Mikroskopická analýza spúta

Mikroskopické vyšetrenie natívnych a fixovaných zafarbených preparátov spúta umožňuje podrobné štúdium jeho bunkového zloženia a do istej miery odráža povahu patologického procesu v pľúcach a prieduškách, jeho aktivitu, identifikovať rôzne vláknité a kryštalické útvary, ktoré majú tiež dôležitú diagnostickú hodnotu, a nakoniec zhruba posúdiť stav mikrobiálnej flóry dýchacích ciest (bakterioskopia).

Mikroskopia používa natívne a zafarbené preparáty spúta. Na štúdium mikrobiálnej flóry (bakterioskopia) sa nátery spúta zvyčajne farbia podľa Romanovského-Giemsu, podľa Grama a na identifikáciu Mycobacterium tuberculosis podľa Ziehla-Neelsena.

Bunkové prvky a elastické vlákna

Z bunkových prvkov, ktoré možno zistiť v spúte pacientov s pneumóniou, majú diagnostickú hodnotu epitelové bunky, alveolárne makrofágy, leukocyty a erytrocyty.

Epitelové bunky. Spinozómový epitel z ústnej dutiny, nosohltana, hlasiviek a epiglottis nemá diagnostickú hodnotu, hoci detekcia veľkého počtu spinozómových epitelových buniek spravidla naznačuje nízku kvalitu vzorky spúta dodanej do laboratória a obsahujúcu významnú prímes slín.

U pacientov s pneumóniou sa spúto považuje za vhodné na vyšetrenie, ak pri mikroskopii s nízkym zväčšením počet epitelových buniek v zornom poli nepresiahne 10. Väčší počet epitelových buniek naznačuje neprijateľnú prevahu orofaryngeálneho obsahu v biologickej vzorke.

Alveolárne makrofágy, ktoré sa v malom množstve nachádzajú aj v akomkoľvek spúte, sú veľké bunky retikulohistiocytového pôvodu s excentricky umiestneným veľkým jadrom a hojnými inklúziami v cytoplazme. Tieto inklúzie môžu pozostávať z drobných prachových častíc (prachových buniek) absorbovaných makrofágmi, leukocytmi atď. Počet alveolárnych makrofágov sa zvyšuje počas zápalových procesov v pľúcnom parenchýme a dýchacích cestách vrátane pneumónie.

Stĺpcovité riasinkové epitelové bunky vystieľajú sliznicu hrtana, priedušnice a priedušiek. Vyzerajú ako predĺžené bunky, rozšírené na jednom konci, kde sa nachádza jadro a riasinky. Stĺpcovité riasinkové epitelové bunky sa nachádzajú v akomkoľvek spúte, ale ich zvýšenie naznačuje poškodenie sliznice priedušiek a priedušnice (akútna a chronická bronchitída, bronchiektázia, tracheitída, laryngitída).

Leukocyty sa v malom množstve (2 – 5 v zornom poli) nachádzajú v akomkoľvek spúte. Pri zápale pľúcneho tkaniva alebo sliznice priedušiek a priedušnice, najmä pri hnisavých procesoch (gangréna, pľúcny absces, bronchiektázia), sa ich množstvo výrazne zvyšuje.

Pri farbení preparátov spúta podľa Romanovského-Giemsy je možné rozlíšiť jednotlivé leukocyty, čo má niekedy dôležitú diagnostickú hodnotu. Pri výraznom zápale pľúcneho tkaniva alebo bronchiálnej sliznice sa teda zvyšuje celkový počet neutrofilných leukocytov aj počet ich degeneratívnych foriem s fragmentáciou jadier a deštrukciou cytoplazmy.

Zvýšenie počtu degeneratívnych foriem leukocytov je najdôležitejším znakom aktivity zápalového procesu a závažnejšieho priebehu ochorenia.

