Konfokálna mikroskopia rohovky

Konfokálna mikroskopia rohovky je jednou z moderných výskumných metód, ktorá umožňuje intravitálne monitorovanie rohovky s vizualizáciou tkaniva na bunkovej a mikroštrukturálnej úrovni.

Táto metóda vďaka originálnemu dizajnu mikroskopu a jeho vysokej rozlišovacej schopnosti umožňuje vizualizáciu živého tkaniva rohovky, meranie hrúbky každej z jeho vrstiev a posúdenie stupňa morfologických porúch.

Účel konfokálnej mikroskopie rohovky

Charakterizovať morfologické zmeny rohovky, ktoré sa vyskytujú pri rôznych zápalových a dystrofických ochoreniach, ako aj v dôsledku chirurgických zákrokov a vystavenia CL.

Údaje z morfologického vyšetrenia sú potrebné na posúdenie závažnosti patologického procesu, účinnosti liečby a na určenie taktiky liečby pacienta.

Indikácie postupu

• Zápalové ochorenia rohovky ( keratitída ).
• Dystrofické ochorenia rohovky ( keratokonus, Fuchsova dystrofia atď.).
• Syndróm suchého oka.
• Stavy po chirurgických zákrokoch na rohovke (penetračná transplantácia rohovky, keratorefrakčné operácie).
• Stavy spojené s nosením kontaktných šošoviek.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Príprava

Toto vyšetrenie je možné vykonať bez použitia anestetík. Na objektív konfokálneho mikroskopu sa umiestni kvapka imerznej kvapaliny. Tým sa eliminuje priamy kontakt šošovky s rohovkou a minimalizuje sa riziko poškodenia epitelu.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Technika konfokálna mikroskopia rohovky

Štúdia sa vykonáva pomocou konfokálneho mikroskopu ConfoScan 4 (Nider) s 500-násobným zväčšením. Prístroj umožňuje vyšetrenie rohovky v celej jej hrúbke.

Veľkosť skúmanej oblasti je 440×330 μm, hrúbka skenovacej vrstvy je 5 μm. Šošovka s kvapkou gélu sa priblíži k rohovke, kým sa jej nedotkne, a je nainštalovaná tak, aby hrúbka vrstvy imerznej kvapaliny bola 2 mm. Konštrukcia zariadenia umožňuje vyšetrenie rohovky v centrálnej zóne a jej paracentrálnych oblastiach.

Kontraindikácie postupu

Relatívnou kontraindikáciou je silné podráždenie očí v dôsledku akútneho zápalového procesu.

[ 10 ], [ 11 ]

Normálny výkon

Normálny morfologický obraz rohovky

Predný epitel sa skladá z 5-6 vrstiev buniek. Priemerná hrúbka celého epitelu je približne 50 µm. Podľa morfologickej štruktúry sa rozlišujú nasledujúce vrstvy (zvnútra smerom von): bazálne, šilovité bunky a povrchové.

• Najvnútornejšia (bazálna) vrstva je reprezentovaná malými, hustými, valcovitými bunkami bez viditeľného jadra. Hranice bazálnych buniek sú jasné a svetlé.
• Stredná vrstva pozostáva z 2-3 vrstiev ostnatých (krídlených) buniek s hlbokými invagináciami, do ktorých sú vnorené výrastky susedných buniek. Mikroskopicky sú hranice buniek pomerne jasne rozlíšiteľné a jadrá nemusia byť definované alebo môžu byť nejasné.
• Povrchová vrstva epitelu je reprezentovaná jednou alebo dvoma vrstvami polygonálnych buniek s jasnými hranicami a homogénnou hustotou. Jadrá sú zvyčajne jasnejšie ako cytoplazma, v ktorej možno rozlíšiť aj perinukleárny tmavý kruh.

Medzi bunkami povrchovej vrstvy sa rozlišujú tmavé a svetlé bunky. Zvýšená odrazivosť epitelových buniek naznačuje zníženie ich metabolizmu a ich začínajúcu deskvamáciu.

Bowmanova membrána je priehľadná štruktúra, ktorá neodráža svetlo, takže ju bežne nie je možné vizualizovať konfokálnou mikroskopiou.

Subbazálny nervový plexus sa nachádza pod Bowmanovou membránou. Normálne sa nervové vlákna javia ako svetlé pruhy prebiehajúce rovnobežne na tmavom pozadí a navzájom sa dotýkajúce. Odrazivosť (reflexibilita) môže byť pozdĺž vlákna nerovnomerná.

Stroma rohovky zaberá 80 až 90 % hrúbky rohovky a pozostáva z bunkových a extracelulárnych zložiek. Hlavnými bunkovými prvkami strómy sú keratocyty; tvoria približne 5 % objemu.

Typický mikroskopický obraz strómy zahŕňa niekoľko jasných nepravidelných oválnych teliesok (jadrá keratocytov), ktoré ležia v hrúbke priehľadnej tmavosivej alebo čiernej matrice. Za normálnych okolností je vizualizácia extracelulárnych štruktúr kvôli ich priehľadnosti nemožná. Strómu možno podmienečne rozdeliť na podvrstvy: prednú (nachádza sa priamo pod Bowmanovou membránou a tvorí 10 % hrúbky strómy), predo-strednú, strednú a zadnú.

Priemerná hustota keratocytov je vyššia v prednej stróme a postupne klesá smerom k zadným vrstvám. Hustota predných stromálnych buniek je takmer dvakrát vyššia ako hustota zadných stromálnych buniek (ak sa hustota predných stromálnych buniek berie ako 100 %, potom bude hustota zadných stromálnych buniek približne 53,7 %). V prednej stróme majú jadrá keratocytov zaoblený fazuľovitý tvar, zatiaľ čo v zadnej stróme sú oválne a predĺženejšie.

Jadrá keratocytov sa môžu líšiť jasom. Rôzna schopnosť odrážať svetlo závisí od ich metabolického stavu. Jasnejšie bunky sa považujú za aktivované keratocyty („stresové“ bunky), ktorých aktivita je zameraná na udržanie vnútornej homeostázy rohovky. V normálnom stave a zornom poli sa nachádzajú jednotlivé aktivované bunky.

Nervové vlákna v prednej stróme rohovky sa vizualizujú ako svetlé homogénne pásy, ktoré často tvoria rozdvojenia.

Descemetova membrána je normálne priehľadná a nie je viditeľná konfokálnou mikroskopiou.

Zadný epitel je monovrstva šesťuholníkových alebo polygonálnych plochých buniek s rovnomerne svetlým povrchom na pozadí jasných tmavých medzibunkových hraníc.

Zariadenie má schopnosť manuálne alebo automaticky vypočítať hustotu buniek, ich plochu a koeficient variability.

Patologické zmeny v štruktúre rohovky

Keratokonus sa vyznačuje významnými zmenami v prednom epiteli a stróme rohovky.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ], [ 19 ], [ 20 ]