeficient počtu fagocytov - pomer fagocytového čísla (30) k fagocytovému číslu (120); normálne 1,16;
• baktericídny index neutrofilov je pomer počtu mikrób usmrtených vo vnútri fagocytov a celkového počtu prijatých mikróbov; v norme 66%.

Určovanie metód

• Vyšetrovanie baktericídnej aktivity fagocytov v teste s nitrosín tetrazóliom (NST) je test NST. Do leukocytov sa pridá tetrazolium oxidu dusného v žlto. Keď sa farbivo absorbuje neutrofilom, proces redukcie prebieha pod pôsobením voľných radikálov kyslíka, čo vedie k modrému zafarbeniu. Reakcia sa uskutočňuje v 96-jamkovej doštičke s plochým dnom. V prvých troch jamkách so zmesou HCT a leukocytov sa pridá roztok Hanks (spontánne HCT), v poslednom prípade - latexové častice; inkubujte pri teplote 37 ° C počas 25 minút. Výsledky sa čítajú pri 540 nm na čítači a vyjadrujú sa v konvenčných jednotkách. Vypočítajte stimulačný faktor (K _st ), ktorý sa rovná pomeru optickej hustoty v stimulovaných jamkách k priemernej optickej hustote v jamkách bez stimulácie. U zdravých ľudí _{spontánne HCT} = 90 ± 45 UE, NST _Stim = 140 ± 60 UE. K _st = 1,78 ± 0,36.
• Skúmanie adhéznych molekúl. Pomocou prietokovej cytofluorimetrie sa stanoví expresia povrchových antigénov CD11a / CD18, CD11b / CD18, CD11c / CD18. Imúnne nedostatky s porušením adhézie sa prejavujú recidivujúcimi infekciami, pomalým hojením rán a neprítomnosťou hnisu v miestach infekcie.

Vyšetrovanie komplementového systému

Metódy skríningu

Stanovenie hemolytickej aktivity komplementu - štúdium klasickej dráhy aktivácie komplementu. Rôzne riedenia séra pacienta a zdravého človeka sa pridajú k erytrocytom berana pokrytého protilátkami. Jednotka hemolytickej aktivity sa považuje za inverznú zriedenie séra, v ktorej je 50% erytrocytov zničených. Stupeň hemolýzy sa vyhodnocuje fotometricky výťažkom hemoglobínu v roztoku. Zníženie hemolytickej aktivity komplementu sa pozoruje pri systémovom lupus erythematosus s renálnym postihnutím, akútnou glomerulonefritídou. Kombinované imunodeficiencie, myasténia gravis, vírusová hepatitída, lymfómy, zvýšenie - s obštrukčnou žltačkou, tyreoiditída Hashimoto. Reumatizmus, reumatoidná artritída, nodulárna periarteritida. Dermatomyozitídy, infarktu myokardu, ulceróznej kolitídy, Reiterovho syndrómu, dny.

Určovanie metód

• Určenie zložiek komplementu. Kvantitatívne stanovenie sa uskutočňuje metódou radiálnej imunodifúzie a nefelometrie.
  Štúdia nie je informatívna, pokiaľ nie sú zmenené antigénne vlastnosti zložiek komplementu.
• Zistilo sa, že Clq zložka komplementu zvyšuje fagocytózu a sprostredkováva bunkovú cytotoxicitu. Jeho pokles sa prejavuje pri ochoreniach imunitných komplexov, systémového lupus erythematosus, hnisavých infekcií a nádorov.
• Komponent C3 sa podieľa na aktivácii klasickej a alternatívnej cesty komplementu. Zníženie jeho koncentrácie je spojené s chronickými bakteriálnymi a plesňovými infekciami, prítomnosťou cirkulujúcich alebo tkanivových imunitných komplexov.
• Komponent C4 sa podieľa na aktivácii klasickej cesty. Zníženie jeho koncentrácie je spojené s predĺženou aktiváciou komplementu s imunitnými komplexmi a znížením koncentrácie C1 inhibítora, ktorý riadi aktiváciu klasickej dráhy komplementu. Nedostatok C4 sa vyskytuje pri systémovom lupus erythematosus, zvýšenie C4 nastáva pri ochorení obličiek, odmietnutí transplantátu, akútneho zápalu a ochorení gastrointestinálneho traktu.
• C5a je malý fragment molekuly C5, oddelený od neho ako výsledok aktivácie komplementového systému. Zvýšenie koncentrácie sa vyskytuje pri zápaloch, sepsách, atopických a alergických ochoreniach.
• Cl-inhibítor je multifunkčný faktor. Kontroluje aktiváciu C1 zložky komplementu, inhibuje aktivitu kalikreínu, plazmínu a aktivovaného faktora Hageman, proteáz Cls a Or. Nedostatok C1-inhibítora vedie k angioedému.
• doplnkových štúdií. K štandardnému séru bez komplementárnej zložky sa pridá testovacie sérum a stanoví sa hemolytická aktivita komplementu. Ak sa hemolytická aktivita neobnoví na normálnu úroveň, predpokladá sa, že aktivita tejto zložky komplementu v testovacom sére je znížená.

[1], [2], [3], [4], [5], [6]