Erytrocyty. Jednotlivé erytrocyty sa nachádzajú takmer v každom spúte. Ich významný nárast sa pozoruje v prípadoch zhoršenej vaskulárnej permeability u pacientov s pneumóniou, v prípadoch deštrukcie pľúcneho alebo bronchiálneho tkaniva, preťaženia pľúcneho obehu, pľúcneho infarktu atď. Erytrocyty sa nachádzajú vo veľkom množstve v spúte v prípadoch hemoptyzy akéhokoľvek pôvodu.

Elastické vlákna. Treba spomenúť aj ďalší prvok spúta - plastické vlákna, ktoré sa objavujú v spúte počas deštrukcie pľúcneho tkaniva (pľúcny absces, tuberkulóza, rozpadajúca sa rakovina pľúc atď.). Elastické vlákna sa v spúte vyskytujú vo forme tenkých, dvojito kontúrovaných, skrútených nití s dichotomickým delením na koncoch. Výskyt elastických vlákien v spúte u pacientov s ťažkou pneumóniou naznačuje výskyt jednej z komplikácií ochorenia - tvorbu abscesu v pľúcnom tkanive. V niektorých prípadoch, keď sa vytvorí pľúcny absces, je možné elastické vlákna v spúte zistiť ešte o niečo skôr ako zodpovedajúce rádiografické zmeny.

V prípadoch lobárnej pneumónie, tuberkulózy, aktinomykózy a fibrinóznej bronchitídy sa v prípravkoch spúta často nachádzajú tenké fibrínové vlákna.

Príznaky aktívneho zápalového procesu v pľúcach sú:

1. povaha spúta (mukopurulentný alebo hnisavý);
2. zvýšenie počtu neutrofilov v spúte, vrátane ich degeneratívnych foriem;
3. zvýšenie počtu alveolárnych makrofágov (z jednotlivých zhlukov niekoľkých buniek v zornom poli a ďalších);

Výskyt elastických vlákien v spúte naznačuje deštrukciu pľúcneho tkaniva a vznik pľúcneho abscesu.

Konečné závery o prítomnosti a stupni aktivity zápalu a deštrukcie pľúcneho tkaniva sa tvoria iba v porovnaní s klinickým obrazom ochorenia a výsledkami iných laboratórnych a inštrumentálnych výskumných metód.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ]

Mikrobiálna flóra

Mikroskopia náterov spúta zafarbených podľa Grama a štúdium mikrobiálnej flóry (bakterioskopia) u niektorých pacientov s pneumóniou nám umožňuje približne určiť najpravdepodobnejšieho pôvodcu pľúcnej infekcie. Táto jednoduchá metóda expresnej diagnostiky pôvodcu nie je dostatočne presná a mala by sa používať iba v kombinácii s inými (mikrobiologickými, imunologickými) metódami vyšetrenia spúta. Imerzná mikroskopia zafarbených náterov spúta je niekedy veľmi užitočná pre núdzový výber a predpísanie adekvátnej antibakteriálnej liečby. Treba však mať na pamäti možnosť očkovania bronchiálneho obsahu mikroflórou horných dýchacích ciest a ústnej dutiny, najmä ak sa spúto odoberie nesprávne.

Preto sa spútum považuje za vhodné na ďalšie vyšetrenie (bakterioskopiu a mikrobiologické vyšetrenie) iba vtedy, ak spĺňa nasledujúce podmienky:

• Gramovo farbenie odhaľuje veľký počet neutrofilov v spúte (viac ako 25 v zornom poli pri malom zväčšení mikroskopu);
• počet epitelových buniek, charakteristickejších pre obsah orofaryngu, nepresahuje 10;
• Prípravok obsahuje prevahu mikroorganizmov jedného morfologického typu.

Pri farbení náteru spúta podľa Grama je niekedy možné celkom dobre identifikovať grampozitívne pneumokoky, streptokoky, stafylokoky a skupinu gramnegatívnych baktérií - Klebsiella, Pfeifferov bacil, Escherichia coli atď. V tomto prípade grampozitívne baktérie získavajú modrú farbu a gramnegatívne baktérie - červenú.

Bakteriálne patogény pneumónie

Grampozitívne	Gramnegatívne
Pneumokoky Streptococcus pneumoniae. Streptokoky Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans. Stafylokoky: Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus.	Klebsiella pneumoniae Haemophilus influenzae (Pfeifferov bacil) Haemophilius influenzae Pseudomonas aeruginosa Legionella pneumofília Escherichia coli

Predbežná bakterioskopia spúta je najjednoduchšou metódou overenia pôvodcu zápalu pľúc a má určitý význam pre výber optimálnej antibiotickej liečby. Napríklad, ak sa v Gramom zafarbených náteroch zistia grampozitívne diplokoky (pneumokoky) alebo stafylokoky, namiesto širokospektrálnych antibiotík, ktoré zvyšujú riziko selekcie a šírenia mikroorganizmov rezistentných na antibiotiká, môže byť predpísaná cielená liečba účinná proti pneumokokom alebo stafylokokom. V iných prípadoch môže detekcia gramnegatívnej flóry prevládajúcej v náteroch naznačovať, že pôvodcom zápalu pľúc sú gramnegatívne enterobaktérie (Klebsiella, Escherichia coli atď.), čo si vyžaduje predpísanie vhodnej cielenej liečby.

Je pravda, že približný záver o pravdepodobnom pôvodcovi pľúcnej infekcie možno urobiť mikroskopicky iba na základe významného zvýšenia baktérií v spúte, pri koncentrácii 10 ⁶ - 10 ⁷ mc/ml a viac (LL Višňakova). Nízke koncentrácie mikroorganizmov (< 10 ³ mc/ml) sú charakteristické pre sprievodnú mikroflóru. Ak koncentrácia mikrobiálnych teliesok kolíše od 10 ⁴ do 10 ⁶ mc/ml, nevylučuje to etiologickú úlohu tohto mikroorganizmu pri vzniku pľúcnej infekcie, ale ani to nedokazuje.

Treba tiež pamätať na to, že „atypické“ intracelulárne patogény (mykoplazma, legionella, chlamýdie, rickettsia) sa nefarbia podľa Grama. V týchto prípadoch môže vzniknúť podozrenie na prítomnosť „atypickej“ infekcie, ak sa v náteroch spúta zistí disociácia medzi veľkým počtom neutrofilov a extrémne malým počtom mikrobiálnych buniek.

Bohužiaľ, bakterioskopická metóda má vo všeobecnosti pomerne nízku citlivosť a špecificitu. Neprediktívna hodnota aj pri dobre vizualizovaných pneumokokoch sotva dosahuje 50 %. To znamená, že v polovici prípadov metóda poskytuje falošne pozitívne výsledky. Je to spôsobené niekoľkými dôvodmi, jedným z nich je, že približne 1/3 pacientov už pred hospitalizáciou dostalo antibiotiká, čo výrazne znižuje účinnosť bakterioskopie spúta. Okrem toho, aj v prípade pozitívnych výsledkov testov naznačujúcich pomerne vysokú koncentráciu „typických“ bakteriálnych patogénov v nátere (napr. pneumokoky), nemožno úplne vylúčiť prítomnosť koinfekcie s „atypickými“ intracelulárnymi patogénmi (mykoplazma, chlamýdie, legionella).

Metóda bakterioskopie náterov spúta zafarbených Gramom v niektorých prípadoch pomáha overiť pôvodcu pneumónie, hoci vo všeobecnosti má veľmi nízku prediktívnu hodnotu. „Atypické“ intracelulárne patogény (mykoplazma, legionella, chlamýdie, rickettsia) sa bakterioskopiou vôbec neoverujú, pretože sa Gramom nefarbia.

Za zmienku stojí možnosť mikroskopickej diagnostiky u pacientov s pneumóniou spôsobenou plesňovou infekciou pľúc. Najrelevantnejšie pre pacientov dlhodobo liečených širokospektrálnymi antibiotikami je detekcia Candida albicans vo forme kvasinkových buniek a rozvetveného mycélia počas mikroskopie natívnych alebo zafarbených preparátov spúta. Tieto naznačujú zmenu mikroflóry tracheobronchiálneho obsahu, ku ktorej dochádza pod vplyvom antibiotickej liečby, čo si vyžaduje významnú korekciu terapie.

V niektorých prípadoch je potrebné u pacientov s pneumóniou rozlíšiť existujúce poškodenie pľúc od tuberkulózy. Na tento účel sa používa farbenie spúta podľa Ziehl-Neelsena, ktoré v niektorých prípadoch umožňuje identifikovať mykobaktérie tuberkulózy, hoci negatívny výsledok takejto štúdie neznamená, že pacient nemá tuberkulózu. Pri farbení spúta podľa Ziehl-Neelsena sa mykobaktérie tuberkulózy zafarbia na červeno a všetky ostatné prvky spúta sa zafarbia na modro. Mykobaktérie tuberkulózy majú vzhľad tenkých, rovných alebo mierne zakrivených tyčiniek rôznej dĺžky s jednotlivými zhrubnutiami. V prípravku sa nachádzajú v skupinách alebo jednotlivo. Detekcia aj jednotlivých mykobaktérií tuberkulózy v prípravku má diagnostickú hodnotu.

Na zvýšenie účinnosti mikroskopickej detekcie mykobaktérií tuberkulózy sa používa množstvo ďalších metód. Najbežnejšia z nich je tzv. flotačná metóda, pri ktorej sa homogenizované spúto pretrepáva s toluénom, xylénom alebo benzínom, ktorého kvapky, vyplávajúc nahor, zachytávajú mykobaktérie. Po usadení spúta sa vrchná vrstva nanesie pipetou na podložné sklíčko. Preparát sa potom fixuje a farbí podľa Ziehl-Neelsena. Existujú aj iné metódy akumulácie (elektroforéza) a mikroskopie baktérií tuberkulózy (luminiscenčná mikroskopia).

Mikroskopické vyšetrenie (analýza) spúta umožňuje detekciu hlienu, bunkových prvkov, vláknitých a kryštalických útvarov, húb, baktérií a parazitov.

Bunky

• Alveolárne makrofágy sú bunky retikulohistiocytového pôvodu. Veľké množstvo makrofágov v spúte sa zisťuje pri chronických procesoch a v štádiu riešenia akútnych procesov v bronchopulmonálnom systéme. Alveolárne makrofágy obsahujúce hemosiderín („bunky srdcových defektov“) sa zisťujú pri pľúcnom infarkte, krvácaní a kongescii v pľúcnom obehu. Makrofágy s lipidovými kvapkami sú znakom obštrukčného procesu v prieduškách a bronchioloch.
• Xantomatózne bunky (tukové makrofágy) sa nachádzajú v abscesoch, aktinomykóze a echinokokóze pľúc.
• Stĺpcovité riasinkové epitelové bunky sú bunky sliznice hrtana, priedušnice a priedušiek; nachádzajú sa pri bronchitíde, tracheitíde, bronchiálnej astme a malígnych nádoroch pľúc.
• Plochý epitel sa zistí, keď sliny vniknú do spúta a nemá žiadnu diagnostickú hodnotu.
• Leukocyty sú prítomné v akomkoľvek spúte v rôznych množstvách. Veľké množstvo neutrofilov sa nachádza v mukopurulentnom a hnisavom spúte. Spúto je bohaté na eozinofily v prípadoch bronchiálnej astmy, eozinofilnej pneumónie, helmintických pľúcnych lézií a pľúcneho infarktu. Eozinofily sa môžu objaviť v spúte v prípadoch tuberkulózy a rakoviny pľúc. Lymfocyty sa nachádzajú vo veľkom množstve v prípadoch čierneho kašľa a menej často pri tuberkulóze.
• Červené krvinky. Detekcia jednotlivých červených krviniek v spúte nemá diagnostickú hodnotu. Ak je v spúte prítomná čerstvá krv, zistia sa nezmenené červené krvinky, ale ak sa so spútom uvoľní krv, ktorá sa dlhodobo nachádzala v dýchacích cestách, zistia sa vylúhované červené krvinky.
• Zhubné nádorové bunky sa nachádzajú v malígnych neoplazmoch.

Vlákna

• Elastické vlákna sa objavujú počas rozpadu pľúcneho tkaniva, ktorý je sprevádzaný deštrukciou epitelovej vrstvy a uvoľnením elastických vlákien; nachádzajú sa pri tuberkulóze, abscesoch, echinokokóze a novotvaroch v pľúcach.
• Vlákna v tvare koralov sa nachádzajú pri chronických ochoreniach pľúc, ako je kavernózna tuberkulóza.
• Kalcifikované elastické vlákna sú elastické vlákna impregnované vápenatými soľami. Ich detekcia v spúte je charakteristická pre rozpad tuberkulóznej petrifikácie.

Špirály, kryštály

• Kurshmanove špirály sa tvoria v prípade spastického stavu priedušiek a prítomnosti hlienu v nich. Počas kašľového tlaku sa viskózny hlien vrhá do lúmenu väčšieho priedušníka a skrúti sa do špirály. Kurshmanove špirály sa objavujú pri bronchiálnej astme, bronchitíde, pľúcnych nádoroch, ktoré stláčajú priedušky.
• Charcotove-Leydenove kryštály sú produkty rozpadu eozinofilov. Zvyčajne sa vyskytujú v spúte obsahujúcom eozinofily; sú charakteristické pre bronchiálnu astmu, alergické stavy, eozinofilné infiltráty v pľúcach a pľúcnu motolicu.
• Kryštály cholesterolu sa objavujú v abscesoch, pľúcnej echinokokóze a novotvaroch v pľúcach.
• Kryštály hematoidínu sú charakteristické pre pľúcny absces a gangrénu.
• Drúzy aktinomycét sa nachádzajú pri pľúcnej aktinomykóze.
• Prvky echinokoka sa objavujú pri pľúcnej echinokokóze.
• Dietrichove zátky sú žltkastosivé hrudky s nepríjemným zápachom. Pozostávajú z detritu, baktérií, mastných kyselín a tukových kvapôčok. Sú charakteristické pre pľúcny absces a bronchiektáziu.
• Ehrlichova tetradáta pozostáva zo štyroch prvkov: kalcifikovaného detritu, kalcifikovaných elastických vlákien, kryštálov cholesterolu a mykobaktérií tuberkulózy. Vzniká počas rozpadu kalcifikovaného primárneho tuberkulózneho ložiska.

Mycélium a pučiace hubové bunky sa objavujú počas plesňových infekcií bronchopulmonálneho systému.

Baktérie Pneumocystis sa objavujú pri pneumocystis pneumoniae.

Plesňové sféruly sa detegujú pri kokcidioidomykóze pľúc.

Larvy askariózy sa detegujú pri askarióze.

Larvy úhorovcov sa nachádzajú pri strongyloidóze.

Vajíčka pľúcnej motolice sa detegujú počas paragonimiázy.

Prvky nachádzajúce sa v spúte pri bronchiálnej astme. Pri bronchiálnej astme sa zvyčajne vylučuje malé množstvo hlienového, viskózneho spúta. Makroskopicky možno vidieť Curschmannove špirály. Mikroskopické vyšetrenie typicky odhalí eozinofily, valcový epitel a Charcotove-Leydenove kryštály.